Abstract
Bakgrunn
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) har en sturen prognose. Den høye risikoen for tilbakefall etter kirurgisk reseksjon gir begrunnelsen for adjuvant behandling. Men bare en undergruppe av pasienter har nytte av adjuvant behandling. Identifisering av molekylære markører for å forutsi behandlingsresultat er derfor berettiget. Målet med denne studien var å vurdere om uttrykk for nye kandidat biomarkører, inkludert microRNAs, kan forutsi klinisk utfall i PDAC pasienter behandlet med adjuvant behandling.
Metodikk /hovedfunnene
formalinfiksert parafin innebygde prøver fra en kohort av 82 resected koreanske PDAC saker ble analysert for protein uttrykk ved immunhistokjemi og for mikroRNA uttrykk ved hjelp kvantitativ real-time PCR. Cox modell analyse i undergruppen av pasienter behandlet med adjuvant behandling (N = 52) viste at lavere enn median MIR-21 uttrykk ble assosiert med en betydelig lavere hazard ratio (HR) for død (HR = 0,316; 95% CI = 0,166 til 0,600, P = 0,0004) og tilbakefall (HR = 0,521; 95% CI = 0,280 til 0,967; p = 0,04). MiR-21 ekspresjonsstatus dukket opp som den mest prediktive biomarkør for behandlingsresultatet blant alle 27 biologisk og 9 clinicopathological faktorer vurderes. Ingen signifikant sammenheng ble påvist hos pasienter som ikke ble behandlet med adjuvant behandling. I en uavhengig validering kohort av 45 frosne PDAC vev fra italienske tilfeller, behandlet med adjuvant behandling, lavere enn median MIR-21 uttrykk ble bekreftet å være korrelert med lengre total samt sykdomsfri overlevelse. Videre transfeksjon med anti-MIR-21 forbedret kjemosensitivitet av PDAC celler.
Konklusjoner Betydningen
Lav MIR-21 uttrykk var forbundet med nytte av adjuvant behandling i to uavhengige kohorter av PDAC tilfeller og anti-MIR-21 økte kreft narkotika aktivitet
in vitro
. Disse dataene gir bevis for at Mir-21 kan tillate stratifisering for adjuvant behandling, og representerer en ny potensielt mål for terapi i PDAC
Citation. Hwang JH, Voortman J, Giovannetti E, Steinberg SM, Leon LG, Kim YT, et al. (2010) Identifisering av mikroRNA-21 som en biomarkør for Chemoresistance og klinisk utfall Etter adjuvant behandling i resektable kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE fem (5): e10630. doi: 10,1371 /journal.pone.0010630
Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 23 januar 2010; Godkjent: 20 april 2010; Publisert: 14 mai 2010
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. i del finansiert av National Institutes of Health, National Cancer Institute utført program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall og i løpet av de siste tiårene liten forbedring i overlevelse har blitt observert til tross for omfattende forskningsinnsats [1]. Om lag 95% av eksokrine pankreas kreft er bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer (PDAC), hvorav forekomsten har økt jevnt de siste tiårene [1], [2]. Kirurgi er gjennomførbart i 15-20% av pasientene, men selv etter fullstendig reseksjon, forblir prognose sturen, med en 5-års overlevelse henger på 10-20% [3].
Bukspyttkjertelkreft er notorisk resistente mot kjemoterapi og strålebehandling. Adjuvant behandling er beskjedent effektiv og kan ha betydelige toksisitet. Derfor er rollen som adjuvant behandling i resectable kreft i bukspyttkjertelen fortsatt uklart, men generelt antatt å nytte en undergruppe av pasienter [4], [5]. Å kunne identifisere denne undergruppen ville være et stort fremskritt i behandling av denne sykdommen som det ville tillate pasientutvelgelse for adjuvant behandling [6]. Derfor er prediktive markører for følsomhet for adjuvant terapi så vel som nye terapeutiske mål presserende behov i denne sykdommen [7], [8].
