Abstract
Vi presenterer resultatene av en global studie av feilregulert miRNAs i parvise prøver av normal slimhinne og svulst fra åtte pasienter med tykktarmskreft. Selv om det er eksisterende data av miRNA bidrag til tykktarms tumorigenesis, disse studiene er vanligvis små til middels store studier av cellelinjer eller ikke-sammenkoblede tumorprøver. Denne studien er så vidt vi vet unikt i to henseender. For det første er de normale og tumor tilstøtende vevsprøver sammenkoblet, og dermed tar hensyn til basislinjeforskjeller mellom individer ved testing for differensial ekspresjon. For det andre bruker vi high-throughput sekvensering, og dermed gjør en omfattende undersøkelse av alle mirnas uttrykt i vev. Vi bruker Illumina sekvenseringsteknologi til å utføre sekvensering og to ulike verktøy for å statistisk test for forskjeller i lese tellinger per gen mellom prøver: EDGER når du bruker paret informasjon og DESeq når ignorerer denne informasjonen, dvs. behandling av kreft og normale prøver som uavhengige grupper. Vi identifiserer 37 mirnas som er betydelig feilregulert i både statistiske tilnærminger, 19 nedregulert og 18 oppregulert. Noen av disse miRNAs er tidligere utgitt som potensielle regulatorer i kolorektal adenokarsinomer som MIR-1, MIR-96 og MIR-145. Vår omfattende undersøkelse av forskjellig uttrykt mirnas bekrefter dermed noen eksisterende funn. Vi har også oppdaget 16 feilregulert mirnas, som så vidt vi vet ikke tidligere har vært assosiert med kolorektal kreft: Følgende betydelig nedregulert MIR-490-3p, -628-3p /-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p, -3656 og oppregulert MIR-105, -549, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p, -4326. Selv om studien er foreløpig med bare åtte pasienter inkludert, mener vi resultatene legge til i dag kunnskap om miRNA feilregulering i kolorektal kreftutvikling. Som sådan resultatene ville tjene som en robust treningssett for validering av potensielle biomarkører i en større kohortstudie. Til slutt, vi også presentere data som støtter hypotesen om at det er forskjeller i miRNA uttrykket mellom adenokarsinomer og nevroendokrine svulster i tykktarmen
Citation. Hamfjord J, Stangeland AM, Hughes T, Skrede ML, Tveit KM, Ikdahl T , et al. (2012) ulike uttrykk av miRNAs i tykktarmskreft: Sammenligning av parvise svulstvev og tilknytning normal slimhinne Bruke høy gjennomstrømming sekvensering. PLoS ONE 7 (4): e34150. doi: 10,1371 /journal.pone.0034150
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 06.09.2011; Godkjent: 23 februar 2012; Publisert: 17 april 2012
Copyright: © 2012 Hamfjord et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Ekstern finansiering mottatt fra «Ivar, Ragna og Morten Holes Legat til Fremme av kreftforskningen i Norge» (Ivar, Ragna og Morten Holes «Foundation for å tjene kreftforskning i Norge). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de hyppigst forekommende kreftformer over hele verden [1]. Prognosen avhenger av stadium ved diagnosetidspunktet. Det er høy fokus på funn og validering av tidlig deteksjon markører samt på prediktive og prognostiske faktorer som vurderes av Asghar
et al
. [2]. Den molekylære genesis av CRC er blant de best beskrives av alle menneskelige kreft. Den Vogel modell [3] har gjennom årene blitt endret og utvidet, som eksemplifisert ved Slabý
et al
. [4].
