Abstract
Bakgrunn og formål
Selv om gen-modifisering av T-celler til å uttrykke tumor-relatert antigen-spesifikke T-celle-reseptor (TCR) eller kimære antigen-reseptor (CAR) har klinisk påviste lovende, gjenstår det fortsatt rom for å forbedre den kliniske effekten av re-rettet T -celle basert antitumor adoptiv terapi. For å oppnå mer objektive kliniske respons ved hjelp av ex vivo-utvidet tumor-responsive T-celler, infused T-cellene må vise tilstrekkelig lokalisert infiltrasjon i svulsten.
metodikk /hovedfunnene
Menneske lungecancerceller varierende uttrykker et tumorantigen, Wilms tumor-genproduktet 1 (WT1), og en inflammatorisk kjemokin, CCL2. Imidlertid, CCR2, den aktuelle reseptor for CCL2, er sjelden som uttrykkes på aktiverte T-lymfocytter. En HLA-A2402
+ human lungekreft cellelinje, LK79, som uttrykker store mengder av både
CCL2 Hotell og
WT1
mRNA, ble ansatt som et mål. Normale CD8
+ T-celler var retroviralt genmodifisert til å uttrykke både CCR2 og HLA-A * 2402-begrenset og WT1
235-243 nonapeptid spesifikke TCR som en effektor. Anti-tumor-funksjonalitet mediert av disse effektor-celler mot LK79-celler ble vurdert både in vitro og in vivo. Endelig virkningen av CCL2 på WT1-epitop-responsive TCR-signalisering medieres av effektorcellene ble undersøkt. Innført CCR2 ble funksjonelt validert ved bruk av genmodifiserte Jurkat-celler og human CD3
+ T-celler både in vitro og in vivo. Dobbelt genmodifisert CD3
+ T-celler demonstrert både CCL2-tropisk svulst trafficking og cytocidale reaktivitet mot LK79 celler in vitro og in vivo. CCL2 utvidet den WT1 epitop-responsive TCR signal vist med relevant luciferase produksjon i doble genmodifiserte Jurkat /MA celler til å uttrykke luciferase og WT1 spesifikke TCR, og CCL2 også doseavhengig utvidet WT1 epitop-responsive IFN-γ produksjon og CD107a uttrykk mediert av disse dobbelt gen-modifiedCD3
+ T-celler.
Konklusjon /Betydning
Introduksjon av CCL2 /CCR2 aksen hell forsterkes hos vivo kreft reaktivitet anti-lunge mediert av CD8
+ T-celler dobbel genmodifisert til å uttrykke WT1 spesifikke TCR og CCR2 ikke bare via CCL2-tropisk svulst menneskehandel, men også CCL2 forbedret WT1-respons
Citation. Asai H, Fujiwara H, An J , Ochi T, Miyazaki Y, Nagai K, et al. (2013) Co-Introdusert Funksjonell CCR2 Potenserer In Vivo Anti-Lung Cancer Funksjonalitet mediert av T-celler Double genmodifisert til Express WT1-spesifikke T-celle reseptor. PLoS ONE 8 (2): e56820. doi: 10,1371 /journal.pone.0056820
Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 30 september 2012; Godkjent: 14 januar 2013; Publisert: 18 februar 2013
Copyright: © 2013 Asai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan til HF og MY, og en Grant-in-Aid for kreftforskning fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds til MIN. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne unntatt SO, JM og HS har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer. SO og JM er ansatt av Takara Bio, Inc .. HS er utstyrt med forskningsmidler fra Takara Bio, Inc .. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
til tross for nylige terapeutisk fremgang, fortsatt den totale overlevelsen av pasienter med avansert lungekreft dårlig [1], og derfor utforskning av nye behandlingsformer er fortsatt en ønskelig mål. Resultater fra kliniske studier med anti-tumor adoptiv behandling ved hjelp av ex vivo-utvidede tumor-responsive T-celler, har i hovedsak tumor-infiltrerende T-lymfocytter (TIL), for behandling av avansert melanom vist en imponerende klinisk respons. På den annen side er det visse ulemper, slik som kompleksiteten av prosedyrene og vanskeligheten med å opprettholde terapeutisk kvalitet av langsiktig-dyrkede T-celler [2]. Siste tekniske fremskritt som involverer genmodifikasjoner å innføre tumor-responsive reseptorer inn i terapeutiske T-celler – for eksempel tumor antigen-spesifikke T-celle-reseptor (TCR) og kimære antigen-reseptor (CAR) – i stor grad overvunnet disse ulemper [3] – [5 ]. Men som utvalget av passende responsive svulster er fortsatt begrenset, har vi foreslått noen nye alternativer, for eksempel HLA-A * 2402-begrenset WT1 spesifikke TCR [6] og HLA-A * 0201-begrenset Aurora kinase A (AURKA) -spesifikk TCR [7], for behandling av human leukemi. En annen teknisk fremskritt har vi foreslått en ny TCR vektorsystem som samtidig leverer shRNAs for endogen TCR α /p-gener (siTCR vektor) [8], og dermed redusere dannelsen av mispaired TCR, den potensielle risiko for dødelig akutt GVHD [9].