Endret ekspresjon av flere faktorer som har vært forbundet med PDAC aggressiv adferd og prognose. For eksempel, blant alle kreftformer, har PDAC den høyeste frekvensen av
K-Ras
mutasjoner, som har ført til spekulasjoner vedrørende dens anvendelse som et diagnostisk, så vel som et prognostisk markør [7]. Proteinproduktet av
K-Ras
er et GTP-bindende protein mediere en rekke kritiske cellulære funksjoner, inkludert proliferasjon, celleoverlevelse og motilitet. Men de fleste av bevisene, så langt, tyder på at
K-ras
mutasjoner er ikke signifikant assosiert med overlevelse i bukspyttkjertelen kreftpasienter [9], [10]. Andre studier foreslo prognostisk betydning av endret ekspresjon av proteiner involvert i Ras-signalreaksjonsveien, slik som Akt. Ikke desto mindre ble fosforylert Akt uttrykk nivåer assosiert med både kortere og lengre overlevelse i reseserbare PDAC pasienter [11], [12]. Andre markører rapportert som selvstendige prediktor for PDAC prognose inkluderer p16, matriks-metalloproteinase-7 (MMP-7) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ekspresjon [13]. Likevel er mange biologiske aspekter som gjelder denne sykdommen fremdeles dårlig forstått, og ingen enkelt markør har vist seg å forutsi klinisk utfall.
De siste årene har det blitt klart at protein uttrykk kan også være regulert av microRNAs (mirnas ) [14]. MicroRNAs er en klasse av små ikke-kodende RNA som samhandler med mRNAer av gener for å dirigere deres posttranskripsjonelt undertrykkelse [15]. MikroRNA har vist seg å være involvert i onkogenese og tumorvekst, og også å spille en viktig rolle i chemoresistance [16] – [19]
Videre er det uttrykk for microRNAs vevsspesifikk, og visse kreft histotypes. kan klassifiseres basert på mikroRNA uttrykk profiler [20], [21]. I kreft i bukspyttkjertelen, har flere mirnas blitt rapportert å være abnormt uttrykk, inkludert microRNAs med sentrale roller i kreft, for eksempel «Onco (fremkallende) -miRs», MIR-21 og MIR-155, og «tumor suppressor Mirs», speil 29b og Mir-34 og la 7 familier [22] – [29]. Prekliniske studier i PDAC celler viste at eksogene MIR-34 overekspresjon var assosiert med tilberedning av p53-avhengig tumor suppressor funksjon i p53-mangel celler samt hemming av kreft i bukspyttkjertelen stamcelleselvfornyelse [30]. Oppregulering av Let-7 er forbundet med reversering av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) i gemcitabin-resistente celler [31]. MikroRNA-29b kan målrette de novo-DNA metyltransferase 3A og 3B (DNMT3A og DNMT3B) og føre til global hypometylering og overekspresjon av forskjellige tumorsuppressorgener, inkludert p16 [32]. MikroRNA-21 uttrykket er assosiert med økt spredning, invasive egenskaper, og gemcitabin chemoresistance og en tidligere studie viste at høy MIR-21 uttrykk, som bestemmes av in situ hybridisering, var prediktiv av kortere overlevelse i PDAC node-negative pasienter [28], [33]. MikroRNA-155 er involvert i undertrykkelse av
Tumor protein 53-indusert kjerneprotein 1
, som er en proapoptotiske stress-fremkalt p53 målgen og en negativ prognostisk effekt av høy MIR-155-ekspresjon ble observert i en kohort av PDAC tilfeller blant pasienter med avansert sykdom og /eller lokale R2-reseksjon [34], [35].
Formålet med denne studien var å evaluere potensielle biologiske markører for å forutsi utfallet av adjuvant kjemoterapi. Derfor har vi utført en integrerende analyse av uttrykket av MIR-21, MIR-29b, MIR-34a /b /c, MIR-155 og la-7a-2 i en kohort av PDAC pasienter med kjente patologiske og behandlingskarakteristika . I tillegg har vi undersøkt uttrykk for 20 kjente potensielle proteinmarkører og mål for terapi, er involvert i PDAC progresjon og prognose (se tabell S1 for en komplett oversikt over de 27 biologisk og 9 clinicopathological faktorer som brukes i studien) [6], [13 ]. Siden MIR-21 ekspresjonsstatus dukket opp som den mest prediktive biomarkør for behandlingsresultat fra alle faktorer vurderes i adjuvant-behandlede pasienter, ble utført nærmere analyse av MIR-21 uttrykk i en annen kohort av 45 pasienter, alle behandlet med adjuvant behandling. Dette uavhengig sett bekreftet signifikant sammenheng av MIR-21 ekspresjonsstatus med både overlevelse og sykdomsfri overlevelse. I tillegg ble sammenslutning av lav MIR-21 uttrykk med nytte av adjuvant behandling støttet av
in vitro
data som viser økt kjemosensitivitet av PDAC celler etter transfeksjon med anti-MIR-21.
