Abstract
En rekke rapporter tydet på at Aurora-A eller Aurora-B overekspresjon representerte en negativ prognostisk faktor i flere menneske malignitet. I skjoldbrusk kreft vev et deregulert uttrykk for Aurora kinaser er også demonstrert, butno informasjon om det er mulig prognostisk rolle i differensiert skjoldbruskkjertelkreft er tilgjengelig. Her weevaluated Aurora-A og Aurora-B mRNA uttrykk og sin prognostisk relevans i en serie av 87 papillær skjoldbrusk kreft (PTC), med en median oppfølging på 63 måneder. Analysen av Aurora-A og Aurora-B mRNA-nivåer i PTC vev, sammenlignet med normale vev passet, avslørte at deres ekspresjon var enten opp- eller ned-regulatedin flertallet av kreftvev. Spesielt ble Aurora-A og Aurora-B mRNA-nivåer endres, henholdsvis 55 (63,2%) og 79 (90,8%) ut av 87 PTC analyzed.A signifikant positiv korrelasjon mellom Aurora-A og Aurora-B-mRNAswas observert (p = 0,001). Uttrykket av begge Aurora gener ble ikke påvirket av BRAF
V600E mutasjon. Univariate, multivariat og Kaplan-Mayer analyser dokumentert manglende sammenheng mellom Aurora-A eller Aurora-B uttrykk og clinicopathological parameterssuch som kjønn, alder, tumorstørrelse, histologi, TNM stadium, lymfeknutemetastase og BRAF status samt asdisease tilbakefall eller sykdom -gratis intervall. Bare Aurora-B mRNA var signifikant høyere i T (3-4) vev, med hensyn på T (1-2) PTC vev. Dataene som presenteres her viser at uttrykket av Aurora kinaser er deregulert i de fleste PTC vev, trolig bidra til PTC progresjon. Men forskjellig fra andre humane solide kreftformer, er påvisning av Aurora-A eller Aurora-B mRNA ikke en prognostisk biomarkør inPTC pasienter
Citation. Baldini E, Tuccilli C, Prinzi N, Sorrenti S, Falvo L, de Vito C, et al. (2015) deregulert Uttrykk for Aurora kinaser er ikke en prognostisk Biomarker i papillær tyroideacancer. PLoS ONE 10 (3): e0121514. doi: 10,1371 /journal.pone.0121514
Academic Redaktør: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italia
mottatt: 9 desember 2014; Godkjent: 02.02.2015; Publisert: 25 mars 2015
Copyright: © 2015 Baldini et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet var støtte av en bevilgning (PRIN 2010BX2SNA_007) av Minis dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomsten av differensierte skjoldbrusk kreft (DTC) har vært økende de siste tiårene, hovedsakelig på grunn av den økende evne til å diagnostisere malign transformasjon i små ikke-palpable knuter [1-4]. DTC omfatter to hoved histologiske enheter, den sjeldne follikulær skjoldbruskkjertelen karsinom (FTC) og themore felles papillær thyroideakarsinom (PTC). Etter dedifferentiation DTCare antas å generere dårlig DTC (PDTC) og svært aggressive anaplastiske skjoldbruskkjertelen karsinom (ATC) [5-6]. Relevante molekylære forandringer som oppstår i tyreoideacancer progresjon omfatter genet rearrangementer av tyrosin kinase-reseptorer, slik som RET /PTC og NTRK1, aktivering av punktmutasjoner av RAS og BRAF gener, og det onkogene fusjonsproteinet PAX8-PPARy [7].
prognosen for DTC pasienter er vanligvis gunstig, med en 10-års-overlevelse for ca 90% av dem. Ikke desto mindre, omtrent 20% av pasientene som vender tilbakevendende sykdom og DTC-relaterte dødsfall [8]. Lagdelingen og prognose av DTC pasienter som er avhengige av clinicopathological variabler som pasientens alder, tumor størrelse, histologiske, lymfe nodal eller fjern metastase [8-11]. Disse parametrene er imidlertid i stand til å tilveiebringe bare en grov forutsigelse av sykdommen utfall, å plassere pasienter med svært forskjellige sykdomsspesifikke progresjon og overlevelsestider innenfor det samme risikogruppen. På samme måte de ikke klarer å forutsi risikoen for kreft tilbakefall. Derfor er identifisering av nye prognostiske molekylære biomarkører i stand til å vitne tumor aggressivitet nødvendig [11-17].
