Abstract
Om lag 40% av endetarms kreft Harbor aktivere K-RAS mutasjoner, og disse mutasjonene er assosiert med dårlig klinisk respons på kjemoradioterapi. Vi forsøkte å identifisere lavmolekylære inhibitorer (SMIs) som synergistisk med ioniserende stråling (IR) ( «radiosensibiliserende midler») som kan innarbeides i eksisterende behandlingsstrategier for lokalt avansert rektalkreft (LARCs) som uttrykker mutante K-RAS. Vi først optimalisert en high-throughput analyse for å måle individuelle og kombinerte effekten av SMIs og IR som gir lignende resultater til gullstandarden kolonidannelse analysen. Ved hjelp av denne screening plattform og K-RAS mutante endetarmskreft cellelinjer, testet vi SMIs rettet mot ulike signalveier for radiosensitizing aktivitet og deretter evalueres vår øverste treff i oppfølgingsforsøk. De to mest potente radiosensibiliserende var Chk1 /2-hemmer AZD7762 og PI3K /mTOR-hemmer BEZ235. Det kjemoterapeutiske middel 5-fluoruracil (5-FU), som brukes til å behandle LARC, synergized med AZD7762 og forbedret bestrålingssensibilisering av AZD7762. Denne studien er den første til å sammenligne ulike SMIs i kombinasjon med IR for behandling av K-RAS mutant endetarmskreft, og våre funn tyder på at Chk1 /2-hemmere bør vurderes i nye kliniske studier for LARC.
Citation : Kleiman LB, Krebs AM, Kim SY, Hong TS, Haigis KM (2013) komparativ analyse av radiosensibiliserende for K-RAS Mutant Endetarms Kreft. PLoS ONE 8 (12): e82982. doi: 10,1371 /journal.pone.0082982
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 29 juli 2013; Godkjent: 29 oktober 2013; Publisert: 12.12.2013
Copyright: © 2013 Kleiman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av American Cancer Society (MGO-114877 til KMH og PF-11-260-01 til LBK) og av et pilotprosjekt stipend fra Proton Beam Federal Del program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Anslagsvis 1,2 millioner mennesker over hele verden er diagnostisert med tykktarmskreft (CRC) hvert år, og rundt 600.000 mennesker dør av sykdommen [1]. Mer effektive behandlingsalternativer er et presserende behov. Lavgradig CRC kan kureres med kirurgi alene, mens senere stadium kreften er i tillegg behandlet med en kombinasjon av kjemoterapi, IR, og målrettet behandling, avhengig av anatomiske området og iscenesettelse av svulsten. Målrettet behandling (SMIs og monoklonale antistoffer (mAbs)) påvirker signalveier abnormt aktiveres i kreftceller og er sakte på vei inn i klinikken for behandling av ulike kreftformer, enten som monoterapier eller annet å forbedre svar på standarden på behandlinger. Tre slike legemidler (alle mAbs) er godkjent for behandling av metastatisk CRC: cetuximab og panitumumab, som hemmer epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR, et medlem av ErbB familien av reseptor tyrosin kinaser) og showet fordel bare for K-RAS villtype kreftformer, og bevacizumab, som hemmer angiogenese-fremme vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [2]. Disse mAbs har så langt ikke påvist nytte for lokalavansert sykdom [3,4], og ingen målrettet terapi er godkjent for ikke-metastatisk CRC.
På grunn av deres anatomiske beliggenhet, kirurgiske reseksjoner er mer utfordrende for endetarmskreft sammenlignet med tykktarmskreft, og det er derfor en større risiko for lokalt tilbakefall [5,6]. Preoperativ strålebehandling reduserer lokale tilbakefall og brukes i kombinasjon med cellegift for å behandle LARC [7,8]. Ikke desto mindre, bare 10% av disse pasientene oppnår en patologisk fullstendig reaksjon (PCR) og en tredjedel dør i løpet av 5 år [9,10]. Strategier for å forbedre respons tar sikte på å øke den cytotoksiske effekten av IR til tumorcellene uten tilsvarende å påvirke normalt vev, for å minimalisere behandlings bivirkninger. Identifisering av chemoradiosensitizing narkotika er spesielt relevant for ~ 40% av endetarmskreftpasienter som havn K-RAS-mutasjoner [8]. Mutant K-RAS har blitt grundig knyttet til radioresistance i humane kreftcellelinjer [11-17]. Videre responsen av LARC pasienter for å kjemoradioterapi er svært variabel, med noen pasienter som viser PCR og andre en minimal respons. K-ras-mutasjoner er mer vanlig hos pasienter med ikke-PCR [18], som er forbundet med redusert sykdomsfri overlevelse [10].