WT1 er et velkjent anti-tumor antigen uttrykt i varierende grad av humane lungekreftceller [10], og WT1 uttrykk har vist seg klinisk for å ha prognostisk verdi i lungekreftpasienter [11]. Ved hjelp av en xenopodet musemodell, har vi tidligere har utforsket anti-lungekreft terapeutiske potensial av en ex vivo-ekspanderte klonal cytotoksisk T-cellelinje (CTL) [12], TAK-1, som spesifikt gjenkjenner den WT1
235-243 nonamer epitop i sammenheng med HLA-A * 2402 [13].
på den annen side, er utilstrekkelig infiltrasjon av terapeutiske T-celler til tumor lokaliserte områder en begrensende faktor for vellykket behandling [14]. For å øke tumor handelen aktiviteten av infusert terapeutiske T-celler, er deres respons til passende kjemokiner produsert av tumorceller eller tumor-infiltrert immunceller nødvendig. Først av Kershaw et al. [15], en serie av prekliniske studier basert på dette konseptet har blitt utført [16] – [19]. Imidlertid gjenstår det viktigste spørsmålet som chemokin-kjemokinreseptor par bør velges for klinisk anvendelse fortsatt å være avgjort. I foreliggende studie for å undersøke de potensielle fordeler ved ko-innføring av en kjemokin-kjemokinreseptor aksen for antitumor adoptiv immunterapi, benyttet vi som en modell genetisk omdirigert T-celler som målretter WT1 for behandling av human lungekreft.
i denne studien fant vi at CC chemokine 2 (CCL2) ble produsert til varierende grader av humane lungekreftcellelinjer, og at LK79, en HLA-A * 2402
+ småcellet lungekreft (SCLC) cellelinje overekspresjon
WT1
mRNA, produsert ekstremt høye mengder CCL2. LK79 ble drept av CD8
+ T celler genmodifisert til å uttrykke WT1 spesifikke TCR stammer fra TAK-en. På den annen side, CCR2, den spesifikke reseptoren for CCL2, ble nesten ikke uttrykkes på følgende transfektanter. Til sammen dataene antydet at for å demonstrere vår proof-of-concept, ville det være fornuftig å benytte CCR2-2CCl aksen i innstillingen for omdirigert T-celler rettet mot WT1 og lungekreft. Fordi behandling av SCLC er fremdeles utfordrende [20], vurderte vi at bruk av LK79, en SCLC cellelinje, som et mål, kan åpne en ny vei for terapi for SCLC.
I denne studien har vi undersøkt i detalj kreft funksjonaliteten anti-lunge mediert av dobbel-transfektert CD8
+ T-celler til å uttrykke WT1-spesifikke TCR og CCR2 mot LK79 celler, både in vitro og in vivo. Basert på våre observasjoner, diskuterte vi den kliniske gjennomførbarheten av denne strategien for adoptiv immunterapi mot human lungekreft.
Materialer og metoder
1. Etikk Uttalelse
Godkjenning for denne studien ble innhentet fra Institutional Review Board of Ehime universitetssykehus. Skriftlig informert samtykke ble gitt av alle friske frivillige i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Alle in vivo museforsøk ble godkjent av Ehime universitetet dyr omsorg komiteen.
2. Celler
Jurkatceller (ATCC) og humane lungekreftcellelinjer positive for enten HLA-A * 2402
+, WT1 mRNA, eller begge var ansatt. Sistnevnte inngår LC99A (stor celle karsinom opprinnelse) [21], LK79 (småcellet karsinom) [21], RERF-LC-A1 (plateepitelkarsinom) [21] og LC11-18 (adenokarsinom) [22]. PC-9 (adenokarsinom) [21] var positive for HLA-A * 2402
+ men negativt for WT1 mRNA, SQ-1 (plateepitelkarsinom) [21], LC65A (småcellet karsinom) [21], QG56 (plateepitelkarsinom) [21], LK87 (adenokarsinom) [21], og 1-87 (adenokarsinom) [21] var negative for HLA-A * 2402. Alle disse tidligere publiserte lungekreftcellelinjer ble vennlig levert av Dr. Akio Hiraki (Okayama universitet Graduate School, Okayama, Japan), og kultivert som rapportert tidligere [12]. Jurkat /MA cellelinje (vennlig levert av professor Erik Hooijberg, Vrije Universiteit Medisch Centrum, Amsterdam, Nederland) er en Jurkat cellekloning tidligere etablert av professor Erik Hooijberg og kolleger som mangler endogen TCR uttrykk og stabilt uttrykker både menneskers CD8a genet (
hCD8α
) og en
NFAT-luciferase
genkonstruksjonen for påvisning av signalering via nylig introduserte TCR [23].
