Abstract
Samler bevis tyder på at metformin, et biguanid klasse av antidiabetiske legemidler, besitter anti-kreft egenskaper. Imidlertid er de fleste av studier for å evaluere terapeutisk effekt av metformin har vært på primærcancer. Ingen informasjon er tilgjengelig om metformin kan brukes effektivt for tilbakevendende kreft, spesielt tykktarmskreft (CRC) som rammer opptil 50% av pasientene som ble behandlet med konvensjonell kjemoterapi. Selv om grunnene for gjentakelse ikke er fullt ut forstått, er det antatt å skyldes gjenveksten av kjemoterapi-resistent cancer stem /stilk-lignende celler (cscs /CSLCs). Derfor vil utvikling av ikke-giftige behandlingsstrategier rettet mot cscs være av betydelig terapeutisk effekt.
I dagens granskingen har vi undersøkt effekten av metformin i kombinasjon med 5-fluorouracil og oksaliplatin (FuOx), den bærebjelke i tykktarm kreftbehandling på overlevelse av chemo-resistente tykktarmskreftceller som er høyanriket i cscs /CSLCs. Våre data viser at metformin virker synergistisk med FuOx til (a) indusere celledød i chemo resistente (CR) HT-29 og HCT-116 tykktarmskreftceller, (b) hemmer colonospheres dannelse og (c) forbedre colonospheres oppløsning.
In vitro
cellekulturstudier har videre vist at kombinatorisk behandling hemmer migrasjon av CR tykktarmskreftceller. Disse endringene var assosiert med øket miRNA 145 og reduksjon i miRNA 21. Wnt /β-catenin signalveien også ble nedregulert som angir dens sentrale rolle i å regulere veksten av CR tykktarmskreftceller. Data fra SCID-mus xenograft modell CR HCT-116 og CR-HT-29-celler viser at kombinasjonen av metformin og FuOX er svært effektiv til å inhibere veksten av tumorer som vist ved ~ 50% inhibering i vekst etter 5 ukers kombinasjonsbehandlingen , sammenlignet med de bærerbehandlede kontrollene. Vår nåværende data tyder på at metformin sammen med konvensjonell kjemoterapi kan være en effektiv behandlingsregime for gjentakende tykktarmskreft (CRC)
Citation. Nangia-Makker P, Yu Y, Vasudevan A, Farhana L, Rajendra SG, Levi E, et al. (2014) Metformin: en potensiell terapeutisk middel mot Regelmessig Colon Cancer. PLoS ONE 9 (1): e84369. doi: 10,1371 /journal.pone.0084369
Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 18 oktober 2013; Godkjent: 22 november 2013; Publisert: 20 januar 2014
Copyright: © 2014 Nangia-Makker et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra NIH (AG014343) og Institutt for Veteran Affairs (I101BX001927). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylig forståelse av den heterogene sammensetningen av kreftceller i en tumor har avslørt tilstedeværelsen av cscs /CSLCs [1], [2], som oppviser selvpolerende egenskaper, evnen til å initiere tumor fra et lite antall av celler som er svært chemo-motstandsdyktig [3] – [7]. Carcinoma tilbakefall er delvis på grunn av at konvensjonell kjemoterapi kun er rettet mot de raskt dele celler som danner mesteparten av svulsten, men skåner cscs /CSLCs [8]. Andelen cscs er rapportert å øke etter konvensjonell kjemoterapi [9]. Dermed nærvær av kjemoterapi resistente cscs /CSLCs i primærtumor kan delvis være ansvarlig for en svikt i fullstendig utrydding av svulst som resulterer i sin gjentakelse på primære og sekundære områder. Utvikling av nye terapeutiske strategier, som spesifikt retter cscs /CSLCs er derfor berettiget.
Metformin, (1,1-dimethylbiguanide hydroklorid) en FDA godkjent biguanide anti-diabetiker narkotika, er avledet fra fransk syrin (
Galega officin
), en plante brukt i folkemedisinen i flere århundrer. I tillegg til sin funksjon som en suppressor glukoneogenese, og metformin nylig blitt vist å ha kraftige anti-kreft egenskaper. I type 2 diabetikere metformin har vist seg å undertrykke kreftutvikling i bryst, bukspyttkjertel og lunge, og for å redusere kreftrelatert dødelighet (anmeldt i [10], [11]. I en rekke prekliniske studier metformin redusert spredning, apoptose, forårsaket cellesyklus arrest, og redusert forekomst og vekst av eksperimentelle tumorer
in vivo product: [12] – [18] Noen rapporter tyder også på at metformin forbedret responsen av humane bryst tumorxenografter til konvensjonell kjemoterapi ved å utrydde cscs i. svulsten [19], [20].