K-RAS er en liten GTPase som fungerer nedstrøms av celleoverflatereseptorer , slik som EGFR, og veksler mellom en inaktiv, GDP-bundet tilstand og en aktiv, GTP-bundet tilstand [19]. GTP-bundet K-RAS aktiverer ulike signalkaskader, inkludert den kanoniske Raf-MEK-ERK (MAPK) og PI3K-Akt-mTOR veier, for å regulere cellulære prosesser som proliferasjon og overlevelse. Mutasjoner i K-RAS er oftest funnet i kodon 12 og 13 og kompromiss GTP hydrolyse stimulert av GTPase aktiverende proteiner (hull), noe som resulterer i hyperaktiv K-RAS og ukontrollert spredning [19].
IR produserer forskjellig DNA-lesjoner, med de mest fremtredende er DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB), og ofte arresterer cellene ved det G1-S og G2-M-overgang av cellesyklusen for å tillate DNA-reparasjon [20]. Hvis det er store eller uopprettelig skader, kan cellene dør ved apoptose eller nekrose eller gjennomgå mobilnettet senescence [21]. Radioterapi kan forbedres ved å modulere DNA-reparasjon, cellesykluskontrollpunkter, eller signaloverføringsveier slik som MAPK eller PI3K trasé [22,23]. Likevel er den optimale strategi for å innlemme målrettet terapi i behandlingsregimer uklart. I denne studien optimalisert vi en høy gjennomstrømming bestrålingssensibilisering skjermen for endetarmskreft cellelinjer og identifisert radiosensitizing narkotika for K-RAS mutante endetarms kreft.
Materialer og metoder
Cell kultur og narkotika løsninger
DLD-en og HCT116 tykktarm kreft celler ble oppnådd fra Vogel laboratorium (Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, Baltimore, MD). Endetarms og bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble oppnådd fra Center for Molecular Therapeutics (Massachusetts General Hospital, Boston, MA). DLD-1 og HCT116-celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS. Rektal og bukspyttkjertelcancercellelinjer ble dyrket i DMEM /F-12 supplert med 5% FBS. Se tabell S1 for cellelinje informasjon og tabell S2 for legemiddelinformasjon.
Narkotika og strålebehandlinger
Dagen etter såing celler, ble mediet erstattet med media som inneholder kjøretøy eller narkotika, og IR ble brukt 2 timer senere med en JL Shepherd Mark I Modell 25 irradiator med en Cs-137-kilde. Sham bestrålt (0 Gy) kontroller ble behandlet nøyaktig på samme måte som bestråles prøvene, bortsett fra at ingen stråling ble brukt. Det er ingen kant brønner av 96-brønners plater ble benyttet for analyse. Drug-holdige media ble erstattet annenhver dag, men bestrålingssensibilisering resultatene var like når medikamentet ikke ble erstattet.
Colony formasjon analysen
Celler ble sådd i 6-brønners plater slik at hver brønn inneholdt på minst 20 kolonier som ble minimalt rørende etter 2-3 uker. Celler ble fiksert og farget i 30 minutter med en blanding av 6% glutaraldehyd og 0,5% krystallfiolett i destillert vann. Platene ble skannet og kolonier med minst 50 celler ble telt ved hjelp ImageJ. De overlevende fraksjon (SF) etter medikament- og IR-behandlinger ble definert som: (Plating effektivitet x antall kolonier dannet) /(antall celler belagt), hvor pletteringseffektiviteten for en gitt cellelinje ble definert for den tilsvarende kontrollbehandling som: (antall kolonier) /(antall celler sådd ut).
CyQUANT
CyQUANT direkte celleproliferasjonsanalyse (Life Technologies, Molecular Probes) ble utført i 96-brønners plater i henhold til produsentens instruksjoner, bortsett fra at CyQUANT direkte Nucleic Acid Flekk ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 1: 1000 og CyQUANT direkte Bakgrunn Suppressor i ved 1: 200, og inkubasjonstiden var 30 minutter. Fluorescens ble målt med en SpectraMax M5 fluorescens plateleser (Ex /Em = 485 /538nm). Bakgrunnssignal fra brønner med media, men ingen celler ble trukket ut.