metoder
Deltakere, studiesentre, behandling detaljer
To hundre førtifem pasienter som gjennomgikk bukspyttkjertelkreft reseksjon med den endelige diagnosen kreft i bukspyttkjertelen ble retrospektivt anmeldt bruker elektronisk pasientjournal i perioden 1999-2007 ved Seoul National University Hospital og Seoul National University Bundang Hospital. Blant dem, hadde åtti-to pasienter fullstendig reseksjon (R0) bukspyttkjertelen adenokarsinom og ble inkludert i studien. Patologisk tumorstadium ble bestemt i henhold til den amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) Kreft stillas, 6
th edition [36]. I korthet, i patologiske T1-2 trinn (pT1-2) tumor engasjement er begrenset til bukspyttkjertelen, tumorstørrelse blir mindre eller større enn 2 cm for trinn PT1 og pT2, respektivt. Patologisk T3 (pT3) stadium svulster utover bukspyttkjertelen, uten involvering av cøliaki aksen eller overlegen mesenteric arterie, mens pt4 svulster er preget av involvering av cøliaki aksen eller den overlegne mesenteric arterien. Som for lymfe nodal scenen, patologisk nodal trinn 1 (PN1) viser regional lymfeknutemetastase. Til slutt, indikerer M1 nærvær av fjernmetastaser. Sykdomsstadier I, IIA, IIB, III og IV indikerer «pT1-2 pN0 M0», «pT3 N0 M0», «pT1-3 PN1 M0», «pT4 noen N M0» og «enhver pT noen pN M1», henholdsvis . Pasientene fikk adjuvant kjemoterapi, kombinert kjemoradioterapi (CCRT) eller begge (n = 52), eller ikke får behandling (n = 27). Behandling status av tre pasienter var ukjent. Adjuvant kjemoterapi og kjemoterapi-strålebehandling besto av kombinasjoner av gemcitabin eller 5-fluorouracil (5-FU). FFPE- prøvene ble anmeldt for diagnose og tumor innhold på Seoul National University Hospital, samt ved National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD. Validerings kohorten besto av frosne prøver fra 45 sammenhengende bukspyttkjertelen adenokarsinom italienske pasienter diagnostisert i perioden 2001-2004 ved Region henvisning Senter for bukspyttkjertel sykdom behandling, Universitetssykehuset i Pisa, Pisa, Italia [37]. Adjuvant behandling besto av gemcitabin-basert kombinert modalitet behandling. Detaljer om adjuvant regimer er oppført i tabell S2.
Etikk
Pasient samtykke og studere godkjenning er innhentet fra lokale Institutional Review Boards i henhold til de juridiske bestemmelser i deltakerlandene. Informert skriftlig samtykke ble oppnådd fra koreanske pasienter som var fremdeles i live ved tidspunktet for undersøkelsen gjennom det menneskelige vev banken. Studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of Human Clinical Research Center. Når det gjelder italienske pasienter ble skriftlig samtykke innhentes. Studien protokollen ble godkjent av Universitetet i Pisa Etikkutvalget.
Immunohistochemistry
Uttrykket av 20 proteinmarkører og mål for terapi ble studert ved immunhistokjemi (IHC). Som rapportert i tabell S1 vi har evaluert ekspresjonsnivåene av de følgende markører: vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), matriksmetalloproteinase-2 (MMP2), matriksmetalloproteinase-7 (MMP7), matriks-metalloproteinase-9 (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (TIMP3), epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), excision reparasjon kryss-komplementering gruppe 1 (ERCC1), chemokine (CXC motiv) reseptoren 3 (CXCR3), chemokine (CXC motiv) reseptor 4 (CXCR4), amfiregulin, epiregulin, hepatocytt-vekstfaktor (HGF), neuropilin, insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor-beta (IGF-1R), Ron β, c-Met, fosforylert-c-Met (Pc-Met), tymidylatsyntase (TS), E -cadherin, og ribonukleotidreduktase subenhet M1 (RRM1). Tissue microarray (TMA) deler ble bygget ved hjelp av kjerne vev biopsi (diameter 2 mm) hentet fra individuelle parafininnstøpte koreanske kreft i bukspyttkjertelen prøver. Biopsier ble inkludert i nye mottakeren parafinblokker med en trephine apparat (Superbiochips Laboratories, Seoul, Sør-Korea). Hvert vev matrise blokk inneholdt opp til 50 kjerner og 2 matriseblokker ble fremstilt i løpet av undersøkelsen.
