Abstract
mikroRNA-34a (MIR-34a), en potent formidler av tumor suppressor p53, har blitt rapportert å fungere som en tumor suppressor og MIR-34a ble funnet å være nedregulert i prostata kreft vev. Vi studerte de funksjonelle effekter av MIR-34a på c-myc transkripsjons komplekser i PC-3 prostatakreftceller. Transfeksjon av MIR-34a i PC-3 celler sterkt hemmet
in vitro
celleproliferasjon, celle invasjon og fremmet apoptose. Transfeksjon av MIR-34a i PC-3 celler også betydelig hemmet
in vivo
xenograft tumorvekst i nakne mus. MIR-34a downregulated uttrykk for c-myc onkogen ved å målrette sin 3 «UTR som vist ved luciferaserapportørplasmid analyser. MIR-34a ble funnet å undertrykke RhoA, en regulator av celle migrasjon og invasjon, ved å undertrykke c-myc-Skp2-Miz1 transkripsjonen kompleks som aktiverer RhoA. Overekspresjon av c-myc reverseres MIR-34a undertrykkelse av RhoA uttrykk, noe som tyder på at MIR-34a hemmer invasjon ved å undertrykke RhoA gjennom c-myc. MIR-34a ble også funnet å undertrykke c-myc-pTEFB transkripsjon forlengelse kompleks, noe som indikerer en av de mekanismer som MIR-34a har dyptgripende virkninger på cellulær funksjon. Dette er den første rapporten dokumentere at MIR-34a undertrykker montering og funksjon av c-myc-Skp2-Miz1 kompleks som aktiverer RhoA og c-myc-pTEFB kompleks som forlenger transkripsjon av ulike gener, noe som tyder på en ny rolle speil 34a i reguleringen av transkripsjon av c-myc kompleks
Citation. Yamamura S, Saini S, Majid S, Hirata H, Ueno K, Deng G, et al. (2012) mikroRNA-34a modulerer c-myc Transkripsjonell Komplekser for å undertrykke Ondartethet i Human prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (1): e29722. doi: 10,1371 /journal.pone.0029722
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 27 desember 2010; Godkjent: 03.12.2011; Publisert: 03.01.2012
Copyright: © 2012 Yamamura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Grants R01CA138642, T32DK007790 (NIH), VA Forskning Enhancement Award Program (REAP) og Merit anmeldelse tilskudd. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er svært konservert, single strandet, ikke-kodende RNA av omtrent 22 nukleotider som regulerer genuttrykk ved posttranskripsjonelt stanse av bestemte geografiske mRNA, ved å undertrykke oversettelse eller spalte RNA transkripsjoner [1]. mirnas regulerer diverse cellulære prosesser som celle-syklusprogresjon, proliferasjon, apoptose og utvikling. mirnas har blitt vist å fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [2].
p53 tumor suppressor slettes eller mutert i mer enn 50% av humane tumorer og er en viktig molekyl som undertrykker maligniteter [3]. p53 har blitt funnet å målrette MIR-34-familien [4], [5], [6] og ektopisk ekspresjon av MIR-34-genene har dramatiske effekter på celleproliferasjon og overlevelse. Ektopisk MIR-34a forårsaker cellesyklus arrest i G1 fasen [6], [7] og apoptose [7], [8]. Som p53 er funnet å målrette MIR-34a og siden, cellesyklus og apoptose er også ende interessante p53-aktivering, kan MIR-34a genet være en formidler av p53-funksjon.
proto-onkogen c-Myc regulerer celleproliferering og transformasjon både transkripsjonelt og ikke-transkripsjonelt, og blir ofte deregulert i humane cancere [9], [10]. c-myc er en grunnleggende helix-loop-helix og leucine glidelås transkripsjonsfaktor som binder seg til Enhancer Box elementer (E-bokser) og aktiverer transkripsjon av gener som stimulerer cellesyklusprogresjon og cellevekst. c-Myc undertrykker transkripsjon av gener som arrestere cellesyklus, gjennom Miz1, c-Myc tilknyttet protein. c-myc har også en funksjon for å recruite histone acetyltransferases (HATS). c-myc ikke-transcriptionally samhandler med komponenter av replikering maskiner til positivt regulere DNA-syntese, fører til genomisk ustabilitet.