genetisk ustabilitet fører til celle Aneuploidy og overgang til mer aggressive fenotyper representerer et kjennetegn på solide kreftformer, inkludert skjoldbruskkjertelen karsinomer [18-22] .I faktum, antallet og hyppigheten av kromosomavvik observert i skjoldbrusk kreft øke fra DTC til PDTC og ATC [5, 20]. Ulike mitotiske kinaser, som uttrykk eller funksjon har blitt funnet endret i kreftceller, blir holdt ansvarlig for svulst genetisk ustabilitet. Disse inkluderer de tre Aurora kinase familiemedlemmer, Aurora-A, -B og -C, involvert i reguleringen av flere aspekter av kromosom segregering og cytokinese [23]. I løpet av cellesyklusen, er deres ekspresjon nøye regulert, blir maksimal i G2 /M-fase, mens den raske nedbrytning ved slutten av mitose av ubiquitin-proteasom-reaksjonsveien er nødvendig for å tillate cellen å gå inn i en ny cellesyklus [23 ]. Aurora-A lokaliserer på de dupliserte centrosomes og er involvert i mitotisk oppføring, sentrosomen og spindel modning, mens Aurora-B forbinder med kromatin hvor den danner den såkalte kromosom passasjer kompleks (CPC) med andre proteiner som INCENP, Survivin og borealin , delta i kromosom kondensering [23]. Videre under overgangen fra anaphase til telophase, Aurora-B spiller en rolle i mitotiske spindel dynamikk, til tilkoblinger kromosomer spindel mikrotubuli, og cleavage fure. Aurora-C uttrykkes hovedsakelig i testikkel og, på samme måte som Aurora-B, har det vist seg å bli med CPC i mitotiske celler [23]. Gitt de avgjørende oppgaver Aurora kinaser i alle mitotiske faser, deres dysfunksjon og /eller feilregulering holdes ansvarlig, i hvert fall delvis, for unormal celledeling og Aneuploidy observert i ondartede celler. Etter avtale med dette, har overekspresjon av Aurora-A og /eller Aurora-B er vist å assosiere med en dårlig prognose i flere menneskelige maligniteter, inkludert bryst, mage, prostata, hode og nakke, blære, eggstokkene, tykktarm, adrenokortikal og lunge kreft [24-31].
data~~POS=TRUNC fra våre egne og andre forskningsgrupper som tidligere viste en endret uttrykk for Aurora kinaser i ulike skjoldbrusk kreft avledet cellelinjer og vev [32-35]. Selv om disse kinaser er nå fremstår som lovende nye terapeutiske mål for skjoldbruskkjertelkreft behandling, har ingen forsøk vært madeso mye til å vurdere mulig prognostisk verdi av Aurora kinaser i PTC pasienter [23, 36-39]. I den foreliggende studywe evaluert ved hjelp av kvantitativ RT-PCR, ekspresjonsnivået av Aurora-A og Aurora-B i en studie av 87 PTC-vev passet mot normalt vev. Dataene ble deretter korrelert med clinicopathological parametere og med den sykdomsfritt intervall av pasientene. I tillegg, siden den BRAF
V600E mutasjon, det oftest påtruffet endring i PTC, ble nylig vist å indusere ekspresjon av Aurora-B i melanomceller, effekten av BRAF mutasjoner på ekspresjon av Aurora-kinaser i PTC vev ble også vurdert [40]
Materialer og metoder
Vevsprøver, histologi og pasientens staging