TMA snitt ble deparaffinized ved hjelp av xylen, rehydrert i alkohol og farget med spesifikke antistoffer som er oppført i Tabell S3. For ERCC1, indikerer H-stillingen fargeintensitet (0 til 3) multiplisert med en faktor bestemt av andelen av positive celler: 0 hvis 0% positive celler, 0.1 hvis 1-9%, 0,5 hvis 10-49%, en hvis 50% positive celler. For alle andre faktorer, positiv farging betydde en signalintensitet lik eller større enn 2 og mer enn 20% av positive celler.
mikroRNA uttrykk
RNA ble isolert fra FFPE- seksjoner ved hjelp av RecoverAll Total Nucleic syre Isolation kit (Ambion, Austin, TX) og fra frosne vevssnitt som rapportert tidligere [38]. RNA (10-100 ng) ble brukt for uttrykk analyse av MIR-21 (italiensk kohort) eller MIR-21, MIR-29, MIR-34a /b /c, la-7a-2, og MIR-155 (koreansk kohort ) av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) med TaqMan-mikroRNA analyser og 7900 HT-Fast real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjelp av små kjernefysiske RNA U66 eller RNU43, som de endogene normalisering kontroller for den koreanske og italienske prøver, henholdsvis. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer og resultater som ikke oppfyller metodiske kvalitetskontroll kriterier ble utelatt. Kvantifisering av relativ mikroRNA uttrykk ble utført ved hjelp av deltaet Ct metoden. Expression ble bestemt som høy når uttrykket nivået var høyere eller lik medianen av kohorten og lavt da var under medianen av kohorten.
In vitro studier
Den menneskelige PDAC cellelinjer BxPc3 , HPAF-II, HPAC, PANC-1 og PL45 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), og ble dyrket i RPMI-1640 medium, supplert med 10% FBS og 1% penicillin (50 IE /ml) og streptomycin (50 ug /ml) (Gibco, Gaithersburg, MD). Celler ble holdt ved 37 ° C under en atmosfære av 5% CO
2 i 75-cm
2 vevsdyrkingskolber (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Tyskland) og høstet med trypsin-EDTA i sin eksponentielt voksende fase. RNA ble ekstrahert ved anvendelse av en Trizol-kloroform-protokoll (Sigma, St. Louis, MO). RNA avkastning og integritet ble sjekket ved å måle optisk tetthet ved 260/280 nm med en Nanodrop® spektrofotometer.
basal uttrykk for MIR-21 ble vurdert ved kvantitativ-Real-Time PCR, som beskrevet ovenfor for PDAC vev . Kvantifisering av MIR-21 uttrykk ble utført ved hjelp av deltaet Ct metoden, normalisere Ct forsterker data med RNU43. Relative MIR-21 uttrykk nivåer ble uttrykt i vilkårlige enheter (AU).