c-myc ble rapportert å aktivere MiR-17-92, en polycistronic mikroRNA klynge bestående av MIR -17, 18a, 19a, 20a, 19b og 92a [11], [12]. MIR-19 ble funnet å være den viktigste onkogene del av denne klyngen, rettet mot tumor suppressor PTEN [13]. MIR-34C har vist seg å ha negativ regulere c-Myc i respons til DNA-skade og for å inhibere c-Myc-indusert DNA-syntese [14]. Under onkogen-indusert senescence, ble Mir-34a også funnet å målrette c-myc [15].
Rho GTPases er små G-proteiner som regulerer ulike cellulære prosesser, herunder cytoskeletal dynamikk, migrasjon, vesikkel trafficking, celleproliferasjon , apoptose, og transkripsjon [16], [17], [18]. Rho GTPases, deres regulatorer, og deres effektorer har blitt foreslått å kontrollere tumordannelse og progresjon. RhoA har vist seg å kontrollere kreft metastase og progresjon [19], [20], [21]. Nylig ble c-myc kompleks funnet å aktivere RhoA genet [22].
Den positive transkripsjon forlengelse faktor b (P-TEFb) regulerer promoter-proksimale pause utgivelsen av forlengelsen fase av transkripsjon av Pol II [23] og integrerer mRNA-syntese med histon modifikasjon, pre-mRNA prosessering og eksport mRNA [24]. P-TEFb er sammensatt av cyclin (CycT1, CycT2a, CycT2b eller CycK) og cyklin-avhengig kinase 9 (Cdk9) [23]. c-myc samhandler med cyclin T1 (CycT1), regulatoriske del av P-TEFb, og styrer forlengelse fase av transkripsjon av Pol II [25], [26], [27].
c- med andre veien er dysregulerte i de fleste humane maligniteter og regulerer tumordannelse og progresjon [28], [29]. c-Met interagerer med hepatocytt-vekstfaktor /spredningsfaktor, og har vært implisert i tumorinvasjon og migrering inkludert PC-3-celler [30], [31], [32], [33], [34], [35].
Vi rapporterer her at Mir-34a ble nedregulert i prostata kreft vev. MIR-34a hemmet celleproliferasjon
in vitro
,
in vivo
tumorvekst og fremmet apoptose i prostatakreftceller. Vi fant også MIR-34a retter seg mot c-Met og hemmer PC-tre celle invasjon. Vi undersøkte effekten av MIR-34a på de to c-myc transkripsjons komplekser. Ved å målrette c-myc, MIR-34a redusert c-myc-Miz-Skp2 kompleks som induserer RhoA transkripsjon og hemmet celle invasjon, som viser at MIR-34a indirekte regulerer RhoA. MIR-34a også undertrykte c-myc-P-TEFb kompleks som spiller en nøkkelrolle i å kontrollere forlengelsen fase av transkripsjon av RNA polymerase II (Pol II), som indikerer en av de mekanismer som MIR-34a har dramatiske effekter på celle funksjon. Våre resultater viser at i prostatakreft PC-3 celler MIR-34a undertrykker montering og funksjon av c-myc kompleks som aktiverer eller elongates transkripsjon, avslører en ny rolle MIR-34a i regulering av transkripsjon av c-myc.
Resultater
MIR-34a uttrykk er nedregulert i prostatakreft
Vi undersøkte uttrykket nivåer av MIR-34a i laser capture microdissected (LCM) prostata kreft vev (n = 10) og matchet tilstøtende normale regioner av real-time PCR. Alle kreftvev viste lavere Mir-34a nivåer sammenlignet med matchede tilstøtende normale regioner, viser at MIR-34a er nedregulert i kreft (Fig. 1a). Histologisk data viser at disse vev er adenokarsinom med Gleason score på 6 eller 7. Gleason mønstre og andre kliniske data er vist i tabell S1.