microRNAs (Mirs) er små ikke-kodende RNA-molekyler 18-25 nukleotider i lengde, først oppdaget i begynnelsen av 1990 i
C. elegans product: [5]. De opprettholde homeostase ved å endre genekspresjon i forskjellige celleprosesser som differensiering, proliferasjon, apoptose overlevelse og [6]. Det er anslått at mer enn 10% av all protein-kodende humane gener kan reguleres ved disse mekanismene [7]. Det nyeste nummeret av menneskelige Mirs registrert i miRBase stiger tusen [8], og den økende bruken av high-throughput sekvense kjører videre funn. Studier har også vist at Mirs kan dysregulerte i forskjellige humane kreftformer, og følgelig fungere som tumor-suppressorer eller onkogener [9], [10]. Disse molekylene er interessante fordi de kan være potensielle biomarkører for diagnose eller prognose og fungere som potensielle mål i kreft spesifikk terapi som vurderes av Cho
et al
. [11], [12]. Det ultimate målet ville bli personlig medisin med genotype-fenotype kreft nettverk som veikart til kliniske avgjørelser [13].
Mange studier har fokusert på Mir expression profilering i tykk- og endetarmskreft. De fleste av disse studiene har analysert et mindre antall Mirs ved hjelp av sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR) eller hybridisering basert teknologi, dels fra cellelinjer eller ikke-parede pasientens vev [14], [15], [16], [17 ], [18]. Bare noen få studier har mer globalt sekvensert Mirs i større skala for uttrykket profilen, som studie om melanom [19] og tykktarms [20] microRNAome. Den sistnevnte studien var unik i sitt slag, og presenterte et sett med nye antatte Mirs ved hjelp av en eksperimentell tilnærming som heter Mirage. Men som denne studien går tilbake flere år, bare en undergruppe av modne Mirs kjent i dag var aktivt undersøkt.
Globalt uttrykk for Mirs har tradisjonelt blitt vurdert ved hybridisering basert array-teknologi. Disse matriser er basert på sekvensspesifikk hybridisering etter merking med en fluorescerende fargestoff. Fluorescensintensitet blir registrert og gjenspeiler ekspresjonen av et gitt gen. Ved å bruke flere fargestoffer, kan forskjellen i fluorescens kan benyttes som en indeks for genekspresjon. High-throughput sekvensering, på den annen side, benytter prøve transkripter som utgangs mal. Direkte sekvensering ble deretter utført med en serie av reaksjoner under anvendelse fluoroforen terminator nukleotider. Sekvens lyder blir deretter kartlagt tilbake til referanse-genomet eller en database av transkripter og antallet sekvens lyder kartlegging tilbake til en spesifikk transkripsjon er et mål for genekspresjon. I det generelle tilfelle av mRNA, må denne teller for å bli normalisert til lengden av transkriptet og det totale antall leser generert for prøven. I tilfelle av MIR, er normaliseringen for transkripsjon lengden ikke nødvendig som leser dekker den fulle lengde av transkriptet. Differensialuttrykk blir så målt ved forskjellen i normaliserte tellinger for en gitt gen. En fersk publikasjon sammen differensial genuttrykk i
D. pseudoobscura
ved bruk av array-teknologi og high-throughput sekvensering. De fleste av ekspresjonsnivåene er lik mellom de metoder med en sammenlignbar ytelse [21]. En tilsvarende studie på
S. cerevisiae
har vist at fremgangsmåtene er enige om ganske godt for gener med middels nivåer av ekspresjon, men sammenhengen er meget lav for gener med enten lave eller høye ekspresjonsnivåer. Dette er delvis på grunn av den sterkt økte dynamiske området for kvantifisering av genekspresjon levert av high-throughput-sekvenseringsmetode [22]. Høy throughput sekvensering er videre ansett overlegen når du arbeider med strukturen og dynamikken i transkriptom. Eksempler på dette er uttrykk for ukjente mål sekvenser, RNA redigering arrangementer og andre RNA sekvens varianter som polymorfismer [21], [22], [23].
Siden disse funksjonene i high-throughput sekvensering tyder på at det er en utmerket metode for global kartlegging av små RNA, inkluderes vi åtte pasienter med kolorektal kreft som gjennomgår kirurgisk fjerning av tykktarmen for å studere tumor-spesifikke forandringer i mir ekspresjon ved hjelp av Illumina high-throughput sekvenseringsteknologi. Vev av normal slimhinne og svulst ble oppsamlet fra kirurgiske prøver for alle pasienter, og dermed gir et unikt sett av parede prøver. Vår analyse av sekvens datasett vi produsert fra disse prøvene gjør oss i stand til å identifisere Mirs som ikke tidligere har vært assosiert med kolorektal adenokarsinomer. Vi har også identifisert forskjeller i Mir uttrykk mellom adenokarsinomer og en nevroendokrine svulster i tykktarmen. Disse resultatene legge til dagens kunnskap om Mir feilregulering i kolorektal kreftutvikling.