Mange forskere har rapportert sentral rolle Wnt /β-catenin signalveien i regulering av epiteliale stamcelle selvfornyelse [21], [22], og dens feilregulering har vært implisert i mange maligniteter, inkludert kolorektal cancer (CRC) [23], [24]. i CRC, som et resultat av inaktivering av APC-genet, den koordinerte fosforylering og ødeleggelse av β-catenin blir forstyrret. som et resultat β-catenin akkumuleres i cytoplasma, komplekser med DNA-bindende proteiner av TCF /LEF familie og translocates til kjernen [25], [26]. Når du er der, aktiverer den transkripsjon av sine mål gener som cyclin D1, c-myc, MMP-7, MT1-MMP, axin1 etc. [27]. Mange av disse målgener er innblandet i tarm stamcelleproliferasjon og karsinogenese [28]. Nylig viste vi at Wnt /β-catenin pathway spiller en avgjørende rolle i vekst og vedlikehold av colonospheres, som er høyanriket i CSC /CSL celler [29]. Økte nivåer av β-catenin i colonospheres var assosiert med induksjon av transkripsjonen aktivering av TCF /LEF, som ble redusert ved β-catenin ble stille ved bruk av siRNA [29].
En ny klasse av korte ikke-kodende RNA , såkalte mirnas har dukket opp som en regulator av mRNA oversettelse. En miRNA kan fungere som en tumor suppressor eller et onkogen, avhengig sine mål i forskjellige vev og celletyper [30]. Omfattende analyser av miRNA-ekspresjonsmønstre i humane kreftformer har vist at forskjellige krefttyper har forskjellige miRNA ekspresjonsmønstre [31] .Vi har rapportert at miR21, som har vist seg å være oppregulert i CRC [32], induserer stemness i chemo -resistente (CR) tykktarmskreftceller [33]. miR21 har vist seg å regulere vekst, migrering, invasjon og apoptose beslektede egenskaper av kreftceller [34]. Nedregulering av miR21 av CDF, en analog av curcumin [35], resulterte i en normalisering av PTEN /Akt akse i CR HCT-116 og CR-HT-29-celler og nedsatt vekst [36]. Over-ekspresjon av miR21in HCT-116-celler resulterte i en økt β-catenin aktivitet [33].
Den foreliggende undersøkelse ble foretatt for å undersøke hvorvidt metformin kan brukes i forbindelse med konvensjonell kjemoterapi for å hemme veksten av chemo -resistente tykktarmskreftceller og reguleringen av denne prosessen. Heri, viser vi at metformin virker synergistisk med FuOx, en kombinasjon av 5-FU og oxaliplatin, bærebjelken i tykktarm kreft kjemoterapi å hemme veksten av tykktarms CR celler
in vitro Hotell og
in vivo
samt deres migrasjons via nedregule miR21and hemme Wnt /β-catenin signalveien.
Materialer og metoder
cellelinjer og reagenser
Menneskelig kolon kreftceller HT-29 og HCT-116 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (4,5 g /l D-glukose) supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Grand Island, NY) og 1% antibiotisk /antimykotisk i fuktet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære av 95% luft og 5% karbon diaoxide. 5-Fluorouracil + oksaliplatin (FuOx)-resistente celler (CR celler) ble samlet som tidligere beskrevet [37] – [39] i vårt laboratorium. Cr-celler ble opprettholdt i normalt dyrkingsmedium inneholdende 2 x FuOx (50 uM 5 FU + 1,25 uM Ox). Endotelcellene var en gave fra dr Dipak Banerjee, University of Puerto Rico og opprettholdt i Earles Minimum Essential-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) som tidligere beskrevet [40]. Mediet ble forandret to ganger i uken, og cellene ble passert ved bruk av 0,05% trypsin /EDTA (Invitrogen). Bruken av cellelinjer ble godkjent av Investigation Committee Menneske, Wayne State University, Detroit, MI. Metforminhydroklorid ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. en 2 M løsning ble fremstilt i sterilt destillert vann og lagret ved -20 ° C. FU og Ox ble oppnådd fra Sigma Chemical Co.