Cell veksthemming av 5-FU (0,1-1000 mm), og gemcitabin (0,1-1000 nM) pluss bestråling (100 cGy) ble bestemt fra tre separate forsøk ved bruk av SRB (sulforhodamin-B) analyse, og ble uttrykt som prosent av kontroll (bærer-behandlede celler) absorbans, korrigert for absorbans, før medikament tillegg, som tidligere beskrevet [39]. For bestråling, ble eksponentielt voksende celler sådd ut i 100 mm vevskulturskåler (Costar), fikk feste i 24 timer, og bestrålt ved hjelp av en 6 MV foton lineær akselerator (General Electric, Buckinghamshire, UK). Etter bestråling ble cellene høstet og 10
4 celler /brønn ble sådd ut i 96-brønners plater og fikk vokse i ytterligere 48 timer i medikamentfritt medium eller behandlet med gemcitabin, som tidligere beskrevet [40]. Den 50% inhiberende konsentrasjon (IC
50) av cellevekst for hver cellelinje ble bestemt ved ikke-lineær minste kvadraters kurvetilpasning av dose-responskurver (GraphPad PRISM versjon 5, intuitiv programvare for Science, San Diego, CA. ). Effekten av MIR-21 på cellevekst og kjemosensitivitet ble evaluert ved å transfektere celler med antisense oligonukleotider (anti-MIR-21) anskaffet fra Ambion-Applied Biosystems (Assay ID, AM10206), ved 30 nM sluttkonsentrasjon. Celler ble sådd ut på 200.000 celler /brønn i 3 ml RPMI med 10% FBS og 1% antibiotika. Etter 24 timer ble cellene eksponert for 9 ul oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) i serumfritt medium, blandet i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av tilsetning av 3 ul 6,25 pM MIR-21-forløperen eller inhibitor. Celler ble også inkubert med miRNA negative kontroller og FAM-merket anti-mir (Ambion). Etter 24 timer ble mediet fjernet fra brønnene og erstattet med RPMI med 10% FBS, uten antibiotika. Deretter ble cellene oppsamlet ved trypsinering og overført til en 96-brønns plate, der de ble tillatt å vokse i ytterligere 48 timer i medikamentfritt medium eller behandlet med 5-FU, som beskrevet ovenfor. ble anvendt for ytterligere kontrollbrønner for RNA-ekstraksjon, som beskrevet ovenfor, mens transfeksjonseffektiviteten med FAM-merket anti-mir kontroller ble evaluert med fluorescens mikroskopi.
Statistiske metoder
Sammenligninger av todelte parametre var mellom to grupper med Fishers eksakte test. En generalisert versjon av Fishers eksakte test ble anvendt for sammenligninger av alder, tumorstadium og differensiering karakter når det deles inn i tre kategorier [41]. Sannsynligheten for total overlevelse (OS) eller sykdomsfri overlevelse (DFS) som en funksjon av tiden ble bestemt ved Kaplan-Meier-metoden, med en log-rank-test benyttet for å bestemme den statistiske signifikansen av forskjellen av Kaplan-Meier-kurver [42], [43] for de univariate prognostiske faktorer analyser, tilfeller der pasienter ble til slutt gruppert i to kategorier, bestemt etter foreløpige evaluering av fire kategorier ved hjelp av kvartiler av fordelingen av gruppering parameter, hadde p-verdien justeres av multiplisere den ujusterte p-verdi på tre. Dette ville forklare den implisitte testing som resulterte i en beslutning om å plassere pasienter i de to kategoriene med en større prognostisk forskjell mellom gruppene. En Cox modell analyse ble utført for å bestemme felles sammenslutning av faktorer i utgangspunktet funnet å ha potensial tilknytning til utfallet i de univariate analysene (evaluering i dette
endelige modellen
bare de parametere med ujusterte p 0,10 fra en logg -rank test) [44]. Alle p-verdier er tosidige, og med unntak som nevnt ovenfor, presenteres uten justering for multiple sammenligninger.
Alle
in vitro
forsøkene ble utført i tre eksemplarer og gjentas minst to ganger. Data ble uttrykt som middelverdier ± SE og analysert ved Students t test og /eller Mann-Whitney-testen. Statistisk signifikans ble satt til p 0,05
Resultater
Kjennetegn på pasientene
Tabell 1 oppsummerer clinicopathological egenskaper.. I den koreanske pasienter, median OS og DFS var 18,1 og 9,1 måneder, henholdsvis. I dette kullet OS var signifikant lenger for pasienter behandlet med adjuvant kjemoterapi og /eller CCRT (n = 52): median overlevelse var 21,3 vs. 14,7 måneder for pasienter behandlet vs. ikke behandlet med adjuvant behandling (n = 27); p = 0,017. Se figur S1 for Kaplan-Meier plott.