Resultater
Åtte pasienter ble tilfeldig valgt i henhold til kjønn spesifikasjoner (kun menn) fra en kolorektal kreft kohort. Total RNA fra svulstvev og tilstøtende normal slimhinne ble hentet. I foreløpig analyse av differensiell ekspresjon mellom tumor og tilstøtende normal slimhinne, ett par viste et uttrykk mønster forskjellig fra resten av parene. Histopatologi ble anmeldt av en patolog (tabell 1), og det var tydelig at en pasient ble feilklassifisert og næret en atypisk nevroendokrine svulster (NET), mens resten var adenokarsinomer. Alle ytterligere statistiske analyser behandlet pasienten med NET som en egen sak fra de øvrige pasientene. Prosentene av tumorceller og stromale komponenter ble også estimert i hematoxylin og eosin fargete snitt fra primærtumor, viser at syv av åtte prøver næret mer enn 60% tumorceller (tabell 1).
16 prøvene ble vellykket sekvensert ved hjelp av Illumina Genome Analyzer II (Illumina, CA, USA) og behandlet ved hjelp miRanalyzer [24] med et gjennomsnitt på 562 modne Mirs tilordnet miRBase per sekvense eksperiment når tillater en mismatch nukleotid (figur 1B). Omtrent 80% av sekvensering leser kartlagt å modne menneskelige Mirs i miRBase (slipp 16) i sytten atten sekvense går, de rester leser mest kart til andre deler av transkriptom. I den siste prøven (normalt vev N7) var det en mye lavere andel av lesninger som kartet til miRBase (37,2% av den totale leser) (figur 1A). Dette kan være på grunn av tekniske problemer under prøveopparbeidelse. Videre ble et par hundre antatt romanen Mir sekvenser og gen loci i referanse genomet (HSA hg18) spådde fra sekvense går. Disse antatte sekvenser utgjør en liten brøkdel av den totale lese count (data ikke vist).
Panel A med prosentandel av sekvensering leser kartlagt å modne Mirs (svart) av den totale leser per eksperiment. Panel B med antall modne Mirs identifisert per sekvense eksperiment. Det totale antall modne menneskelige Mirs i miRBase frigjøre 16 (n = 1212) er inkludert som referanse.
Differensial uttrykk (DE) identifiserte Mirs fra miRBase ble beregnet ved hjelp av to bioinformatiske verktøy, DESeq [25 ] og edger [26]. Edger implementerer funksjonalitet for å utføre både sammen og ikke-sammenkoblede tester (paret informasjonen blir ignorert, og normalt og tumorprøver blir behandlet som selvstendige grupper), mens DESeq ikke kan utføre sammenkoblede tester, men drar nytte av andre statistiske forbedringer i forhold til edger. Behandling av normale og tumorprøver som to uavhengige grupper er teoretisk spådd å være mer konservativ test siden, i motsetning til paret test, betyr det ikke høyde for baseline forskjeller mellom pasienter. Ved å bruke begge metodene, får vi to sett med vesentlig forskjellig uttrykt Mirs. Skjæringspunktet mellom disse to settene er et meget konservativt anslag av vesentlig feilregulert Mirs. I tillegg var vi i stand til å observere i hvilken grad den ikke-paret testing er mer konservativ enn den sammenkoblede. Først gangers skifte av kjente Mirs ble analysert mellom gruppene av adenocarcinoma (n = 7) og normal slimhinne (n = 8), deretter mellom det nevroendokrine tilfellet (n = 1) og normal slimhinne (n = 8) ved bruk av DESeq (figurene 2A og 2C). Når man ser på de adenokarsinomer som en gruppe, og ved hjelp av Benjamini og Hochberg justering [27] for multippel testing (FDR 0,1), totalt 52 Mirs var betydelig feilregulert i forhold til den av normal slimhinne: 28 ble nedregulert og 24 oppregulert (tabell S1). Neuroendocrine tilfellet, men viste et totalt 38 Mirs betydelig feilregulert i forhold til normal slimhinne gruppe, alt oppregulert (tabell S2). Interessant er det bare seks Mirs representert i begge histopatologiske grupper: MIR-7, -96, -204, -1269, -1827 og -3177. I denne analysen er det derfor totalt 46 og 32 Mirs som synes noe spesifikt for adenokarsinom og nevroendokrin histopatologi, henholdsvis.