Fastsettelse av cellevekst
Veksten av tykktarmskreftceller ble vurdert av mitokondrieavhengig reduksjon av 3- (4,5-2-yl ) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma) til formazan som tidligere beskrevet [41]. I korthet ble cellene (5 x 10
3) ble sådd ut i quadruplicates på 24-brønners kulturskåler. Etter 24 timer friskt medium som inneholder ulike konsentrasjoner av metformin og /eller FuOx ble lagt. Etter 72 timer ble celleproliferasjon bestemt ved MTT-analyse. I korthet, ble mediet fjernet og cellene ble inkubert ved 37 ° C med MTT (0,5 mg /ml) i 4 timer. Mediet ble aspirert og cellene ble oppløst i 0,04 N HCl i isopropanol. Den optiske tetthet (OD) ble målt ved 570 og 630 nm.
Analyse av samspillet mellom metformin og FuOx
Kombinasjon indekser (CI) metode tilpasset for
in vitro
narkotika testing ble ansatt for å bestemme innholdet av samspillet mellom metformin og FuOx. Denne metoden benytter multiple legemiddeleffekt-ligningen, opprinnelig utledet fra enzymkinetikk metode, hvor produksjonen er representert som CI og /eller isobologram analysis.CI analyse ble utført ved å benytte Calcusyn programvare (Biosoft, Ferguson, MO, USA). Basert på CI-verdier, er omfanget av synergi /anatogonism bestemt. Generelt CI-verdier under ett antyder synergi, mens CI verdier over 1 indikerer antagonisme mellom narkotika. CI verdier i størrelsesorden 0,9 til 1,10 vil i hovedsak indikerer additive effekter: de mellom 0,9 til 0,85 foreslå liten synergi, og verdier i området 0,7-0,3 indikerer moderat synergi. Eventuelle verdier som er mindre enn 0,3 foreslår sterke synergi interaksjoner mellom legemidler.
Dannelse og differensiering av colonospheres
Muligheten av celler til å danne kuler i suspensjon ble evaluert som beskrevet av Liu et al [42 ] med små modifikasjoner [29], [43]. Kort fortalt colonospheres ble generert ved inkubasjon et begrenset antall foreldre og CR HCT-116 og HT-29 celler i en konsentrasjon på 100 celler per 200 mL i serum -Gratis stamcelle medium (SCM) som inneholder DMEM /F12 (01:01) supplert med B27 (Life Technologies, Gaithersberg, MD) 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (Sigma, St. Louis, MO), 10 ng /ml fibroblast vekstfaktor (Sigma) og antibiotisk /antimykotisk i 24 brønners plater i nærvær av metformin alene eller i kombinasjon med FuOx. De colonospheres dannet etter 8 dager ble vurdert med hensyn til størrelse og antall av lysmikroskopi. I ett sett av eksperimenter ble colonospheres dannet i normal medium behandlet med metformin og /eller FuOx å analysere deres effekt på kula differensiering og vedlegg.
Extreme begrensende fortynning analyse
Extreme begrensende fortynning analyse (ELDA) ble utført som beskrevet av Hu og Smyth [44]. I korte trekk, enkeltcellesuspensjon erholdt fra adherente celler forbehandlet med metformin og /eller FuOx i 72 timer ble sådd ut ved en konsentrasjon på 100, 10 og en celle pr 100 μLSCM (24 vel for hver fortynning) i 96-brønners plater og inkubert i 8 dager . Ved slutten av 8 dager, ble antallet brønner som viser dannelsen av colonospheres telles. Hyppigheten av sfære forming celler ble bestemt ved bruk ELDA webtool på https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda.
Cell migrasjon analysen
Denne analysen ble utført ved hjelp av en Boyden kammer (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD) som beskrevet tidligere [41], [45]. I det nedre kammer 100 ug /mL Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) alene eller blandet sammen med metformin og /eller FUOX ble tilsatt. HT-29 eller CR HT-29 celler (5 × 10
4) celler ble lagt i det øvre kammeret. De to kamre ble adskilt ved et polykarbonatfilter fra 8 μ porestørrelse og inkubert i et 37 ° C vevskultur-inkubator i 16 timer, hvoretter filteret ble fjernet, cellene ble på toppen av filter tørket av, og de migrerte cellene fast, farget ved hjelp Protocol Hema tre flekken sett (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). De migrerte celler ble fotografert med Olympus 45 mikroskop støtte en Spot Idea kamera og migrerte celler per felt ble talt opp. Hver analyse ble utført tre ganger og ble anvendt 6 brønner for hver behandling.