HLA-A * 2402
gen-transduserte C1R cellelinje (C1R-A24) ble også dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt kalveserum og 0,5 mg /ml hygromycin B (Invitrogen). B-lymfoblastoid-cellelinjer (B-LCLer) ble etablert ved transformasjon av perifere blod-B-lymfocytter med Epstein-Barr virus. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra friske frivillige ble isolert og lagret i flytende nitrogen inntil bruk.
3. Mus
Seks uker gamle NOD /SCID /γc
null (nog) hunnmus ble kjøpt fra Sentralinstitutt for forsøksdyr [24] og vedlikeholdes i den institusjonelle dyret anlegget på Ehime University.
4. Strømningscytometri
overflatemarkører av transfektanter eller ikke-gen-modifisert T-celler ble merket med anti-CD8, anti-CD4, anti-CD3 og anti-CD45 mAb (BD Biosciences), anti-CD25 og anti- CD69 mAbs (BioLegend), anti-Vβ5.1 mAb (Beckman Coulter), anti-CCR2 mAb (R Deretter ble galv-pseudotyped retrovirale vektorer fremstilt ved sekvensiell transfeksjon av disse vektorene inn i PG13 cellelinje (Takara Bio).
6. Transduksjon av
TCR Hotell og
CCR2
gener
Jurkat /MA celler og friske donor T-celler ble genmodifisert til å uttrykke WT1 spesifikke TCR og CCR2 som beskrevet tidligere [ ,,,0],6]. I korthet, på dag 1, 1 x 10
6 T-celler per brønn i GT-T503 (Takara Bio) med 5% humanserum, 0,2% humant albumin, 50 U /ml rekombinant humant IL-2 (R ATCC) eller et kontroll anti-HLA-DR mAb (L243; ATCC). Etter 5 timers inkubering med effektorceller, ble 100 ul av supernatanten samlet fra hver brønn. Prosentandelen av spesifikke lysis ble beregnet som:. (Eksperimentell frigjøring CPM-spontan frigjøring kpm) /(maksimal frigjøring CPM-spontan frigjøring kpm) x 100 (%)
10. IFN-γ sekresjon analysen
Fem hundre tusen dobbel-transfektert normale perifere CD8
+ T-celler som uttrykker både WT1 spesifikke TCR og CCR2 ble co-inkubert med 1 × 10
5 WT1 peptid-pulset (1 uM) eller unpulsed C1R-A24-celler i 24 timer i forskjellige konsentrasjoner av CCL2. IFN-γ i kultursupernatanten ble på lignende måte målt ved anvendelse av et ELISA-sett (R forskjeller på
p
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
1. Produksjon av ulike mengder av CCL2 hos humane lungekreft-cellelinjer, og sjelden ekspresjon av den tilsvarende reseptoren CCR2 på T-celler aktivert ved hjelp av OKT-3 og IL-2
Uttrykket profiler av de 12 valgte kjemokin mRNA produsert av hver av de humane lungekreft-cellelinjer vurdert ved QRT-PCR er oppsummert i tabell 2. som vist i figur 1A, forskjellige mengder av CCL2 protein ble produsert i alle lungecancer cellelinjer vurderes, blant hvilke LK79, en SCLC-cellelinjen , produsert særlig store mengder CCL2. Den tilsvarende reseptor, CCR2, ble sjelden uttrykt på overflaten av både hvilende T-celler eller de som er aktivert ved hjelp av OKT-3 /IL-2 (n = 5). Aktiverte T-celler ble inngjerdet med CD69 positivitet. Et representativt eksempel mellom 5 tilfeller er vist i figur 1B. Nivåene av ekspresjon for hvile og aktiverte celler var: CD8, 0,83 ± 0,72% og 0,75 ± 0,51%, og CD4, 0,66 ± 0,45% og 0,5 ± 0,26% (gjennomsnitt ± SD), respektivt. I tillegg QRT-PCR avslørte at uttrykket nivåer av
CCR2
mRNA i aktiverte og hvilende T-celler (n = 5) var ikke forskjellig i enten CD4
+ eller CD8
+ T-celler (data ikke vist). På den annen side, effektor CD8
+ T-celler dobbelt-transfektert for å uttrykke HLA-A * 2402-begrenset og WT1
235-243 spesifikke-TCR hell drepte kandidat human lungecancercellelinjer i et HLA-A * 2402-begrenset måte (fig. 1C og 1D). Sett i sammenheng, viser resultatene at det valget av CCR2-CCL2 aksen og sammenkoblingen av CTL som omfatter effektorceller gen-modifisert til å uttrykke WT1-spesifikk TCR med LK79 målceller som var følsomme for den cytocidale aktivitet mediert av den transfekterte CTL var rimelig egnet for å demonstrere proof-of-concept av denne studien. Følgelig er disse dobbelt-transfektert effektor CD8
+ T-celler forbundet med target LK79-celler ble anvendt i de etterfølgende eksperimenter.