saken studien inkluderte 87 pasienter på rad.; normale og matchet kreftskjoldbruskkjertelen vev ble oppnådd fra kirurgiske prøver av 19 menn og 68 kvinner (i alderen 11-83 yrs, median 44.21yrs) som gjennomgikk total tyreoidektomi for PTC ved Institutt for kirurgiske fag, «Sapienza» Universitetet i Roma (n = 31), eller ved Institutt for medisinske og kirurgiske fag, Universitetet i Padova, Italia (n = 56) .Alle pasienter ga sin skriftlig informert samtykke. For tre mindreårige pasienter skriftlig informert samtykke ble innhentet fra sine foreldre. Studien ble godkjent av Policlinico Umberto I sykehus etisk komité (Ref. 2615). Vevsprøver ble samlet, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Av de 87 PTC pasienter, 76 viste den klassiske, 10 follicular, og en den høye celle variant. To forskjellige histopatologer gjort histologiske diagnoser uavhengig ifølge Verdens helseorganisasjon klassifisering og på blind måte med hensyn til Aurora kinase uttrykk [41]. På tidspunktet for kirurgi, ble lymfeknutemetastaser funnet i 38 pasienter. Etter TNM staging, ble 54 pasienter identifisert til å være på scenen jeg, en på trinn II, 25 ved stadium III og 7 på scenen IV. Førti til femti dager etter operasjonen, alle pasienter gjennomgikk radiojod behandling og den påfølgende hele kroppen scan (WBS) viste fravær av metastaser. Pasienter deretter begynte skjoldbruskkjertelhormon. For å fastslå deres sykdomsfri tilstand, fire til fem måneder senere alle pasientene gjennomgikk nakke ultralyd og serumtyreoglobulin (Tg) måling. Tilbakefall ble diagnostisert med finnålsaspirasjon (FNA) cytologi,
131I WBS eller histologisk analyse etter kirurgisk reseksjon av lesjon. Av de 87 pasientene, oppfølging (median 63months, range 8-133months) var tilgjengelig for 78 (18 hanner og 60 hunner med en median alder av 44yr), 52of som var på TNM stadium I-II og de resterende 26 ved stadium III-IV. Den nedre grense for tider-til-tilbakefall startet på 6 måneder. I løpet av oppfølgings 21 tilbakefall ble registrert, 17 blir cervical lymfeknuter, diagnostisert etter FNA cytologi og 4 lungemetastaser, diagnostisert ved WBS.
Fastsettelse av BRAF
V600E mutasjon
genomisk DNA ble ekstrahert fra de frosne vev ved hjelp av DNeasy blod og vev kit ifølge produsentens protokoll. BRAF status av exon 15 ble vurdert ved både direkte sekvensering og mutant allel-spesifikk PCR-amplifikasjon for T til A substitusjon ved nukleotid 1799 (V600E), under anvendelse av prosedyren tidligere describedand på blind måte med hensyn til Aurora-kinase-ekspresjon [42].
PCCL3 cellekultur
Den godt differensiert, ikke-transformert rotte thyroid epitelcellelinje PCCL3 var en gave fra Dr. JA Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York). Cellene ble dyrket i H4 komplett medium bestående av Coon medium /F12 høyt sink supplert med 5% føtalt bovint serum, 0,3 mg /ml L-glutamin, 1 mlU /ml TSH, 10 ug /ml insulin, 5 ug /ml Apo transferrin, 10 nM hydrokortison, og penicillin /streptomycin. Disse cellene betinget uttrykke BRAF
V600E i en doksycyklin avhengig måte [43]. BRAF
V600E induksjon ble oppnådd ved å legge til H4 komplett medium doksycyklin 1 ng /ml, og inkubere cellene i 48 timer.