Hoechst farging og analyse
Celler i 96-brønners plater ble løst i 10 minutter i 4% paraformaldehyde og farget med Hoechst nukleinsyre stain 33 342 (Molecular Probes) fortynnet 1: 40.000 i PBS i 30 minutter. For hver brønn, ble bildene oppnådd med en Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop på fire steder i avstand 100 um fra hverandre og deretter analysert med CellProfiler2 Cell bildeanalyse programvare (www.cellprofiler.org). De gjennomsnittlige kjerner teller for de fire bilder av hver brønn ble anvendt for videre analyse.
Cell telle
Cellene ble sådd ut i 6- eller 12-brønners plater og ved slutten av forsøket ble løsnet ved hjelp av trypsin /EDTA og samlet i vekstmedier. Cellesuspensjonen ble fortynnet 1: 1 i 0,2% trypanblått og cellekonsentrasjonen og levedyktighet ble vurdert ved hjelp av en Nexcelom Cellometer Auto T4 celleteller. Antall levende celler ble brukt for videre analyse.
CellTiter-Glo
CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet Assay (Promega) ble utført i 96-brønners plater i henhold til produsentens instruksjoner , bortsett fra at 1/4 av anbefalt mengde CellTiter-Glo Reagens ble brukt per brønn. Bakgrunnssignal fra brønner med media, men ingen celler ble trukket ut.
Beregning av overlevende fraksjoner
SFs er beskrevet som brøkdel av celler gjenværende etter behandling. Gjennomsnitt av triplikate eksperimenter ble plottet og de Feilstolpene representerer standardavviket. Data ble normalisert til bilen pluss humbug IR. For plott av data etter IR behandling, å ta hensyn til virkningene av stoffet alene, narkotika pluss IR var i tillegg normalisert til narkotika pluss humbug IR for hver legemiddelkonsentrasjon (representert ved en stiplet linje på verdien 1). En SF for narkotika pluss IR mindre enn SF for bilen pluss IR antyder synergi. Student t-tester ble brukt for å vurdere om de gjennomsnittlige SFs for behandlinger og kontroller var signifikant forskjellig. p-verdier ≤ 0,05 for narkotika pluss IR behandling i forhold til kjøretøykontroll pluss IR er merket med en stjerne i tallene.
Western blotting
Western blotting ble utført ved hjelp RIPA lysebuffer og standard metoder. For spaltes PARP-målinger, ble flytende cellene samlet opp hver gang ble mediet skiftet, og ved slutten av forsøket, og etter lysis kombinert med lysat fra de adherente celler. Membraner ble inkubert med primære antistoffer fortynnet i Odyssey blokkeringsbuffer over natten ved 4 ° C, vasket i PBS inneholdende 0,1% Tween-20, og inkubert i 1 time ved romtemperatur med sekundære antistoffer fortynnet 1: 10000 i Odyssey blokkeringsbuffer. Membraner ble skannet med en LI-COR Odyssey termiske kameraer og Odyssey 2.1 programmet ble brukt for kvantifisering. Se tabell S3 for en liste over de antistoffer som brukes.
Cellesyklus profilering
Celler ble sådd i 6-brønners plater og etter behandling ble vasket i PBS, trypsinert, og samlet i media. Alle påfølgende trinn ble utført på is eller i en sentrifuge satt til 4 ° C. Cellene ble sentrifugert ved 1500 rpm i 5 minutter, og vasket i PBS, og deretter ble resuspendert i Mg2 + – og Ca2 + -fri PBS. 95% EtOH ble tilsatt dråpevis under virvling på lav hastighet, og cellene ble lagret ved -20 ° C inntil bruk. Cellene ble deretter sentrifugert i 5 minutter ved 2000 opm, vasket to ganger i PBS, resuspendert i 1 mg /ml RNaseA, og deretter overført til FACS rør. Propidiumjodid (PI) fortynnet i PBS ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på PI 1 ug /ml. Celler ble holdt i mørket inntil analysert på en LSR II quad-laser cytometer kjører FACSDiva programvare (BD Immunocytometry). FlowJo versjon 7.6 ble brukt til å analysere data med Dean-Jett-Fox (DJF) matematisk modell.