Skjematisk illustrasjon av statistisk tilnærming. Paneler A og C viser tilnærming ved hjelp av ikke-paret statistikk og DESeq verktøyet. Panel B viser tilnærming ved hjelp av sammenkoblede statistikk og edger verktøyet. Se teksten for nærmere informasjon.
Siden vi undersøkte paret prøver av svulsten og normal slimhinne vev fra de samme pasientene, vi utførte også en test av de sju adenokarsinom tilfeller ved hjelp av sammenkoblede statistikk i EDGER (figur 2B ). Totalt 118 Mirs ble identifisert som betydelig dysregulerte under de samme vilkår som for den ikke-paret analyse (tabell S3). Av disse var det 81 Mirs som ikke ble identifisert i den ikke-paret analyse og en felles overlapping av 37 for begge tilnærminger. Dette bekrefter den spådommen at den ikke-paret analyse er mer konservativ test, selv om det er 15 Mirs identifisert som dysregulerte i DESeq ikke-paret test som ikke ble identifisert av paret analyse i EDGER (figur 3).
Det er klart at det er 37 felles Mirs funnet å være betydelig dysregulerte ved bruk av begge statistiske metoder (tabell 2). Det er tilnærmet lik fordeling mellom ned- og opp-regulerte Mirs. Det er både ydmyk (ca 10-10 000 absolutte leser) og høyt (ca. 10 000-5 000 000 absolutte leser) uttrykt Mirs representert i felles MIR undergruppe, to bemerkelsesverdige eksempler er MIR-7 og MIR-1, henholdsvis. Når du ser på uttrykket nivåer globalt i form av alle identifiserte Mirs, det er en global oppregulering av uttrykk i svulsten sammenlignet med normal slimhinne (regnet fra den sammenkoblede analyse av adenokarsinomer).
The high-throughput sekvensering ble eksperimentelt validert ved hjelp av en kvantitativ polymerase chain reaction for utvalgte Mirs og vevsprøver (Figur S1). Våre resultater er i tråd med tidligere valideringsresultater inter-plattform [28]:. Resultatene mellom de ulike metodene korrelerer, men denne sammenhengen er langt fra perfekt
Diskusjoner
Flere studier har funnet at Mirs er globalt nedregulert i ulike kreftformer, med en korrelasjon mellom graden av differensiering og global uttrykk nivåer av Mirs. Selv om det har vært antydet at global nedregule fremmer celle transformasjon og tumorigenesis [10], [15], [29], et stort uttrykk profilering studie av solide svulster ved Volinia
et al
. observerte ikke nedregulering av Mirs som tidligere rapportert [30]. Vår studie tyder på at global nedregulering er ikke tilfelle for kolorektal adenokarsinomer i vår årsklasse, selv om et betydelig antall enkelt Mirs er nedregulert i adenokarsinomer i forhold til de normale prøver.