(A) Relativ MIR-34a uttrykk i laser capture microdissected (LCM) prostata kreftvev (C) og passet tilstøtende normale områder (N). (B) MIR-34a overekspresjon undertrykker myk agar koloni dannelsen av et stabilt transfektert MIR-34a PC-tre cellelinje. Etter 14 dagers inkubering, ble kolonier med mer enn 50 celler tellet. Verdien er normalisert til de av kontrollen. (C) Representative bilder av koloniene. (D) MIR-34a hemmer
in vivo
tumorvekst. Tidsforløpet av tumorvekst i nakne mus etter subkutan injeksjon av et stabilt transfektert MIR-34a PC-3 cellelinje eller kontrollcellelinje. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll. (E) Representative bilder av svulster i nakne mus ved 5 uker etter subkutan injeksjon av et stabilt transfektert MIR-34a PC-tre cellelinje eller kontroll cellelinje. (F) MIR-34a induserer apoptose i PC-3 celler. PC-3 celler ble transfektert med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 3 dager. PC-3-celler ble farget med AnnexinV-FITC /7-AAD og apoptose ble analysert ved flow-cytometri. Dataene viser prosentandelen av tidlige apoptotiske og apoptotiske celler ut av den totale cellepopulasjon av PC-3-celler. *, P . 0,05 sammenlignet med kontroll
Vi har også analysert MIR-34a uttrykk nivåer i ondartet (PC-3, LNCaP og DU145 cellene) og ikke-maligne prostata RWPE-1 celler. Sanntids RT-PCR avslørte at ekspresjonsnivået av MIR-34a var betydelig lavere i PC-3-celler sammenlignet med ikke-ondartet prostata epitelial celle RWPE-1-celler (data ikke vist). Dette resultatet var i overensstemmelse med de tidligere rapporterte data ved hjelp av Prec normale humane prostata epitelceller [36]. Vi sammenlignet også uttrykket nivåer av MIR-34a i maligne prostataceller og laser capture microdissected (LCM) prostata normalt vev (n = 10). Sanntids RT-PCR viste at ekspresjonsnivået av MIR-34a var lavere i maligne prostata-celler sammenlignet med gjennomsnittet av ekspresjonsnivået av MIR-34a i normale vev (data ikke vist). Disse resultatene var også konsistent med tidligere rapporterte data ved hjelp av normale menneskelige vev [37].
MIR-34a hemmer celledeling av PC-3 celler
For å studere effekten av MIR-34a på veksten av prostata kreft celler, vi transient transfektert flere cellelinjer med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a. Den forbigående transfeksjon av pre-MIR-34a økt MIR-34a nivåer i prostata kreft celler (fig. S1 A). MTS-analysen viste at MIR-34a hemmet PC-3-celle proliferasjon med 40% på dag 4, men hadde ingen signifikant effekt på LNCaP og DU145-celler (fig. S2A). En fersk rapport viser at PC-3 celler har karakteristikkene av prostata småcellet karsinom og ikke fra adenokarsinom [38], men vi brukte PC-3 celler for videre studier fordi spredning undertrykkelse effekten av MIR-34a var betydelig, noe som var i samsvar med de tidligere rapporterte data [36]. Transient transfeksjon av pre-MIR-34a også forårsaket betydelige morfologiske endringer i PC-3 celler (Fig. S2B).
Vi ansatt en lentiviral system for å uttrykke MIR-34a. HIV lentiviral system, som uttrykker MIR-34a eller vektorkontroll, ble brukt til å infisere PC-3-celler, og de infiserte celler ble selektert med puromycin. Den stabile transfeksjon av pre-MIR-34a økt MIR-34a nivåer i PC-3 celler (Fig. S1B). Vi utførte myk agar-kolonidannelse analysen ved hjelp av de infiserte PC-3 celler uttrykker Mir-34a eller kontroll. MIR-34a redusert koloni tall til ca 20% av det en kontroll, viser at MIR-34a vesentlig hemmet kolonidannende evne til PC-3 celler (fig. 1B og C).
For å undersøke effekten av ektopisk uttrykk for MIR-34a på
in vivo
tumorvekst, vi subkutant injisert stallen MIR-34a eller kontrollcellelinje inn i nakne mus. Tumorvolumene ble målt hver 7. dag i 5 uker etter injeksjonen. Xenografttumorer fra PC-3 celler som overuttrykker MIR-34a var mindre enn xenografttumorer fra kontrollcellene. Ved uke 5, tumorstørrelser på styre xenotransplantater var omtrent 5 ganger større enn de av MIR-34a xenotransplantater, noe som indikerer at ektopisk ekspresjon av MIR-34a signifikant undertrykket tumorvekst in vivo (fig. 1D og E).