Resultater
Optimalisering av high-throughput analysen (HTA)
effekten av stråling på dyrkede cellelinjer er vanligvis vurdert gjennom en kolonidannelse assay (CFA). Denne tilnærmingen er ikke mottagelig for high-throughput-analyse, men fordi det er tidkrevende, kostbare og krever betydelig optimalisering for hver cellelinje og behandling. Som sådan, vår opprinnelige målet var å optimalisere en HTA for å måle respons på narkotika og IR. Først må vi genereres en henvisning datasett med CFA, hvor celler ble sådd i 6-brønns plater, ble en rekke IR doser påført på den etterfølgende dag, og antallet kolonier ble bestemt 2 uker senere. Deretter ble cellene sådd ut i 96-brønners plater, ble IR påført på den etterfølgende dag, og antallet levedyktige celler ble bestemt ved den CyQUANT analyse etter 3 til 8 dager (Figur S1). 1 uke tidspunkt for 96-brønners plater produsert tilsvarende resultater som i CFA.
Vi fant at behandling av enkelte endetarmskreft cellelinjer med IR og /eller SMIs forårsaket kjerner og celler for å forstørre og flat. I disse tilfellene CyQUANT og andre vanlige sprednings analyser som er basert på DNA-innhold (f.eks Syto-60) produsert en unøyaktig avlesning av celle nummer som tydelig uenige med hva vi har observert ved visuell inspeksjon. Denne effekten var spesielt slående for IR-behandlet RCM-1 celler (Figur S2A), men ikke for SW837 celler. Vi besluttet å farge kjerner i 96-brønners plater med Hoechst, bilde platene, og estimere deretter antall celler i hver brønn ved å segmentere kjerner med CellProfiler programvare. Denne analysen produsert kvalitativt lignende resultater til celle teller en uke etter IR (lav gjennomstrømning) og CFA for begge cellelinjer (figur S2B). Protokollen ( «HTA») brukes for bestrålingssensibilisering skjermen er vist i Figur S3.
bestrålingssensibilisering skjermen
De legemidler valgt for skjermen påvirker ulike signalveier, for eksempel de med en kjent rolle i radiosensibilisering, så vel som de som er antatt å være hyperactivated i kreft, men uten en etablert rolle i strålingsrespons. Vi inkluderte narkotika i onkologi rørledninger på store farmasøytiske selskaper med lovende prekliniske eller kliniske data. I noen tilfeller ble flere legemidler rettet mot samme vei inkludert for å sammenligne deres potensialer og å ta rollen som off-target effekter. Det endelige valg av legemidler omfattet 28 SMIs (tabell 1). Vi brukte medikamentkonsentrasjoner som varierer fra 10 nM til ~ 1 uM, siden disse er typisk klinisk oppnåelige konsentrasjoner. IR doser varierte fra 2 Gy til 8 Gy siden LARC pasientene ofte får fraksjonerte doser av 1,8 Gy IR, men noen ganger får høyere doser
. Drug
Primær target
GefitinibEGFRAZD8931pan-ErbBGDC-0941PI3KBKM120pan-PI3KBEZ235PI3K/mTORGDC-0980PI3K/mTORPerifosineAKT/mTORSorafenibRaf/VEGFR/etc.PLX4032Raf (V600E) Raf265Raf /VEGFRCI-1040MEKAZD6244MEKGSK1120212MEKPD325901MEKSP600125JNK IILY2228820p38DovitinibFGFR/PDGFRAbt888PARPAT-406IAPsAZD1480JAK1/2PD0332991CDK4/6AZD7762Chk1/2KU-55933ATMVorinostatHDACAUY922Hsp90AZD1152Aurora kinaseSunitinibmultiple targetsMidostaurinmultiple targetsTable 1. Stoffer vurderes som enkle midler og kombinert med stråling i skjermen.
CSV ned CSV
K-RAS mutant endetarmskreft cellelinjer SW837 og RCM-en ble brukt til skjermen, og resultatene er vist i fig S4. Den SMIs hadde et bredt spekter av potenser med MEK-inhibitorer generelt å være den sterkeste på egenhånd (figur S5a). Vi brukte to tiltak for å kvantitativt karakter bestrålingssensibilisering. Først må vi beregnet graden av bestrålingssensibilisering ved å sammenligne forskjellene i SfS som følge av SMI behandling med og uten IR (for eksempel figur S5b). For det andre har vi brukt Bliss uavhengighet (BI) for å finne ut om effekten er antagonistisk, additiv eller synergistisk. BI legger til grunn at virksomheten til SMI og IR er gjensidig utelukkende. Den forventede kombinerte effekt (F
Cexp) er det fraksjonelle produkt av virkningene av de individuelle behandlinger. Forskjellen mellom F
Cexp og den observerte kombinerte effekten (F
Cobs) avgjør om de to behandlingene er antagonistisk (F
Cexp F
Cobs), additiv (F
Cexp = F
Cobs), eller synergistisk (F
Cexp F
Cobs). Ingen antagonisme (negativ BI verdi) ble påvist mellom noen SMI og IR. BI-verdier for de seks sterkeste radiosensibiliserende midler er illustrert i figur 1. Kun den PI3K /mTOR-inhibitor BEZ235 og sjekkpunktet kinaser 1 og 2 (Chk1 /2) inhibitor AZD7762 synergized med 2 Gy IR i begge cellelinjer.