I det neste sett av eksperimenter, migrering av tykktarmskreftceller overfor endotelceller ble målt. I denne undersøkelsen, enodothelial celler eller HT-29 /CR HT-29-celler (2,4 x 10
4) ble for-merket med henholdsvis levedyktig flekk DIO eller Dil (Invitrogen), vasket to ganger med fullstendig medium og sådd ut i hvert kammer av cellekulturen innsatsen (ibidi GmbH). Etter 24 timer ble cellekultur innsatsen fjernes og ble observert migrering av co-kulturene mot hverandre for sårheling. I enkelte kulturer, metformin og /eller FuOx ble tilsatt ved tidspunktet for fjernelse av innsatsen. Cellene ble fotografert på 0, 24 og 48 timer etter fjerning av innsatsen.
Western blot-analyse
Western blot-analyse ble utført i henhold til standardprotokollen [46]. I korthet ble cellene løst i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X100, 0,5% NP40, 25 ug /ml hver av aprotinin, leupeptin og pepstatin, 1 x fosfatase inhibitor cocktail (Sigma). etter klaring ved 10000 g i 30 minutter, ble supernatanten anvendt for proteinanalyse. protein~~POS=TRUNC konsentrasjon~~POS=HEADCOMP bestemt ved Bio-Rad proteinanalysesett ((Bio-Rad, Hercules, CA), og alikvoter inneholdende 25 ug protein ble separert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese. etter elektroforese ble proteinene overført til en polyvinylidendifluorid-membran (Millipore) ved elektroblotting og utsatt for western blot-analyse med den anbefalte fortynning av primært antistoff. etter vask ble de blot~~POS=TRUNC ble omsatt med sekundært antistoff blanding innehold 1:2500 fortynninger av passende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Amersham Biosciences). Proteinbånd bånd~~POS=HEADCOMP ble visualisert ved anvendelse av en kommersielt tilgjengelig forbedret chemiluminiscence kit (Amersham Biosciences). Blottene ble også immun reagert med en 1:5000 fortynning av anti-aktin mus monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California) for å normalisere for variasjon i protein lasting.
Isolering av RNA og kvantitativ polymerase Chain Reaction analyse
Total RNA ble ekstrahert fra foreldre og CR celler behandlet med metformin og /eller FuOx i 48 timer ved hjelp TRIZOL reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt RNA ble behandlet med DNase1 for å fjerne kontaminerende genomisk DNA, deretter renset ved anvendelse av miRNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA-konsentrasjon ble målt til en optisk tetthet på 260 nm.
For å kvantifisere MIR-21 og MIR-145, første cDNA syntesen ble utført ved bruk av Taqman mikroRNA Revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) . De miRNA RT-PCR primere for miR21, miR145 og endogen kontroll RNU6B ble kjøpt fra Applied Biosystems. Sanntid QRT-PCR-analyse ble utført ved bruk av Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System. PCR-blanding inneholdende Taqman 2 x Universal Master Mix PCR ble behandlet som følger: 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 60 sek. Signal ble samlet ved endepunktet for hver syklus. Genuttrykket A C
T-verdier for hver prøve ble beregnet ved å normal med internkontroll RNU6B, og relative kvantiteringsstandarder verdier ble plottet.
flowcytometrisk analyse
Enkeltcellesuspensjoner av metformin og /eller FuOx behandlede eller ubehandlede CR HT-29-celler ble utsatt for direkte immunofluorescens-farging etterfulgt av strømningscytometrisk analyse i henhold til standard protokoll [38]. I korthet ble cellene høstet og vasket med PBS. en halv million celler ble suspendert i 90 ul PBS inneholdende 0,5% BSA. Etter 10 min inkubasjon ved romtemperatur ble 10 ul fluorofor (PE-Cy7 eller PerCP-Cy5) konjugert maur-human CD44 eller CD166 antistoff tilsatt og inkubert i 30 minutter i mørket ved romtemperatur. Prøvene ble deretter vasket og analysert ved hjelp av en FACS DiVa (BD, San Jose, CA). Cellene farget med IgG2b (isotype-negativ kontroll) tjente som gating kontroll. Andelen CD44
+ /CD166
+ /lav-celler ble bestemt på grunnlag av fluorescens intensitet-spektra.