Expression analyseresultater
Uttrykk av MIR-21, MIR-34a, MIR-155 og la 7a kunne påvises i alle 82 tilfeller og uttrykk for MIR-29b, MIR-34b, og MIR-34C i 81, 73 og 80 tilfeller, henholdsvis. I samsvar med tidligere studier som viser at Mir-34b og MIR-34C deler den samme transkripsjonspromoter [45], uttrykk verdiene for disse mirnas ble korrelert (data ikke vist). IHC resultater var tilgjengelig for neuropilin og MMP-9 i 80 tilfeller, amfiregulin, HGF, EGFR og TIMP3 i 79 tilfeller, for Ron, CXCR-3, E-cadherin, RRM1, IGF-1R, TS, VEGF, MMP-2- og MMP-7 i 78 tilfeller, for CXCR-4 i 77 tilfeller, for c-Met og Pc-Met i 76 tilfeller, for ERCC1 i 75 tilfeller og for epiregulin i 73 tilfeller.
Som beskrevet i § metoder, for hvert protein vi scoret fargeintensitet og andelen av positivt fargede celler. I figur S2, er representative bilder av immunhistokjemisk farging for P-c-Met vist. Tabell 2 oppsummerer resultatene av immunhistokjemisk farging for alle de undersøkte proteiner.
Univariat analyse
Det er totalt 36 clinicopathological, mikroRNA og protein variabler ble vurdert for deres tilknytning til OS eller DFS i den koreanske kohort. Basert på univariat analyse, ble et sett med 10 og 12 parametere vurdert for evaluering i Cox modeller for OS og DFS, henholdsvis (se tabell S4). Valgte parametre ble også testet i henhold til adjuvant behandling status (tabell S4). I tillegg, for en hvilken som helst parameter, ble populasjonen delt inn i 4 grupper for sammenligning: (1) negativ parameter, ingen adjuvant behandling vs. (2) negativ parameter, adjuvant behandling vs. (3) positiv parameter, ingen adjuvant behandling vs. (4- ) positiv parameter, adjuvant behandling. Tabell S4 viser bare kombinasjoner med en tilhørende p-verdi 0,10. Spesielt ble det en sterk interaksjon mellom MIR-21 ekspresjonsstatus og adjuvant behandling status for OS og DFS demonstrert. Lav MIR-21 ekspresjon var forbundet med lengre OS og DFS i hjelpestoff-behandlede pasienter, med p-verdier på 0,016 og 0,02, henholdsvis, men ikke hos pasienter som ikke behandles med adjuvant terapi (p-verdier på 0,49 og 0,93, henholdsvis). Denne forskjellen sammenheng mellom MIR-21 og behandling status ble støttet ved å sammenligne undergruppe av lav MIR-21, adjuvant behandlede pasienter vs. værende pasienter. Gruppen av pasienter med lav MIR-21 som ble behandlet med adjuvant behandling hadde median OS og DFS på 27,7 og 16,2 måneder, henholdsvis. Gjenværende pasientene hadde median OS på 14,3 og DFS på 7,0 måneder, med p-verdier på 0,002 for OS, og 0,0095 for DFS. Se også figur 1 og figur S3.
Total overlevelse i henhold til Mir-21 status i (A) ikke adjuvant behandlede pasienter og (b) adjuvant behandlede pasienter. Sykdomsfri overlevelse i henhold til Mir-21 status på (C) ikke adjuvant behandlede pasienter og (D) adjuvant behandlede pasienter.
Cens .: sensurert
.
Cox modeller for total overlevelse og sykdomsfri overlevelse
Ved hjelp av en bakover utvalg algoritme, en Cox modellen ble konstruert som inneholder parametere som ble funnet å være i fellesskap forbundet med OS. En annen modell ble identifisert for prognostisk bestemmelse av DFS (tabell 3 og 4). Fra multivariat analyse blant alle pasienter, som den mest signifikant assosiert parameter for både OS og DFS ble pasienter med lav MIR-21 som ble behandlet med adjuvant behandling vist seg å ha en betydelig lavere hazard ratio (HR) for død (0,443, 95% KI: 0,263 til 0,748, p-verdi, 0,002) og for tilbakefall (0,358, 95% KI: 0,188 til 0,682, p-verdi: 0,002) sammenlignet med alle gjenværende pasienter. I motsetning til hos pasienter som ikke behandles med adjuvant behandling, lavere enn median MIR-21 uttrykk var ikke assosiert med en signifikant forskjellig HR for dødsfall eller tilbakefall av 0,880, p-verdier 0,76 og 0,30 kroner.