(A) ELISA-analyse avslørte at 10 human lunge-cancercellelinjer undersøkt produsert forskjellige mengder CCL2 i kultursupernatanten. Feilfelt representerer SDS. (B) På analog måte til transduksjon av WT1-spesifikke
TCR
genet, CD69-positive CD8
+ og CD4
+ T-celler aktivert ved hjelp av IL-2 og OKT-3 sjelden vises celleoverflate CCR2. Et representativt eksempel på 5 tilfeller er vist. (C) CD8
+ T celler genmodifisert til å uttrykke HLA-A * 2402-begrenset og WT1
235-243 nonamer spesifikke TCR vises hell cytocidale aktivitet mot kreft celle lunge linje celler i en HLA-A * 2402-begrenset måte, som bestemmes av standard
51 Cr frigjøring analysen. Feilfelt representerer SDS. MFI indikerer gjennomsnittlig fluorescens intensitet, N.D indikerer mindre enn synlig. (D) En slik canceraktivitet anti-lunge (v LK79 og LC99A) ble inhibert av anti-HLA-klasse I rammeverk mAb (klon w6 /32), men ikke med anti-HLA-DR mAb (klon L243), igjen illustrerer at den innførte WT1 spesifikke TCR-mediert tumorici-dal aktivitet var HLA-klasse i-begrenset. Feilfelt representerer SDS. (E) Tetramer analyse viste at effektorceller anvendt i disse forsøkene var positive for WT1 /HLA-A * 2402-tetramer. HIV /HLA-A * 2402 tetramer ble ansatt som en negativ kontroll.
2. Funksjonell validering av
introdusert CCR2
For det første ble funksjonell validering av introduserte CCR2 utført ved bruk av
CCR2
-transfected Jurkatceller (Jurkat /CCR2) i Transwell eksperimenter. Jurkat /CCR2, men ikke paren Jurkat-celler, som vises med hell CCL2-mediert migrasjon aktivitet på en doseavhengig måte. Figur 2 viser antall celler som migrerer i forhold til den ved en CCL2 konsentrasjon på 12,5 ng /ml. Jurkat /CCR2-celler vises på samme måte migrering aktivitet mot LK79, LK87, LC11-18, LC65A og LC99A celler sådd i de nederste brønner i henhold til nivået av CCL2 produseres av hver cellelinje (Fig. 1A). Endelig er dette kjemotaksi mediert av Jurkat /CCR2 mot LK79 ble fullstendig inhibert av anti-CCR2-mAb (fig. 2B). Deretter bruker en xenopodet NOG musemodell, tumor antigen-uavhengig in vivo tumor menneskehandel formidlet av
CCR2 Hotell og
luciferase
dobbel-transfektert normale CD3
+ T-celler ble undersøkt ved hjelp av bioluminesens bilde . En dag etter intravenøs infusjon, disse luciferase-merket CCR2-uttrykke CD3
+ T-celler begynte å hope seg opp på stedet av inokulerte LK79 celler i fremre bukveggen, mens luciferase-merket CD3
+ T-celler mangler CCR2 var dispergert gjennom hele kroppen i løpet av observasjonsperioden (fig. 2C). Neste, validering av funksjon av dobbel-transfektert normal CD8
+ T-celler til å uttrykke både WT1 spesifikke TCR og CCR2 ble gjennomført. Først vurderte vi om co-innføring av CCR2 svekket den WT1 spesifikke cytocidale aktivitet mot lungekreft celler mediert av dobbel-transfektert effektor CD8
+ T-celler. Som vist i figur 3A og 3B, WT1-peptid-responsive cytocidale aktivitet og kreft aktivitet anti-lunge mot HLA-A * 2402
+ LK79-celler (men ikke som mot HLA-A * 2402
– LK87 celler som negativ kontroll) mediert av disse effektorceller, blir dobbelt-positiv for Vβ5.1 og CCR2 (fig. 3C), ble ikke svekket i forhold til den formidlet av WT1-spesifikke
TCR
enkelt-transfektert CD8
+ T-celler (fig. 1C). Neste, den kombinerte antitumor funksjonalitet mot LK79 celler mediert av dobbel-transfektert CD8