Ifølge miRecords database [31], har MIR-1 117 validerte mål og kan potensielt samhandle med flere viktige gener i kreftutvikling av tykk- og endetarmskreft. I en studie fra 2009, ble Mir-1 og MIR-551b (blant annet) funnet å ha lavere uttrykk i embryonale stamceller i forhold til differensierte celler og i tykk- og endetarmskreft i forhold til normal slimhinne [17]. Dette er i tråd med våre funn av nedregulert MIR-1 og MIR-551b i kolorektal adenokarsinomer. Nedregulert MIR-1 er også observert i det nevroendokrine tilfelle. MIR-en har videre blitt rapportert å være nedregulert og foreslo en tumor-undertrykkende funksjon ved å målrette den transgelin 2-genet (
TAGLN2
) i blærekreft [32] og hode og nakke plateepitelkarsinom [33] .
MIR-145 er nedregulert i adenocarcenomas av vår studie, og dette MIR har ofte blitt assosiert med nedregulering i kolorektal kreft [16], [34], [35], [36] . Det er antatt å ha en tumor-suppressor rolle, blant annet ved å målrette insulinreseptoren underlaget 1 (ISR-1) og type I insulin-like growth factor receptor (IGF-IR). Tap av MIR-145 hemming øker anti-apoptotiske signaler i cellen og fremme cellevekst [37], [38].
I en studie fra 2010 ble MIR-195 funnet å være nedregulert i 81 kolorektal kreft vev sammenlignet med matchet normal slimhinne, og dette er i overensstemmelse med våre resultater for adenokarsinomer. Dette MIR antas å målrette BCL-2 og dermed utøve sin pro-apoptotisk funksjon når fysiologisk regulert [39]. En annen studie viste at redusert uttrykk av MIR-195 forekom oftere hos pasienter med lymfeknutemetastase og avansert tumor stadium. Lave nivåer var også dårlig prediktor for total overlevelse [40].
I to mindre studier, en av tykktarmskreft uten lymfeknutemetastase [41] og den andre av magekreft [31], MIR-378 var funnet å bli nedregulert i tumorer sammenliknet med normalt vev tilstøtende sett i vårt studium. Det har imidlertid blitt rapportert at MIR-378 fremmer celle overlevelse og tumorvekst ved å målrette Sufu og Fus-1 [42] og det kan også spille en rolle med modifiserende andre Mirs i angiogenese [43]. Det er ytterligere bevis på at Myc /MIR-378 /TOB2 /cyclin D1 funksjonell modul regulerer onkogene transformasjon [44].
MIR-383 er også nedregulert i adenokarsinomer i forhold til normalt vev. Så vidt vi vet dette ikke har blitt rapportert for kolorektal adenokarsinomer, men har blitt observert i en liten studie på magekreft [45]. Det er godt samsvar mellom våre funn av nedregulert Mirs i kolorektal adenokarsinomer og tidligere publiserte rapporter. I tillegg til de Mirs beskrevet ovenfor, identifiserte vi et betydelig antall andre jevnt nedregulert Mirs, mindre nevnt i litteraturen; -139-5p, -363, -422a, -486-5p, -490-3p, -628-3p, -628-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p og -3656 (tabell 2 ). Dette understreker potensialet for høy gjennomstrømming sekvensering som et verktøy for å identifisere Mirs potensielt relatert til kreftutvikling som kunne ha vært savnet ved hjelp av matrise-basert teknologi.
MIR-7 har en funksjonell rolle i differensieringen av epitelceller i tarmen , anmeldt av Tazawa
et al
. [46]. Det er tenkt å regulere ekspresjonen av transmembran glycoprotein CD98, som spiller en viktig rolle i celleadhesjon gjennom interaksjon med integrin beta-1. Oppregulering av MIR-7 undertrykker CD98 ekspresjon i Caco2-celler BBE og således modulerer beta-1-integrin-laminin-1 interaksjoner. Dette kan videre påvirke spredning og differensiering av enterocytes under trekket over krypten-villus aksen [47]. MIR-7 har blitt rapportert å virke som en tumor-suppressor i schwannomer [48], men som et onkogen i lunge squamous cellekreft [49]. Det er nye bevis for at økt EGFR uttrykk er assosiert med økt MIR-7 nivå, i hvert fall i plateepitelkarsinom. Mir-7 i sin tur er rettet mot ETS2 repressor faktor (ERF), demper EGFR uttrykk og modulerer cellevekst [49]. Det er derfor mulig at MIR-7 kan fungere på flere tilbakekoblingssløyfer og feedforward, både som tumor-suppressor og onkogen, avhengig av tumortypen. Våre funn antyder sterkt at MIR-7 er oppregulert i begge kolorektal adenokarsinomer og i nevroendokrin saken. Basert på tidligere funn og publiserte validerte mål for Mir-7 som
EGFR
,
PAK1
,
RAF1, IRS1 /2
og
CD98 product: [ ,,,0],31], er det rimelig å hypoteser om at dette Mir kan være involvert i regulering av intracellulær signalering, vekst og differensiering av kolorektal kreft.