BI verdier tilsvarer (F
Cexp – F
Cobs) x 100 og ble beregnet basert på rådata fra skjermen avbildet i figur S4. Medikamentkonsentrasjoner varierte fra 10 nM til 1.25μM. Bestrålingssensibilisering ble ikke betraktet som om de overlevende fraksjon (SF) etter medikamentbehandling alene var mindre enn 0,125, da et synergistisk effekt av kombinasjonen med IR ikke kan påvises. Selv om CI-1040, Raf265, og GDC-0980 var litt radiosensitizing, de ble ikke tatt med i oppfølgingsstudier siden andre hemmere av de samme trasé (AZD6244 og BEZ235) utstilt mer potent synergi.
for de fem-hemmere brukes som retter seg mot PI3K /Akt /mTOR vei, SW837 celler var mer følsomme for stoffet alene, mens RCM-1 celler ble sterkere radiosensitized. Alle disse stoffene minst litt radiosensitized RCM-1 celler på 8 Gy IR, men bare BEZ235 ble sterkt radiosensitizing på 2 Gy IR. På den annen side, alle fire hemmere rettet mot MEK var mer potent på egen hånd i RCM-1 celler og viste en trend mot svak bestrålingssensibilisering av RCM-en, men ikke SW837 celler.
BEZ235 og AZD7762 radiosensibilisere
bestrålingssensibilisering ble bekreftet for BEZ235 og AZD7762 av CFA (figur S6). Disse SMIs radiosensitized over et spekter av IR doser så lave som 0,5 eller 1 Gy (figur S7). Siden 1,8 Gy IR er vanligvis administrert i fem påfølgende dager for flere uker i løpet av behandling for LARC, spurte vi om SMIs fortsatt radiosensitizing med fraksjonerte doser av IR. Vi vurderte først effekten av å benytte 2 Gy IR på fire påfølgende dager, men dette igjen for få celler som gjenstår for bestrålingssensibilisering analyse (figur S8A-B). Likevel våre resultater antydet at stoffer som er radiosensitizing med en anvendelse av IR er også radiosensitizing ved bruk av denne protokollen (data ikke vist). For å være i stand til å evaluere effektene av sammenhengende dager med IR, anvendt vi 0,5 eller 1 Gy på fire påfølgende dager. Vi oppdaget lignende bestrålingssensibilisering av BEZ235 og AZD7762 som når IR ble påført en gang (figur S8C-D).
De fleste bukspyttkjertel kreft havn K-RAS-mutasjoner [19], og disse svulstene er ofte behandlet med strålebehandling. For å undersøke omfanget av våre funn, ble oppfølgingsstudier utført med bare to andre etablerte endetarmskreftcellelinjer (SW1463 og bil-1) og med bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Alle disse linjene havn K-RAS-mutasjoner unntak for bil-1 celler. BEZ235 sterkt radiosensitized alle endetarmskreft cellelinjer, men bare svakt radiosensitized en bukspyttkjertelkreft cellelinje (PANC-1) på 2 Gy IR (Figur 2A). AZD7762 radiosensitized alle endetarmskreft cellelinjer, men bare de MiaPaca-2 kreft i bukspyttkjertelen celler på 2 Gy IR (figur 2B). AZD7762 har blitt evaluert primært for kreft i bukspyttkjertelen i kombinasjon med gemcitabin, og MiaPaca-2 celler blir oftest brukt i disse pre-kliniske studier [24,25]. Bestrålingssensibilisering ble også påvist i PATU8988T celler på 5 Gy IR (figur 3), en dose som blir evaluert i kliniske studier. Likevel, bukspyttkjertelkreft cellelinjer viste en mer variabel respons på AZD7762 i nærvær av IR forhold til endetarms kreft cellelinjer, og våre data tyder på at BEZ235 og AZD7762 kan mer universelt radiosensibilisere endetarms kreft.