+ T-celler, som består av både økt tumor trafficking aktivitet og WT1 spesifikke cytocidale aktivitet, ble undersøkt ved hjelp av en modifisert transwell eksperiment. Disse dobbelt-transfekterte CD8
+ T-celler (n = 3), men ikke WT1-si
TCR
enkelt-transfektert CD8
+ T-celler (n = 3), i den øvre vel effektivt migrert inn i bunnen brønnen hvor LK79 cellene var blitt podet og pre-inkubert i 24 timer. Både dobbelt- og WT1-si
TCR
enkelt-transfekterte effektorceller lastet inn i de øvre brønnene var like 90-92% positive for Vβ5.1, og 70-72% av dobbel-transfektanter uttrykt CCR2 (data ikke vist). Derfor signifikant (
p
0,05) flere LK79 celler ble ødelagt av migrert dobbel-transfektert CD8
+ T celler enn av WT1-si
TCR
enkelt-transfektanter, representert ved forhøyede nivåer av LDH i kultursupernatantene (fig. 4A). Ved slutten av disse eksperimentene Transwell, flowcytometrisk analyse viste at 3,4 ganger mer Vβ5.1-positive effektorceller forble i bunnen godt behandlet med dobbelt-transfektert CD8
+ -T-celler 7,91 ± 0,51 (x 10
4 ) for dobbel-transfektanter, og 2,35 ± 0,13 (× 10
4) for single-transfektanter, henholdsvis), som støtter resultatene av LDH analysen. Mikroskopisk undersøkelse bekreftet en større grad av ødeleggelse av LK79 celler i den nedre brønnen etter behandling med dobbelt-transfekterte effektorceller, enn med enkelt-transfekterte celler. Videre demonstrerte konfokal mikroskopi Rødt-merkete migrerte CCR2-uttrykkende effektorceller i bunnen vel bare etter behandling med doble genmodifiserte effektorceller. Et representativt eksempel på tre forsøk er vist i Figur 4B.
(A)
CCR2
-transduced Jurkat-celler, men ikke paren Jurkat-celler, viste en doseavhengig Transwell CCL2-kjemotaksis. Antallet celler som migrerer er vist i forhold til den ved en CCL2 konsentrasjon på 12,5 ng /ml. Feilfelt representerer SDS. (B) Tilsvarende tall ved å migrere
CCR2
-transduced Jurkatceller for hver kreftcellelinje vises. Vandringen av
CCR2
-transduced Jurkat-celler ble åpenbart inhibert av anti-CCR2-mAb, hvilket antyder at antallet av migrerende celler som var avhengig av nivået av CCL2 produseres av hver cellelinje (i fig. 1 A) og Mediated ved introdusert CCR2 på Jurkatceller. Feilfelt representerer SDS. (C) CCL2 baserte target antigen uavhengig in vivo tumor menneskehandel mot inokulert LK79 celler mediert av
CCR2
-transfected CD3
+ T-celler ble demonstrert i en xenopodet musemodell. Intravenøst tilført luciferase-merket CD3
+ T-celler uttrykker CCR2 (CD3 /CCR2 /luc) (nederst), men ikke de som mangler CCR2 (CD3 /luc) (øvre), begynte å vandre mot LK79 celler umiddelbart på dag 1 etter infusjon, og deres målrettede migrasjon ble opprettholdt gjennom hele observasjonsperioden.
(A) Bruke standard
51 Cr frigjøring analysen, disse dobbelt-transfektert effektorceller tilstrekkelig lysert 1fiM WT1 peptid-lastet, men ikke losses, C1R-A24 celler som uttrykte HLA-A * 2402. E /T-forholdet indikerer effector:target ratio. Feil bar indikerer SDS. (B) Disse dobbelt-transfekterte effektorceller også tilstrekkelig lysert HLA-A * 2402
+ LK79 celler, men ikke LK87 celler som mangler HLA-A * 2402-molekyl anvendes som en negativ kontroll. (C) Dobbelt-transfekterte CD8
+ T-celler med hell uttrykt både celle-overflate og CCR2 Vβ5.1, bakterie-linje komponent av WT1-spesifikke TCR β kjede. [15].