uttrykk for MIR-96, MIR-135b og MIR-493 ble økt i flere studier på tykktarmskreft, så vel som i vår studie [14], [17], [50]. MIR-135 har vist seg å direkte rettet mot 3 «UTR av
APC Hotell og indusere nedstrøms Wnt veien [51]. Våre resultater viser også at MIR-552 og -592 uttrykk ble økt i de adenokarsinomer i forhold til normalt vev. Tidligere publiserte data for disse to Mirs viste en oppregulering i kolorektal kreft med dyktig mismatch reparasjon status (MMR), men nedregulering i MMR mangel svulster i forhold til normal kolon vev [17]. Yoon
et al
observert at MIR-296 samhandlet med 3 «UTR av
CDKN1A plakater (p21 /WAF1) genet, og at dette Mir var ofte oppregulert i løpet immortalisering av humane celler [52]. Interessant, vi også observere en oppregulering av MIR-296-3p. Dette MIR kan som sådan bidra til kreftutvikling ved å hemme p53-p21 /WAF1 sti.
Det er ikke mange publikasjoner om funksjonen av MIR-549 (Chr15 i
KIAA1199
), og til vår kunnskap ingen i forhold til tykktarmskreft. Interessant, genet transkribere dette Mir lokalisert i
KIAA1199
genet. Dette genet av usikker funksjon har tidligere blitt rapportert å være sterkt oppregulert i kolorektale adenomer (n = 32) og karsinom (n = 25) ble analysert i en studie av Sabates-Bellver
et al
. Studien viser også at ekspresjon av 19 wnt mål ble korrelert med oppregulering av
KIAA1199
, og at uttrykket i normal slimhinne var begrenset til celler i den nedre del av kryptene i kolon [53], [ ,,,0],54]. Den over-uttrykk for
KIAA1199
er senere blitt bekreftet for colonic adenomer [55] og magekreft [56]. Hvis
KIAA1199 Hotell og MIR-549 er co-transkribert, kan dette forklare den økte uttrykk nivåer av MIR-549 er funnet i vår studie. Videre, som oppreguleringen ser ut til å være et tidlig hendelse fra tidligere publiserte studier, Mir-549 kan potensielt være et surrogat biomarkør for adenom utvikling og tidlig adenokarsinom stadier. Dette bør undersøkes nærmere i større studier.
En studie på epigenetiske forstummet Mirs i tykktarmskreft fant at Mir-1247 ble metylert i HCT116 cellene. HCT116 og DLD1 celler ble så transfektert med en MIR-1247 etterligne som resulterte i en signifikant reduksjon i cellevekst og metabolsk aktivitet i begge cellelinjer. DKO celler (HCT 116 celler slettet for DNA metyltransferase) gjorde imidlertid ikke redusere cellevekst når introdusert til etterligne, men forårsaket nedsatt cellemigrasjon [57]. Rollen til denne MIR er fremdeles uklar, men det har vært antatt å fungere som en tumor suppressor. Vi fant dette MIR å være oppregulert i adenokarsinomer, noe som kan tyde på ulike mål i de rene cellelinjer i forhold til at av en organisert svulstvev.