Siden ektopisk uttrykk for MIR-34a trykt PC-tre celleproliferasjon, vi neste studert effekten av MIR-34a på apoptose i PC-3 celler ved hjelp av flowcytometri. Vi fant at ektopisk uttrykk for MIR-34a økt PC-tre celle apoptose til about4 tider med at kontrollene (Fig.1F og S3 fig.), Viser at MIR-34a har apoptotisk aktivitet i PC-3 celler.
MIR-34a hemmer celleinvasjon og migrasjon
Vi utførte en transwell invasjon analysen bruker Matrigel å undersøke effekten av MIR-34a på invasiv evne til PC-3 celler. Vi transient transfektert PC-3 celler med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a og utsettes de transfekterte cellene til Transwell invasjon analysen. Resultatene tydelig viste at MIR-34 redusert invasjon av PC-3-celler til 20% av den av kontrollgruppen (fig. 2A og B). Sårhelende analysen viste også at Mir-34a markert redusert migrasjon av PC-3 celler (fig. 2C og D).
(A) MIR-34a hemmer invasjon av PC-3 celler. PC-3 celler ble transient transfektert med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 48 timer. Cellene ble høstet og underkastet transwell invasjon analysen. Verdien er normalisert til de av NC. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll. (B) Representative bilder av invaderte celler. (C) MIR-34a hemmer sårhelende av PC-3 celler. PC-3 celler ble transient transfektert med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 48 timer. Cellene ble høstet og underkastet sårhelende analysen. Bredden av den gjenværende åpne såret beregnet i forhold til separasjon ved tid 0 timer. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll. (D) Representative bilder av sårtilheling analysen.
MIR-34a mål c-myc og c-Met
Onkogener, c-Met og c-myc, har spådd bindende nettsteder for MIR-34a i sine 3′-UTR (fig. S4). c-Met har to spådd bindingsseter for MIR-34a i sin 3′-UTR (Fig. S3). Vi klonet de antatte MIR-34a mål i 3’UTRs inn en luciferase konstruere. Luciferaserapportørplasmid analyser med MIR-34a-uttrykke PC-3 celler viste at Mir-34a trykt luciferase aktivitet. Mutasjon av de antatte MIR-34a målse i disse UTR redusert respons på MIR-34a. Disse resultatene indikerer at MIR-34a binder til 3′-UTR av c-myc og c-Met (fig. 3A).
(A) PC-3-celler ble transient transfektert med pre-MIR negative kontroll (NC) eller pre-MIR-34a eller pre-MIR-con for 8 timer, etterfulgt av transient transfeksjon med kontroll reporter plasmider eller 3’UTR plasmider for 48 timer. 3’UTR reporter-aktivitet ble målt ved hjelp av luciferase-analysen og normalisert til aktiviteten av Renilla luciferase. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll. (B) PC-3 celler ble transient transfektert med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a eller pre-MIR-con i 72 timer. Protein uttrykk nivå ble analysert ved Western blot.
Vi undersøkte effekten av MIR-34a transfeksjon på protein nivåer av disse genene. Transfeksjon av MIR-34a redusert protein nivåer av c-Met og c-myc, protein i PC-3 celler (fig. 3B). Disse resultatene bekrefter at Mir-34a rettet direkte c-Met og c-myc via binding til sine 3’UTRs i PC-3 celler. MIR-34a også reduserte nivåer av transkripsjonsfaktor E2F1 som regulerer cellesyklusen, DNA-replikasjon og celleproliferasjon (fig. 3B).
MIR-34a inhiberer RhoA og undertrykker montering av c-Myc transkripsjonen kompleks
c-Myc-Skp2-Miz1 transkripsjonen komplekset har blitt funnet å aktivere RhoA genet og for å være kritisk for celleinvasjon og metastasekreft [22]. Siden vi fant ut at c-myc er et mål på MIR-34a, og dermed downregulating uttrykket av c-myc, undersøkte vi om nedregulering av c-myc av MIR-34a resulterer i reduksjon av RhoA uttrykk ved å undertrykke montering av c- myc-Skp2-Miz1 kompleks. Real-time PCR viste MIR-34a redusert RhoA mRNA nivå (fig. 4A) og Western blot viste at Mir-34a redusert RhoA protein uttrykk (Fig. 4B).