Sammenligning av kovariatene henhold til adjuvant behandling vs. ubehandlede pasienter
Siden tilfeller ikke ble randomisert til behandling i denne studien ønsket vi å finne ut om det var signifikante forskjeller i kovariat fordeling mellom pasienter behandlet og ikke behandlet med adjuvant behandling (tabell S5). Den eneste signifikante forskjellen var en lavere median alder i adjuvant behandlede gruppen på 61 år (range: 45-75 år) vs. 66 år (range: 49-83 år) i den ubehandlede gruppen (p-verdi: 0.002, Wilcoxon to sampler test). Se tabell S6 for differensial protein uttrykk. I tillegg har vi bygget separate Cox modeller for pasienter behandlet med adjuvant behandling vs. pasienter som ikke ble behandlet med adjuvant behandling. Først gjorde vi en univariat analyse i begge gruppene (Tabeller S7 og S8). Cox modell Analysen viser at bare i undergruppen av adjuvant behandlede pasienter MIR-21 status lav var assosiert med en betydelig lavere HR for død og tilbakefall (Tabell 5, Tabell 6, tabell 7 og tabell 8). I undergruppen av ikke adjuvant behandlede pasienter, positiv angiolymphatic invasjon og uttrykk for MIR-34a over medianen var assosiert med økt HR for død og tilbakefall, henholdsvis, mens MIR-21 ikke har en tilstrekkelig lav p-verdi for inkludering i endelige modellen.
Sammenligning av kovariatene ifølge Mir-21 uttrykk
Distribusjon av clinicopathological og IHC kovariater ble sammenlignet mellom lav MIR-21 og høye MIR-21 pasienter, som rapportert i tabell 9 og tabell S9. Median alder i lav MIR-21 gruppen var 63 år (range: 45-83 år), ikke signifikant forskjellig fra den høye MIR-21 gruppen, median alder 64 år (range: 46-78 år), p-verdi: 0,94 . Imidlertid, var det en trend mot en mer avansert AJCC stadium (IIa vs Ilb) i høy MIR-21 ekspresjon gruppen (p-verdi: 0,07). Tilsvarende var det flere tilfeller med dårlig differensiering karakter i høy MIR-21 gruppen, selv om denne gruppen inneholdt også flere tilfeller med godt differensierte tumorer (Tabell 5). Vi kunne ikke bekrefte en tidligere rapportert sammenslutning av MIR-21 og TIMP3 uttrykk [46], mens vi fant ut at Pc-Met og VEGF uttrykk var betydelig mer vanlig i Mir-21 høye tilfeller (Tabell S9).
Som høy MIR-34a uttrykk ble vist å være assosiert med redusert DFS har vi i tillegg sammenlignet fordelingen av clinicopathological og IHC kovariater mellom lav MIR-34a og høye MIR-34a pasienter. Høy uttrykk for MIR-34a var sterkt forbundet med høy ekspresjon av fosfor-c-Met (p-verdi: 1x10E-6). I tillegg ble høy MIR-34a uttrykk forbundet med lav ekspresjon av HGF (p-verdi: 0,01), så vel som høy ekspresjon av VEGF (p-verdi: 0,01). Endelig lav MIR-21 uttrykk ble oftere observert i MIR-34a lave tilfeller. (P-verdi: 3x10E-8)
Høy MIR-21 uttrykk viser sammenheng med økt fjernt tilbakefall
Deretter sammenlignet vi frekvensen av lokale kontra fjernmetastaser av sykdom i lav kontra høy uttrykk gruppe av MIR-21. I høy MIR-21 ekspresjon gruppen hadde 25 av 41 pasienter (61%) tilbakevendende sykdom i et fjerntliggende område som var signifikant forskjellig fra den lave MIR-21 ekspresjon gruppe hvori bare 12 av 38 pasienter (32%; med tre pasienter tapt for oppfølging) opplever fjernmetastaser (p-verdi: 0,013). Til sammenligning, i gruppen som fikk adjuvant behandling 25 av 51 pasienter (49%) hadde tilbakevendende sykdom. Dette var ikke signifikant forskjellig fra gruppen ikke ble behandlet med adjuvant behandling med 11 av 26 pasienter (42%) opplevde fjernmetastaser (p-verdi: 0,63, med 5/82 pasienter mangler på grunn av utilstrekkelige data)
Selv om det ikke er statistisk signifikant, høy MIR-21 uttrykk viste også en trend mot høyere stadium og positiv lymfeknute status (tabell 5).