Utvinning og analyse av mRNA
Den skjoldbrusk vev var homogenisert med den ultra-turrax, og total RNA ble ekstrahert fra vev eller celler som gjelder PCCL3 syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-metoden [44]. Den første cDNA-tråd ble syntetisert fra 5 ug av RNA med M-MLV revers transkriptase og forankret oligo (dT) 23 primere (Sigma Chemicals Co.). Parallelle kontroller for DNA-kontaminering ble utført utelate revers transkriptase. De oppnådde maler ble brukt for kvantitative PCR presiseringer av Aurora kinaser og husholdningsgener som anvender LightCycler instrument (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), den SYBR Premix Ex Taq II (TliRNase H Plus) (Takara, Otsu, Shiga, Japan) og spesifikke primere som er oppført i Tabell 1. amplicon særegen ble sjekket av automatiserte DNA-sekvensering (Primm, San Raffaele Biomedical Science Park, Milano, Italia), evaluering av smeltetemperaturer og /eller elektroforese på 2% agarose gel som inneholder etidiumbromid. Standardkurver for alle genene ble oppnådd med fem-gangers fortynninger av PCCL3 celler eller vev blandet cDNA human thyroid. Beregning av data for human thyroid vev ble utført ved den relative uttrykk programvare verktøyet (REST 2009) ved anvendelse av en normaliseringsfaktor (NF) beregnes som den geometriske media av 3 referansegener (GAPDH, RPL13A og SDHA), som tidligere beskrevet [45, 46 ]. Folden endring av Aurora-kinase-uttrykk for hver tumorprøve ble referert til normal motstykke. Denne analysen ble performedin blind måte med hensyn til histologiske og kliniske data for pasienten. Brett variasjoner mellom 0,8 og 1,2 ble vurdert uendret. Beregninger av dataene for eksperimenter på PCCL3 celler ble utført ved hjelp av LightCycler relativ kvantifisering programvare 1.0 (Roche Diagnostics), og fold uttrykk for Aurora kinaser for doxycycline behandlet PCCL3 celler ble normalisert mot ikke-behandlede celler. Alle resultatene er rapportert som gjennomsnitt ± SEM og medianverdier.
Statistisk analyse
Den ikke-parametrisk Mann Whitney test ble brukt for å beregne statistisk signifikans av forskjeller i uttrykket nivåer av Aurora kinaser i PTC med deregulert uttrykk versus PTC med uendret mRNA nivåer, og i villtype versus mutert BRAF prøver. I tillegg har foreningen av uttrykket av Aurora kinaser med kjønn, histologi, lymfeknutemetastase, TNM stadium eller tilbakefall ble evaluert av Mann Whitney test. Analysene av sammenhengen mellom Aurora-A og Aurora-B mRNA nivåer, samt mellom disse og alder ble utført ved anvendelse av Rho Spearman test. For å vurdere uavhengig sammenslutning av Aurora kinaser med DFI, ble Cox regresjon teksten brukt. Virkningen av Aurora kinase uttrykk på sykdomsfritt intervall (DFI) ble vurdert ved hjelp av Kaplan-Meier analyse kombinert med Mantel-Cox log-rank. For Kaplan-Meier analyse, ble Aurora kinase verdier delt inn i tre grupper basert på økt, uendret eller redusert kinase uttrykk. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av versjon 8.0 av Stata programvare (Stata Corporation 2003, College Station, TX). Resultatene ble ansett som vesentlig annerledes dersom p-verdiene var lavere enn 0,05.
Resultater
Uttrykk av Aurora kinaser i papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC) vev
Analysene av Aurora-A og Aurora-B mRNA-nivåer i PTC-vev, sammenlignet med deres normale passet vev, avslørte at Aurora-A mRNA levelswere deregulert i 55 (63,2%) av 87 PTC prøver, med en økning på 30 og en nedgang i 25 (fig. 1A). Aurora-B mRNA-nivåer ble endret på 79 (90,8%) av 87 prøver, blir oppregulert i 57 og nedregulert i 22 (fig. 1B) av tilfellene. Som rapportert i fig. 1C, mRNA-nivåer av Aurora-A og Aurora-B var positivt korrelert til hverandre (p = 0,001).