PC-3 celler ble transient transfektert med pre -miR negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 72 timer. (A) RhoA mRNA-nivået ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR. (B) RhoA protein-ekspresjon ble analysert ved hjelp av Western blot. (C) c-myc trekker ned endogen Miz1, Skp2 og Max i PC-3 celler. PC-3-celler ble transient transfektert med pre-MIR negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 72 timer og de totale cellelysatene ble immunopresipitert med c-myc-antistoff eller IgG (kontroll), etterfulgt av Western blot-analyse. (D) MIR-34a reduserer rekruttering av c-myc til RhoA arrangøren. PC-3 celler ble transient transfektert med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 72 timer og chip ble utført. *, P . 0,05 sammenlignet med kontroll
Vi utførte immunoprecipitation (IP) for å studere montering av c-myc-Skp2-Miz1 transcriptional kompleks i MIR-34a transfekterte celler. IP (fig. 4C) viste at anti-c-myc immunopresipitater inneholdt Miz1, Skp2 og Max (kolonne 5), men ikke anti-IgG (kontroll) immunpresipitater (spor 3), noe som indikerer at c-myc-Skp2-Miz1 komplekset ble dannet i PC-3 celler. IP viste også at MIR-34a reduserte nivåene av disse komponentene i c-myc immunopresipitater [baner 4 (kontroll) og 6], noe som indikerer at MIR-34a trykkes montering av c-myc-Skp2-Miz1 transkripsjonell kompleks i PC- 3 celler. MIR-34a ikke redusere Skp2 i immunpresipitatene sammenlignet med de andre komponentene.
Vi utførte kromatin immunoprecipitation (chip) analyser for å undersøke om MIR-34a reduserer bindingen av c-myc til RhoA promoter regionen inneholder E -boxes 5 og 6, som er en primær bindingssetet av c-Myc [22]. Brikken Analysen viste at endogen c-Myc binder til E-bokser 5 og 6 og kontrollforsøk viste at RNA-polymerase II binding til glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) promoter ble ikke forandret (fig. 4D). Disse resultatene antydet at MIR-34a redusert rekruttering av c-Myc-Skp2-Miz1 komplekset til RhoA promoteren og reduserer RhoA uttrykk.
Overekspresjon av c-Myc reverserer inhibering av invasjon
for å avgjøre om hemming av invasjon av MIR-34a kan bli reversert via restaurering av c-myc, transfektert vi PC-3 celler med et c-myc uttrykk plasmid sammen med pre-MIR-34a. c-Myc overekspresjon delvis reddet RhoA ekspresjon (Fig. 5A, sammenlign spor 4 til 3) og MIR-34-indusert undertrykkelse av invasjon (fig. 5B), noe som tyder på at MIR-34a hemmer invasjon, i det minste delvis, via RhoA reduksjon av målretting c-myc.
(A) PC-3 celler ble transient transfektert med pCMV6-ENTRY eller pCMV6-ENTRY-c-myc for 8 timer fulgt av transient transfeksjon med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 72 timer. Proteininnholdet ble analysert ved hjelp av Western blot. (B) c-myc uttrykk delvis redder hemming av invasjon indusert av MIR-34a. PC3 celler ble transient transfektert med pCMV6-ENTRY (kontroll) eller pCMV6-ENTRY-c-myc for 8 timer fulgt av transfeksjon med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 48 timer. Cellene ble høstet og underkastet transwell invasjon analysen. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll. (C) Representative bilder av invaderte celler.