Effekter av BEZ235 ( A) eller 250nm AZD7762 (B) en uke etter IR. Ulike konsentrasjoner av BEZ235 ble brukt avhengig av følsomheten for hver cellelinje til BEZ235 behandling i fravær av IR (pancreatic linjene var mer følsomme for BEZ235): 250nm for SW837, RCM-en, og SW1463 celler, 50 nM for bil-en og CAPAN-1-celler, 25 nm for PANC-1-celler, og 1 nM for PATU8902 og PATU8988T celler. HTA ble anvendt for rektale kreftcellelinjer og CAPAN-1-celler, og celletelling ble anvendt for de gjenværende linjer.
Venstre
Data er normalisert til bilen pluss humbug IR behandling (effekter av SMIs i fravær av IR).
Høyre
Data er normalisert til tilsvarende ikke-bestrålte kontroller. p-verdier ≤ 0,05 for IR pluss SMI behandling i forhold til IR pluss kjøretøy kontroll er angitt med stjerner.
CellTiter-Glo Analysen ble utført en uke etter IR.
Venstre
Data er normalisert til bilen pluss humbug IR behandling (effekter av SMIs i fravær av IR).
Høyre
Data er normalisert til tilsvarende ikke-bestrålte kontroller; fylte søyler representerer effekten av IR alene. p-verdier ≤ 0,05 for IR pluss SMI behandling i forhold til IR pluss kjøretøy kontroll er angitt med stjerner.
5-FU synergizes med AZD7762 og forbedrer bestrålingssensibilisering
En SMI innlemmet i en klinisk studie for LARC pasienter vil gis samtidig med IR og 5-FU-basert kjemoterapi [3]. Antimetabolitter så som 5-FU og gemcitabin inhiberer DNA-replikasjon og resultere i et S-fase arrest. AZD7762 behandling var synergistisk med 5-FU i de rektale kreftcellelinjer i fravær av IR (figur 4A (se data for 250nm AZD7762) og S9), men ingen synergi ble påvist for BEZ235 og 5-FU (figur S10). Videre er 5-FU forbedret bestrålingssensibilisering av AZD7762, men ikke ved BEZ235 (figur 4B (se data for 50 nM AZD7762) og S10). Vi fokuserte derfor på AZD7762 som den mest lovende chemoradiosensitizer.
HTA resultater for SW837 celler er vist. Se figur S10 for data om RCM-1 celler og BEZ235 behandling. (A) Dataene er normalisert til bilen pluss humbug IR. (B) Dataene er normalisert til tilsvarende ikke-bestrålte kontroller. p-verdier ≤ 0,05 for IR pluss SMI behandling i forhold til IR pluss kjøretøy kontroll er angitt med stjerner.
Kombinasjonsbehandling av AZD7762 og IR fremmer DNA skade og apoptose
IR-indusert DSB sin detekteres av serin /treonin proteinkinaser ataxia telangiectasia mutated (ATM) og ATM og Rad 3-relaterte kinase (ATR), som fosforylerer mange intracellulære substrater, inkludert Chk1 /2, H2AX og p53 [26]. Chk1 og Chk2 er serin /treonin kinaser som spiller viktige roller i respons til DSB sin ved å opprettholde den S- og G2-fase sjekkpunkter og regulere homolog rekombinasjon reparasjon [26,27]. ATR phosphorylates Chk1 på S317 og S345, som katalytisk aktiverer Chk1 og fører til autofosforylering på S296, og ATM phosphorylates Chk2 på T68, som fører til Chk2 homodimerization og autofosforylering på T383, T387 og S516 [28,29]. Chk1 kinase hemmere øker fosforylering av Chk1 S345 grunn av ATR aktivering og redusert defosforylering av PP2A [30,31]. Tilsvarende Chk2 kinase hemmere øker fosforylering av Chk2 T68, som er ATM-avhengige og regulert av flere protein fosfataser [32].