Validering kohort
en serie på 45 resected bukspyttkjertelen adenokarsinom pasienter , alle behandlet med adjuvant gemcitabin, ble brukt til å validere prediktiv rolle MIR-21 uttrykk i kaukasiere. Median OS og DFS var 20,4 og 18,7 måneder, henholdsvis. Se tabell 1 for clinicopathological parametere (italiensk kohort). MiR-21 uttrykk ble observert hos alle prøver. Univariat analyse viste en trend mot signifikant sammenheng mellom fattig tumor differensiering og kortere OS (p-verdi: 0,07), mens forekomsten av nevrale infiltrering ble marginalt forbundet med betydelig kortere DFS (p-verdi: 0,047), men ikke OS (p- verdi: 0,90), som rapportert i tabell S10. Alder, kjønn, scene, lymfeknute, og vaskulær infiltrasjon var ikke forbundet med utfallet. Pasienter med høy MIR-21 uttrykk hatt en betydelig kortere OS, dvs. median 15,6 sammenlignet med 24,4 måneder hos pasienter med MIR-21 uttrykk nivå dårligere enn median (p-verdi: 0,006). Median DFS av pasienter med høyt MIR-21 uttrykk var 14,0 måneder, sammenlignet med 23,8 måneder hos pasienter med lav MIR-21 uttrykk (p-verdi: 0,0042). Se figur 2 for Kaplan-Meier-kurver. Cox-modeller ble bygget som bekreftet sammenslutning av MIR-21 ekspresjonsstatus og overlevelse varighet, med høy MIR-21 uttrykk, som den eneste gjenværende faktor, assosiert med økt HR for døden på 3,538 (95% KI: 1,415 til 8,849; p -verdi: 0,007) og tilbakefall på 4,008 (95% KI: 1,385 til 11,595; p-verdi: 0,01). Samlet analyse av de to kohortene bekreftet betydelig prediktiv betydningen av MIR-21 uttrykk status, som rapportert i Tall S4 og S5.
(A) Total overlevelse i henhold til Mir-21 status og (B) sykdomsfri overlevelse status i henhold til Mir-21 status.
Cens .: sensurert
.
MiR-21 og antiproliferative effekter av 5-FU i PDAC celler
Uttrykk av MIR-21 ble påvist i alle PDAC celle linjer, som strekker seg fra 4,5 i PL45 celler til 1,5 au i BxPC-3-celler (figur 3A). En doseavhengig inhibering av cellevekst ble observert, både etter 5-FU, og gemcitabin pluss strålebehandling, som vist i figur 3B-C. Spesielt, 5-FU behandling resulterte i en beskjeden inhibisjon av cellevekst i PANC-1 og PL45 celler, med IC
50-årene av 138,4 ± 23,4 uM og 174,2 ± 31,1 uM, respektivt. Blant de undersøkte cellelinjer, BxPC3 og HPAF-II var den mest følsomme for gemcitabin og 5-FU, henholdsvis, mens PL45 var den mest motstandsdyktige mot både 5-FU og gemcitabin pluss radioterapi.
(A) MiR -21 ekspresjon i 5 PDAC cellelinjer. Ekspresjon ble bestemt ved kvantitativ PCR, ved hjelp av delta-Ct-metoden med RNU-43 som referanse, og verdiene er i au. (B-C) Representative kurver av veksthemmende effekter av 5-FU (B) og gemcitabin pluss strålebehandling (C) , 48-timers legemiddeleksponering. (D). Celler ble sådd ut ved 10
4 /brønn og den anti-proliferative effekter ble evaluert ved bruk av SRB-analysen, som beskrevet i fremgangsmåtene. Den midlere IC
50-verdier for 5-FU (48 h kontinuerlig eksponering) var som følger: 36,3 um (BxPC-3), 30,9 um (HPAF-ll), 138,4 um (PANC-1) og 174,2 uM (PL45 ); mens IC50-verdiene for gemcitabin (i celler forbehandlet med 100 cGray) var 2,1 nM (BxPC-3), 3,4 nM (HPAF-II), 10.2 nM (PANC-1) og 11,4 nM (PL45).