MIR-34a undertrykker montering av c-myc-P-TEFb kompleks
Den positive transkripsjon forlengelse faktor b (P-TEFb) spiller en nøkkelrolle i regulering av forlengelsesfasen av transkripsjon av RNA-polymerase II (Pol II) [23]. Det er en cyklin-avhengig kinase består av Cdk9 andcyclin. c-myc er blitt vist å interagere med P-TEFb gjennom CycT1 og regulere transkripsjon tøyelighet [25], [26], [27]. Siden MIR-34a er rettet mot c-Myc, utførte vi immunutfelling (IP) for å studere montering av c-Myc-transkripsjons pTEFB forlengelse kompleks i mir-34a-transfekterte PC-3-celler. IP (Fig. 6A) viste at anti-c-myc antistoffet trukket ned CycT1, Cdk9 og Max (kolonne 5), men IgG (kontroll) ikke trekke ned disse proteinene (spor 3), noe som indikerer at c-myc samhandlet med P- TEFb. IP viste også at MIR-34a redusert mengden av p-TEFb i c-myc immunopresipitatene i PC-3-celler [baner 4 (kontroll) og 6], noe som indikerer at MIR-34a trykkes montering av c-myc-P- TEFb kompleks i PC-3-celler.
(A) MIR-34a undertrykker dannelsen av endogen c-Myc-P-TEFb kompleks. PC-3-celler ble transient transfektert med pre-MIR negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 72 timer og de totale cellelysatene ble immunopresipitert med c-myc-antistoff eller IgG (kontroll), etterfulgt av Western blot-analyse. (B) MIR-34a undertrykker CAD og NUC mRNA uttrykk og DRB revereses undertrykkelsen. PC-3-celler ble behandlet med 20 pM av DRB i 12 timer og ble transient transfektert med pre-MIR negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 48 timer. CAD og NUC mRNA nivå ble analysert ved real-time PCR.
c-myc ble rapportert å aktivere transkripsjon av CAD, karbamoyl-fosfat syntase /aspartat transcarbamoylase /dihydroorotase, og NUC ved å stimulere promoter klaring og forlengelse, via rekruttering av P-TEFb [25], [39], [40]. Vi undersøkt hvorvidt MIR-34a påvirket ekspresjonsnivået av CAD og NUC ved hjelp DRB (5,6-di-klor-1-bD-ribofuranosyl-bensimidazole) som spesifikt undertrykker ekspresjon av c-myc-responsive CAD og NUC ved å hemme P-TEFb [ ,,,0],40]. Vi fant ut at Mir-34a redusert CAD og NUC mRNA uttrykk i PC-3 celler mens DRB restaurert uttrykket (Fig. 6B). Disse resultatene indikerer at MIR-34a trykt disse genene ved å undertrykke den c-Myc-pTEFb kompleks.
Overekspresjon av c-Met reverserer inhibering av invasjon
Det er blitt foreslått at MIR-34a inhiberer celle invasjon i en c-Met-avhengig måte [41], [42]. Derfor studerte vi effekten av MIR-34a på c-Met og invasjon siden Mir-34a retter seg mot c-Met (Fig. 1). PC-3-celler ble transfektert med en c-Met ekspresjonsplasmid sammen med pre-MIR-34a. c-Met-ekspresjonsnivåer ble undersøkt ved Western blot som indikerte at c-Met ekspresjon ble øket i c-Met transfekterte celler (Fig. 7A). c-Met fremmet invasjonen i kontrollforsøk. c-Met reversert MIR-34-indusert undertrykkelse av invasjon, noe som indikerer at MIR-34a hemmer invasjon, i det minste delvis, ved å målrette c-Met (fig. 7B og C).
(A) PC-3 cellene ble transient transfektert med pCMV6-ENTRY eller pCMV6-ENTRY-c-Met for 8 timer fulgt av transient transfeksjon med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 72 timer. Proteininnholdet ble analysert ved hjelp av Western blot. (B) c-Met uttrykk delvis redder hemming av invasjon indusert av MIR-34a. PC3 celler ble transient transfektert med pCMV6-ENTRY (kontroll) eller pCMV6-ENTRY-c-Met for 8 timer fulgt av transfeksjon med pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a i 48 timer. Cellene ble høstet og underkastet transwell invasjon analysen. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll. (C) Representative bilder av invaderte celler.