Våre resultater i endetarms kreft cellelinjer er i samsvar med disse veletablerte effekter av Chk1 /2-hemmere og AZD7762. Chk1 og Chk2 aktivitet (Chk1 pS296 og Chk2 pS516) ble hemmet av AZD7762 i nærvær og fravær av IR (Tall S11A og S12A), noe som indikerer at stoffet effektivt blokkert sine mål. Fosforylering av Chk1 og Chk2 på ATM /ATR-mediert sider (Chk1 pS345 og Chk2 pT68) økte følgende AZD7762 behandling (Tall S11B og S12B). Fosforylering av Chk1 på S345 er kjent for å fremme Chk1 proteolytisk nedbrytning [33], og vi fant ut at AZD7762 redusert Chk1 nivåer (Figur S11C).
Kreftceller ofte mister sin G1 sjekkpunkt, for eksempel gjennom mutasjon av svulsten suppressor p53, og er mer avhengig av G2 sjekkpunkt og Chk1 /2 aktivitet [22]. Chk1 /2 tømming eller inhibering, spesielt i p53-manglende celler, opphever den G2 checkpoint indusert av genotoksiske midler og forhindrer den reparasjon av DNA, til slutt fører til mitotiske katastrofe og apoptose eller begynnende alderdom [20,28]. Mangel på DNA-reparasjon er vanligvis påvises ved langvarig fosforylering av histon-varianten H2AX på S139, som er hurtig fosforylert av ATM, ATR eller DNA-PK i respons til DSB sin [34]. Faktisk fant vi at AZD7762 behandling avskaffet IR-indusert G2 arrest (figur S13) og førte til økt fosforylering av H2AX (γH2AX) og apoptose i endetarms kreft cellelinjer (figur 5 og S14).
Western blotting resultater for RCM-1-celler er vist. Se figur S14 for kvantifisering og data på SW837 og SW1463 celler. Antallet dager post-IR er indikert. (A) DNA DSB som indikert ved γH2AX nivåer. (B) apoptose som indikert av spaltede PARP nivåer.
AZD7762 er en mer potent radiosensitizer enn andre ATM-Chk1 /2-hemmere
Vi fant at andre legemidler rettet mot ATM-Chk1 /2 er ikke så god som AZD7762 på radiosensitizing endetarmskreft cellelinjer. AZD7762 radiosensitized på rundt 40 ganger lavere konsentrasjon enn ATM inhibitor KU-55933 (figur 6). Flere Chk1 og Chk2 hemmere er i pre-klinisk utvikling og tidlige kliniske studier [26]. Vi sammenlignet AZD7762 til to andre som er kommersielt tilgjengelig (SCH900776 og LY2603618) [35]. AZD7762 er tilsvarende potent mot Chk1 og Chk2 in vitro (IC
50 = 5nM og mindre enn 10 nM, respektivt), mens SCH900776 er selektiv for Chk1 (IC
50 = 3 nM) over Chk2 (IC
50 = 1.5μM), og LY2603618 er rapportert å være en selektiv inhibitor Chk1 men det er ingen publiserte data [20]. AZD7762 radiosensitized og hemmet Chk1 aktivitet på en 10 ganger lavere konsentrasjon enn SCH900776 og LY2603618 (figur 7), selv om minst AZD7762 og SCH900776 har lignende in vitro bindingsaffiniteter for Chk1.
CellTiter-Glo Analysen ble utført med SW837 celler en uke etter IR. Dataene er normalisert til tilsvarende ikke-bestrålte kontroller. p-verdier ≤ 0,05 for IR pluss SMI behandling i forhold til IR pluss kjøretøy kontroll er angitt med stjerner.
(A) CyQUANT Analysen ble utført med SW837 celler en uke etter IR. SCH900776 og LY2603618 er Chk1 hemmere. Dataene er normalisert til tilsvarende ikke-bestrålte kontroller. p-verdier ≤ 0,05 for IR pluss SMI behandling i forhold til IR pluss kjøretøy kontroll er angitt med stjerner. (B) SW837-celler ble behandlet med bærer eller SMI to timer før IR, og protein lysater ble oppsamlet i tre timer post-IR. Chk1 og Chk2 autofosforylerings steder ble målt ved Western blotting.