A og B) Variasjoner i ekspresjon av Aurora-A og Aurora-B i papillær tyreoideacancer vev. De fold endringene ble beregnet med tanke på Aurora-A eller Aurora-B mRNA nivåer observert i normal matchet tyroideavev lik 1. statistisk evaluering av dataene ble utført usingthe ikke-parametrisk Mann-Whitney test. De små barer i grafen viser medianverdier. C) Korrelasjon analyse av Aurora-A og Aurora-B mRNA i PTC vev. Dataene ble evaluert ved bruk av Rho Spearman test.
BRAF
V600E mutasjon og Aurora kinase uttrykk i PTC vev
For å vurdere effekten av BRAF
V600E mutasjon på ekspresjon av Aurora-A og Aurora-B vi først analysert mRNA-nivået av begge gener i BRAF
V600E PTC-tumorer (n = 37), sammenlignet med de skjuler villtype-proteinet (n = 38) (fig. 2A). Resultatene viste at thepresence av BRAF
V600Emutation ikke påvirke uttrykket nivåer av Aurora-A eller Aurora-B i PTC vev, sammenlignet med villtype-BRAF PTC vev. For å underbygge disse
in vivo
observasjoner, vi utførte
in vitro
eksperimenter på godt differensiert, ikke-transformert rotte epitelcellelinje PCCL3, preget av en doksycyklin avhengig BRAF
V600E uttrykket system [50]. I disse cellene BRAF
V600E uttrykk og etterfølgende induksjon av MEK /ERK-fosforylering veien først 12 timer etter tilsetning av doksycyklin, og den totale BRAF uttrykket (endogen vill-type + indusert V600E mutant) ved 48 timer ble estimert til være 2 ganger høyere enn kontrollen. Som rapportert i fig. 2B, behandling av PCCL3 med doxycyclin (1 ug /ml i 48 timer) påvirket ikke Aurora-kinase-mRNA-nivåer.
A) Ekspresjon av Aurora-A og Aurora-B i papillær thyroid kreft vev med villtype (n = 38) eller mutert BRAF (n = 37). Brette endringer ble beregnet med tanke på Aurora-A eller Aurora-B mRNA nivået som ble observert i normale matchet tyroideavev lik 1. Den statistiske evaluering av dataene ble utført ved å anvende den ikke-parametriske Mann Withney test. De små barer i grafen viser medianverdier. B) Effekt av BRAF
V600E på Aurora kinaser mRNA i PCCL3 celler. Sistnevnte ble overtalt til å uttrykke BRAF
V600E i en doksycyklin avhengig måte. De fold endringer av Aurora kinase mRNA ble normalisert mot de ikke-behandlede celler.
Prognostic relevansen av Aurora kinase uttrykk i PTC pasienter
Variasjoner i uttrykket av Aurora-A gjorde ikke forbinder med noen av de clinicopathological parametere analysert (tabell 2), mens apositive korrelasjon (p 0,001) ble funnet mellom Aurora-B mRNA nivåer og tumorstørrelse (tabell 2) sikret Kaplan-Meier analyse viste ingen sammenheng mellom pasientenes sykdomsfrie intervall og Aurora-kinase opp- eller nedregulering (fig. 3). Multivariat analyse viste at økt eller redusert ekspresjon av Aurora-A eller Aurora-B, TNM stadium, alder eller BRAF
V600E mutasjon mislyktes i å forutsi sykdom utbytte (tabell 3). Bare kvinner viste en statistisk signifikant reduksjon av hazard ratio (HR 0,286) for sykdom tilbakefall (Tabell 3).
Kaplan-Meier analyse kombinert med Mantel-Cox log-rank statistisk test utført på 75 PTC pasienter followed- opp fra 8 til 133 måneder.