Til slutt er det få, om noen, rapporter om funksjonen og rolle i colonic adenokarsinomer i følgende Mirs oppregulert i vår studie: -105, -483-3p, -584, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p og -4326 (tabell 2).
som vi inkludert en nevroendokrine svulster (NET) i denne studien, kan vi dra nytte av å analysere dette separat med en tilsvarende statistisk metode som for adenokarsinomer. Selv om vi jobber delvis uten gjentak kan DESeq verktøyet håndtere denne utfordringen [25]. NET er sjeldne svulster som stammer fra nevroendokrine celler på forskjellige steder i kroppen, inkludert mage-området. Det er en økende forekomst, delvis på grunn av bedre registrering og muligens bedre diagnostiske verktøy [58]. Imidlertid har svært få studier undersøkt Mir uttrykk i NET. I vår studie, netto aksjer noen betydelige Mirs med adenokarsinomer, men hva er mer slående er noen av de unike og høyt uttrykte Mirs (Tabell S2). Disse har store fold endringer sammenlignet med ikke-paret normalt vev og også en høyere relativ uttrykk i forhold til adenokarsinomer. Uttrykket mønster av Mirs i NET avviker i stor utstrekning fra normal slimhinne. Dette kan selvsagt være delvis på grunn av den neuroendokrine vevet i seg selv som er funksjonelt og genetisk forskjellig fra normal epitel og stroma. Likevel kan identifiseres Mirs potensielt hjelpe skille mellom ondartede nevroendokrine celler i tykktarmen og normal slimhinne (som våre data antyder), og muligens også mellom godartede neuroendokrine celler og normal slimhinne (ingen data). Utvalgsstørrelsen på en betyr at netto data kan bare anses veiledende. Men etter vår mening, den betydelige forskjeller i sett med forskjellig regulert Mirs mellom de to typer kreft fortjener å bli rapportert. Vår observasjon tyder på at det kan være fruktbart å ytterligere undersøke disse Mir markører som de kan være nyttig i å etablere opprinnelsen til dårlig differensierte kolorektal kreft.
mikrodisseksjon av svulstvev har ikke vært standard i studier utført. Vi har imidlertid undersøkt histopatologi av vevsprøvene, og antatt at tumor og stromale prosenter. Svulsten prosent var ca 67% i gjennomsnitt godt over gjennomsnittet for en undergruppe av KAM kohort (n = 139) som var 49% +/- 24% (data ikke publisert). Dessverre er en prøve i datasettet var avvikende med en lav prosentandel tumor (tabell 1), og dette er en svakhet i vårt studium. Ideelt studie prøvene skulle ha hatt en mer homogen svulst befolkningen. Det er imidlertid en forestilling om at den normale slimhinne består hovedsakelig av epitelceller og stroma. Ved sammenligning av tumorvevet og normal slimhinne, er vi i hovedsak å sammenligne tumorceller (med varierende mengder av stroma) med epitelceller og stroma i normal slimhinne. Som sådan, mener vi at effekten av et for lavt svulst andelen vil være falske negative resultater.
I high-throughput eksperimenter (enten matrise eller sekvensering basert), er det vanlig å utføre en validerings eksperiment med en annen teknologi. Vi utførte en slik validering eksperiment ved å bruke en kvantitativ polymerasekjedereaksjon for utvalgte Mirs og vevsprøver (figur S1). Resultatene viser en positiv sammenheng mellom de to ulike teknologiplattformer. Det er sju Mirs som de fold endringene er svært forskjellige i valideringen. Slike forskjeller i ganger endring mellom teknologiplattformer er ikke uvanlig som demonstrert av en studie av differensial MIR uttrykk ved hjelp av Affymetrix, Agilent og Illumina microarray plattformer, samt kvantitativ PCR og high-throughput sekvensering [28]. Selv om bekymring, denne observasjonen ikke resultatene som oppnås ugyldig. Faktisk har det blitt observert at fremgangsmåter for MIR-genekspresjon profilering er sterkt forspent mot en bestemt Mirs, hindrer nøyaktig bestemmelse av absolutte tall. Den observerte forspenningen er sterkt bestemmes ved den metode som brukes for fremstilling av bibliotek. Men siden skjevheter er systematisk og meget reproduserbare for en bestemt teknologi, er genekspresjon profilering egnet for bestemmelse av relative uttrykk forskjeller mellom prøvene, så lenge den samme teknologien brukes på tvers av prøvene [23]. I vår studie, på grunn av store mengder cDNA kreves for high-throughput sekvensering analyse, vi har ikke nok cDNA tilgjengelig for kvantitativ PCR validering for alle pasienter. Vi måtte derfor gjøre en ny runde med RNA ekstraksjon fra nærliggende vev der det er tilgjengelig. Enhver heterogenitet mellom de tilstøtende vev kan legge til variasjonen hos valideringsdata (figur S1).