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å identifisere nye behandlingstilbud for LARC pasienter med K-RAS-mutasjoner ved å optimalisere en høy -throughput analyse og screening et panel av SMIs rettet mot ulike signalveier for bestrålingssensibilisering. Vår underliggende forutsetning for dette arbeide var at en SMI med en synergistisk virkning på kreftceller i kombinasjon med stråleterapi er mer ønskelig enn en som har en sterkt cytotoksisk effekt på egen hånd. Vi identifiserte seks SMIs at radiosensibilisere K-RAS mutante endetarmskreftceller: BEZ235 (PI3K /mTOR-hemmer), AZD7762 (Chk1 /2-hemmer), AZD8931 (pan-ErbB reseptor hemmer), AT-406 (hemmer av apoptose protein (IAP) familie hemmer), AZD6244 (MEK hemmer), og Abt888 (PARP hemmer). Selv om andre inhibitorer av ErbB-reseptorer og anti-apoptotiske proteiner er blitt vist å bli radiosensitizing [23], AZD8931 og AT-406 har ikke tidligere blitt rapportert å være radiosensibiliserende midler. BEZ235 og AZD7762 var de mest potente radiosensibiliserende midler og vi fokusert på disse to stoffer.
BEZ235 har vist seg å radiosensibilisere tumorer av forskjellige vev, inkludert glioblastomer, fibrosarkomer, og NCSLC cellelinjer som bærer K-ras-mutasjoner [36- 38]. BEZ235 normaliserer også tumor blodkar i xenograft eksperimenter, som fører til forbedret svulst perfusjon, oksygenering, og svar på strålebehandling [36]. Forskjellige mekanismer er blitt foreslått for å forklare den radiosensitizing effekt ses med BEZ235, selv innenfor samme cellelinje (H460-celler): oppheving av IR-indusert G
2 og apoptose [37], og økt G
2 rest og begynnende alderdom [39]. Felles for alle artikler som beskriver en radiosensitizing virkning av BEZ235 er forsinket reparasjon av DNA-skade. Her viser vi for første gang at BEZ235 fungerer som en potent radiosensitizer av endetarms og bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Celler med PIK3CA aktive mutasjoner eller tap av PTEN tumorsuppressorgenet er mer følsomme for BEZ235 enn celler som mangler disse mutasjonene [40], og den høye følsomheten PATU8902 og PATU8988T celler til BEZ235 kan forklares med deres PTEN mangel (tabell S1). Inhibering av PI3K og mTOR ved BEZ235 synes å være en lovende terapeutisk tilnærming, spesielt i kombinasjon med IR for kreft i endetarmen. Det har vært noen kliniske studier med BEZ235 for CRC eller kombinert med IR (www.clinicaltrials.gov).
AZD7762 har vist seg å radiosensibilisere ulike kreftcellelinjer in vitro og i xenograft modeller av abrogere G2 sjekkpunkt og hemme DNA-reparasjon. AZD7762 har først og fremst blitt evaluert for kreft i bukspyttkjertelen, men har også vist seg å radiosensibilisere prostata, lunge, bryst, tykktarm og kreftceller [24,25,41-43]. Normale humane fibroblaster og tynntarmen epitelceller ikke radiosensitized av AZD7762 [25,42].
Ingen tidligere studier har sammenlignet bestrålingssensibilisering av AZD7762 og andre hemmere, og vi fant ut at det er en bedre radiosensitizer av endetarmskreftceller enn inhibitorer av andre proteiner som er involvert i responsen til genotoksiske midler, så vel som andre inhibitorer av ATM-Chk1 /2 pathway. AZD7762 har markert forskjellige effekter sammenlignet med kontrollpunktet kinase inhibitorer SCH900776 og LY2603618 ved at den er den eneste som reduserer levedyktighet på egen hånd ved 1 uM (via DSB og apoptose; data ikke vist), og det er den sterkeste radiosensitizer. Den enkleste forklaringen på disse forskjellene er at AZD7762 hemmer Chk2 mens de to andre rusmidler ikke gjør det, og at Chk2 spiller en viktig rolle i radiosensitizing endetarmskreftceller. Imidlertid har mange studier (hovedsakelig basert på siRNA knockdown) foreslo at kjemo- og bestrålingssensibilisering er mediert av Chk1 og i mye mindre grad Chk2, og at effekten av AZD7762 er på grunn av sin hemming av Chk1 [20,24,44- 46]. Det er uklart om Chk2 spesifikke hemmere besitter betydelig kjemo- og radiosensitizing aktivitet [47-49]. Videre viser vi at AZD7762 er en sterkere hemmer av Chk1 enn SCH900776 og LY2603618. Således er den sterkere bestrålingssensibilisering av AZD7762 sannsynlig på grunn av dens forbedrede virkninger på Chk1, og, i mindre grad, dens inhibering av Chk2.
Vi fant at AZD7762 synergized med 5-FU og at 5-FU forbedret bestrålingssensibilisering av AZD7762.