Diskusjoner
i tidligere studier, vår og andre forskningsmiljøer demonstrert et deregulert uttrykk for Aurora kinaser i differensiert og anaplastisk skjoldbrusk cancervev [23]. Dette ble bekreftet i denne studien hvor Aurora-A og Aurora-B genekspresjon ble funnet enten oppregulert eller nedregulert (henholdsvis 63,2% og 90,8%,) i de fleste av papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC) vev analysert, i forhold til sine normale passet skjoldbruskvevet. Det er verdt å nevne at enten oppregulering eller nedregulering av Aurora kinaser kan vise seg proliferatively fordel å skjoldbruskkjertelen kreftceller. Faktisk forskjellige rapporter viste at mengden av Aurora-A proteinin den sentrosomen er avgjørende for dets replikasjon og mitotiske funksjoner, og at enten en mangel eller overskudd av Aurora-ACAN føre til unormal mitose, så vel som til kromosom segregering og cytokinese defekter [ ,,,0],47].
det har nylig blitt vist at i melanomceller ekspresjon av Aurora-B og Wee1-lignende protein kinase induseres ved nærværet av BRAF
V600E [40]. Siden BRAF
V600E mutasjon er ofte oppstått i PTC, vi også søkt å fastslå om mutasjon i skjoldbrusk kreft celler var assosiert til økt uttrykk av Aurora kinaser. I vår serie ble BRAF status vurderes i 75 PTC vev og BRAF
V600E ble funnet hos 37 (49,3%) av dem. Men ingen forskjell i Aurora-A eller Aurora-B uttrykk levelswas funnet mellom villtype og BRAF
V600E PTC vev. Disse observasjonene var confirmedby
in vitro
eksperimenter på rotter skjoldbrusk PCCL3 celler, som uttrykker BRAF
V600E i en doksycyklin avhengig måte [43]. Faktisk gjorde behandlingen av disse cellene med doksycyklin ikke påvirke uttrykket nivået av enten Aurora-A eller Aurora-B.
I løpet av det siste tiåret, en rekke rapporter indikerte at overekspresjon av Aurora-A eller Aurora-B representerer en negativ prognostisk faktor i flere humane maligniteter, inkludert bryst, mage, prostata, hode og nakke, blære, ovarie, kolon, binyrebark og lungekreft [25-32]. Færre studier har imidlertid forbundet overekspresjon av Aurora-A eller Aurora-B med en gunstig prognose i kolorektal, mage og eggstokkreft karsinom [48-50]. Til dags dato har ingen informasjon om mulig prognostisk rolle Aurora kinaser i differensiert skjoldbruskkjertelkreft er rapportert. I denne sammenheng har vi her evaluert prognostisk relevansen av Aurora-A og Aurora-B mRNA-nivåer i en serie av 78 PTC, med en median oppfølging av 63 måneder. Univariate analyser dokumentert manglende sammenheng mellom Aurora-A uttrykk og clinicopathological parametere, inkludert alder, kjønn, tumorstørrelse, lymfeknutemetastase, histologi, TNM, BRAF status og gjentagelse. Tilsvarende hadde Aurora-B ekspresjon korrelerte ikke med noen av disse parameterne med unntak av tumorstørrelse, hvor mRNA-nivåer var signifikant høyere hos T (3-4) vev, med hensyn til t (1-2) vev. Kaplan-Meyer og multivariate analyser bekreftet at deregulert uttrykk for Aurora kinaser er ikke en prognostisk biomarkør av papillær skjoldbruskkreftpasienter. I multivariat analyse kvinnelige kjønn viste en signifikant beskyttende effekt (Hazard Ratio 0,286, p = 0,021). Sistnevnte er i overensstemmelse med to nyere studier utført på stort fall-serie som viser den beskyttende rolle av den kvinnelige kjønns på sykdomsspesifikk overlevelse [51, 52] har .Det skal nevnes at en grense for den foreliggende studie er den relativt lave antall pasienter analysert som gir et statistisk styrke (1-β) på 0,63.
Konklusjoner
i konklusjonen, selv om dataene rapportert hereneed bekreftes ved hjelp av større case-studier, de viste at ekspresjon av Aurora-kinaser er deregulert i de fleste PTC vev, og sannsynligvis bidrar til PTC progresjon og kreftcelle Aneuploidy. Men forskjellig fra andre humane faste cancere, Aurora-A eller Aurora-B ekspresjon på mRNA-nivå er ikke en prognostisk biomarkør i tilfelle av PTC-pasienter.