Denne studien er så vidt vi vet unik ved at den globale high-throughput-sekvensering er blitt brukt for å karakterisere MIR ekspresjon i sammenkoblet kolorektal kreft vev og tilstøtende normal slimhinne. Selv om foreløpig, mener vi at resultatene kan tjene som en robust treningssett for en større kohortstudie. Vi utnyttet paret og ikke-paret statistikk, og identifiserte 37 Mirs som er feilregulert i de sju adenokarsinom tilfeller i begge statistiske tilnærminger; 19 nedregulert og 18 oppregulert. Vår omfattende undersøkelse av forskjellig uttrykt Mirs bekrefter noen eksisterende funn. Vi har også oppdaget 16 feilregulert Mirs som, så vidt vi vet, har ikke tidligere vært forbundet med kolorektal kreftutvikling. Våre resultater tyder på at disse kan være viktige regulatorer og at ytterligere undersøkelser av potensielle Mir mål og deres mulige bruk som forutsigende eller prognostiske markører er garantert. Spesielt interessant er det MIR-549 genet ligger i
KIAA1199
som selv tidligere har vært forbundet med oppregulering i kolon adenomer og karsinomer. Hvis MIR er co-transkribert, kan det være en potensiell surrogatmarkør for tidlig deteksjon i kroppsvæsker eller avføring. Studien har også kaste nytt lys over potensielle Mir biomarkører som synes å være spesifikk for garn i tykktarmen.
Materialer og metoder
Cohort
Åtte pasienter med kolorektal kreft ble valgt fra en norsk kolorektal kreft kohort (
Kolorectalcancer, arv og miljø, etter KAM) basert på parametere alder og kjønn. Alle pasientene var menn med en gjennomsnittsalder på 60 år. Alle vevsprøver ble ekstrahert fra kirurgiske prøver. Den normale slimhinne ble oppsamlet i en distal del av tarmen nær reseksjonskanten. Prøvene ble deretter frosset i flytende nitrogen og lagret i en fryser ved -80 grader Celsius. Syv av pasientene ble bekreftet å ha adenokarsinomer og en ble karakterisert som en nevroendokrine svulster ved histopatologisk undersøkelse. Kliniske og histopatologiske karakteristika for pasientene er oppsummert i tabell 1.
RNA ekstraksjon og digital Sekvense
Total RNA fra pasientene ble ekstrahert fra 10 frosne snitt av 10 um for tumor og normalt vev hhv bruker Mirvana kit (Ambion, TX, USA) i henhold til produsentens protokoll. Enkelte prøver ble konsentrert i en vakuumsentrifuge å oppnå den nødvendige konsentrasjon på 1 pg /pl. Tilstedeværelsen av små RNA ble bekreftet på en Bioanalyzer 2100 (Agilent, CA, USA) uten tegn til degradering ved vurdering OD ratio 260/280. Start mengden var 10 pg av total RNA, og fremstillingen protokollen ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. Liten RNA ble isolert fra total-RNA på en Novex 15% TBE-urea PAGE-gel. Området som representerer båndstørrelse på 18-30 nukleotider (nt) ble skåret ut og fragmentert, RNA ble eluert i 0,3 M NaCl og renset på en spinn X kolonne. 5′-adapter ble ligert i 6 timer ved 20 ° C. Liten RNA med ligeres 5′-adapter ble isolert på en 15% Novex TBE-urea PAGE-gel (Invitrogen, CA, USA).