Diskusjoner
I denne studien vi demonstrert for første gang de funksjonelle effekter av MIR-34a på c-myc transkripsjons komplekser i PC- 3 prostata kreft celler. Vi fant ut at Mir-34a uttrykk er nedregulert prostatakreft vev og at Mir-34a re-uttrykk hemmer sterkt celleproliferasjon,
in vivo
xenograft vekst og celle invasjon. Vi viste at MIR-34a hemmet c-Myc ved å binde seg til sin 3’UTR i PC-3-celler og undertrykt montering av c-myc transkripsjonelle komplekser. Mutasjoner av c-myc er funnet i forskjellige kreftformer og dens deregulert ekspresjon fører til ukontrollert ekspresjon av mange gener hvorav noen regulerer celleproliferering og resulterer i tumorutvikling [43], [44]. Selv om c-Myc alene er ikke i stand til å transformere celler og krever en samvirkende onkogen, for eksempel ras onkogen [45], i c-Myc en viktig faktor i tumorutvikling. Således er inhibering av c-Myc antatt å være en viktig funksjon av MIR-34a. Vi viste også at Mir-34a hemmet PC-tre celle invasjon ved å målrette c-Met.
Rho GTPases, en familie av små G-proteiner, regulerer intracellulær aktin dynamikk inkludert cellen polaritet, migrasjon, vesikkel menneskehandel etc. Disse molekyler også regulere celleproliferasjon, apoptose, genekspresjon [17]. RhoA, et medlem av Rho familien av GTPases, er innblandet i transformasjon og metastasering. RhoA har vist seg å være en viktig faktor i forbindelse med forskjellige humane cancere [46].
c-Myc-Skp2-Miz1 transkripsjonen komplekset har blitt tidligere vist å aktivere RhoA og å være avgjørende for celleinvasjon og kreft metastase [22]. Vi fant ut at c-myc er et mål på MIR-34a i PC-3 celler, og vi studert effekten av MIR-34a på RhoA aktivering via c-myc-Skp2-Miz1 transkripsjonen kompleks. MIR-34a redusert RhoA uttrykk og overekspresjon av c-myc reversert reduksjon av RhoA og hemming av celle invasjon. ChIP analysen avslørte MIR-34a undertrykker rekrutteringen av c-myc til RhoA arrangøren. Vi viste at Mir-34a trykt RhoA transkripsjon ved å redusere c-myc-Skp2-Miz1 transkripsjonen kompleks. Disse data dokumenterer at MIR-34a undertrykker RhoA aktivering ved initiering av transkripsjon via målretting c-myc. Våre resultater viser at Mir-34a undertrykker montering og funksjon av c-myc kompleks som aktiverer transkripsjon av RhoA.
Den positive transkripsjon forlengelse faktor b (P-TEFb) regulerer promoter-proksimale pause utgivelsen av tøyelighet fase av transkripsjon av Pol II [23]. c-myc samhandler med CycT1, regulatoriske del av P-TEFb, og styrer forlengelse fase av transkripsjon av Pol II [25], [26], [27]. P-TEFb er globalt nødvendig for generering av mRNA og genekspresjon [27], [47] og er rekruttert til gener av forskjellige transkripsjonsfaktorer [23], [48]. Våre resultater viser at MIR-34a undertrykker sammenstilling og funksjon av c-myc-kompleks som forlenges transkripsjon. Det er kjent at P-TEFb er involvert i avvikende transkripsjonen forlengelse i blandet lineær leukemi (MLL) [49], [50]. Ulike tumorcellelinjer overuttrykke P-TEFb og CycT1 overekspresjon fremmer transformasjon og tumorvekst [51]. Vår studie viser her at Mir-34a opphever den c-myc-P-TEFb kompleks ved å målrette c-myc. Samlende bevis har vist betydningen av P-TEFb i malignitet, og dermed knytte MIR-34a til P-TEFb er et betydelig funn i kreft biologi. Vår studie gir delvis rede for globale og dyptgripende virkninger av MIR-34a på de cellulære prosessene vist her og i tidligere rapporter [4], [5], [7], [8].
Så langt som vi vet, har virkningene av microRNAs på sammenstillingen av proteinkomplekser aldri blitt rapportert. Her rapporterer vi virkningene av MIR-34a på montering av c-myc funksjonelle komplekser, c-myc-Skp2-Miz1 og c-myc-P-TEFb komplekser. c-Myc aktiverer en rekke gener som del av et proteinkompleks, regulerer transkripsjonen forlengelse og hovedsakelig virker gjennom forskjellige komplekser med andre proteiner. Virkningene av MIR-34a på disse c-myc funksjonelle komplekser gi konkrete bevis om hvordan MIR-34a funksjoner for å undertrykke c-myc. C-Myc-komplekser som ble indusert ved hjelp av MIR-34a var heterogene ettersom forholdene mellom komponentene var forskjellig fra de i de kontroll immunokomplekser (fig. 4C og 6A). Disse resultatene indikerer at kompleksene ble endret ved MIR-34a, noe som tyder på en ny kompleks sammenstilling. Den endring av c-Myc komplekser ved MIR-34a antyder også at undertrykkelse av sammenstillingen av de c-Myc-komplekser kan innebære ukjente mekanismer i tillegg til den enkle reduksjon i mengden av c-Myc-proteinet ved MIR-34a ettersom speil 34a har dramatiske effekter på celleprosesser.
i konklusjonen har vi vist for første gang at Mir-34a undertrykker montering og funksjon av c-myc-Skp2-Miz1 kompleks som aktiverer RhoA og c-Myc- pTEFB kompleks som forlenger transkripsjon av ulike gener. Derfor avslører vår studie en roman rolle MIR-34a i regulering av transkripsjon av c-myc.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Formalin fiksert, parafin -embedded (FFPE) prostatakreft prøver ble innhentet fra San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF komité for menneskeforskning (Godkjenningsnummer: H9058-35751-01). Alle dyr omsorg var i samsvar med retningslinjene i San Francisco Veterans Affairs Medical Center og studien ble godkjent av San Francisco VA IACUC (Protocol Nummer: 08-003-01).
Cell kultur og transfeksjon
Menneskelige prostata carcinom cellelinjer, PC-3, LNCaP og DU145 og en ikke-ondartet epithelial prostatacellelinje, RWPE-en, ble kjøpt fra The American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Prostatakreft-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). RWPE-1-cellelinjen ble dyrket i keratinocytt-vekstmedium supplert med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor og 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (Invitrogen, Carlsbad, CA)
Celler i 6-brønners plater ble transfektert med 30 nM pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-34a (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner.
Vevsprøver
Formalin fiksert, parafininnstøpte (FFPE) prostatakreft prøver ble innhentet fra San Francisco Veterans Affairs Medical Center. Alle lysbildene ble gjennomgått av et styre sertifisert patolog for identifisering av prostatakreft foci samt tilstøtende normalt glandular Epitel.
Generering av stabilt MIR-34a cellelinjer
En HIV-baserte lentiviral emballasje system med et plasmid som uttrykker Mir-34a eller vektor kontroll ble kjøpt fra GeneCopoeia (Rockville, MD). Lentivirus partiklene ble produsert ved å transfektere lentiviral-ekspresjonsplasmid inn i 293T-celler. PC-3-celler ble infisert med HIV-baserte lentivirus uttrykk MIR-34a eller vektorstyring (1,5 x 10
6 infeksiøse enheter av virus (IFU) (i 20 ul), og de infiserte PC-3-celler ble selektert med puromycin (0,5 ug /ml).
myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen
myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen ble utført ved såing av cellene i et lag på 0,35% agar /RPMI /FBS over et lag av 0,5% agar /RPMI /FBS. RPMI /FBS ble tilsatt hver 5. dag for kontinuerlig å tilføre veksttilskudd til cellene. kulturer ble opprettholdt i en fuktet 37 ° C inkubator. på dag 14 etter såing, ble kolonidannende effektivitet kvantifisert ved lysmikroskopi .
In vivo tumorvekst
utestengelse av stallen MIR-34a uttrykker celler eller kontrollcellene (1 × 10
7 celler i 100 ul RPMI medium) ble subkutant injisert i kvinnelig nakne mus (stamme BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, 4-5 uker gamle) Tumorvolumet volumet~~POS=HEADCOMP ble beregnet på basis av bredde (x) og lengde (y): x
2y /2, hvor x. y
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner . Reverse transkripsjonsreaksjoner ble utført ved hjelp av en Reverse Transcription System Kit (Promega, Madison, WI).