tumorvekst hos SCID mus
For å finne ut om kombinasjonen metformin og FuOx ville være en effektiv terapeutisk strategi for tykktarmskreft, ble SCID mus xenograft modell for tykktarms svulst utnyttet. For å generere colontumorer, fire uker gammel kvinne SCID mus, kjøpt fra Taconic Laboratory, ble injisert subkutant enten med 1 × 10
6 CR HCT-116 eller CR HT-29 celler suspendert i 100 ul Matrigel. De ble deretter delt inn i 2 undergrupper av 4 mus og behandling med metformin ble påbegynt 7 dager etter inokulering av cellene i en undergruppe. Metformin (RIOMET 500 mg /5 ml; Ranbaxy Laboratories, Princeton, NJ) ble løst opp i 100 ml vann for å oppnå en dose på 200 mg /kg kroppsvekt. Vannet ble endret daglig og målt med hensyn til vanninntaket. Metformin behandling ble fortsatt i 5 uker helt til musene ble avlivet. Metformin gruppe ble også injisert IP med en blanding av 25 mg /kg 5- fluorouracil og 2 mg /kg oksaliplatin en gang i uken i 3 uker. Svulster ble målt en gang i uken, og svulstvolum ble beregnet ved hjelp av formelen: tumorvolumet = lengde × bredde × bredde /2. Musene ble overvåkes regelmessig for tegn på ubehag. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til Wayne State University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent protokoll # A02-02-13. Animal Welfare Assurance # A3310-01.
Enkelt celle isolasjon fra xenograft
Små porsjoner (5-10 mg) av svulsten, som genereres i SCID mus ved CR HCT-116 og CR HT -29-celler, som beskrevet nedenfor, ble vasket grundig i 1 x PBS inneholdende 10% antibiotisk /antimykotisk (AB /AM) og deretter inkubert over natten i Dulbeccos minimale essensielle medier (DMEM /F12) inneholdende 5% antibiotisk /antimykotisk ved 4 ° C. Vevet ble kuttet i fine stykker ved hjelp av steril skalpell og deretter spaltet med 1,5 mg /ml kollagenase I (Sigma-Aldrich) og 20 pg /ml hyaluronidase I (Sigma Aldrich) under forsiktig omrøring i 2-3 timer ved 37 ° C. Det fordøyde vevet ble filtrert gjennom 40 μ filter og sentrifugert ved 1200 rpm i 5 min. Supernatanten (inneholdende døde celler, samt fett celler) ble fjernet og cellene (pellet) ble vasket tre ganger med DMEM /F12 medium inneholdende 5% AB /AM. Cellene ble suspendert i tidligere definert stamcelle media.
Statistisk analyse
Alle
in vitro
eksperimenter ble gjentatt tre ganger i tre paralleller. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Microsoft Excel. P-verdiene ble beregnet ved hjelp av to utvalgs t-test, forutsatt ulike variasjoner. Verdier 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
Metformin og FuOx kombinasjonsterapi hemmer vekst av chemo fast HT-29 og HCT-116 celler synergi
For å undersøke. enten metformin virker synergistisk med FuOx for å hemme veksten av chemo-resistente celler, ble cellene behandlet med gradvis økende doser av metformin og FuOx, hver alene eller i kombinasjon. Etter 72 timer ble celleveksten bestemt ved MTT-analyse. Dose-responskurver Fig 1A B viser at mens 10 mM metformin eller 8 x (200 uM FU og 5 uM oksaliplatin) FuOx alene forårsaket ~40 og 60% inhibering, sammen forårsaket de hemmer ~70% og 80% i CR HT-29 og CR HCT- 116 celler henholdsvis. Resultatene viser at kombinasjonen av metformin og FuOx virker synergistisk for å hemme veksten av både CR HCT-116 og CR-HT-29-celler. Alle etterfølgende eksperimenter ble utført ved anvendelse av en av chemo-resistente tykktarmskreftcellelinjer.
(A) og CR HT-29 (B-celler) fremstilt ved fast forhold metode. Brøkdel av celler påvirkes av kombinasjonen av de to stoffene (fast ratio) var høyere enn både middel alene. Fa representerer den fraksjon av celler som påvirkes som reaksjon på behandlingen. Fa verdier ble anvendt for å utføre analyse av synergi CalcuSyn programvaren som beskrevet i Materialer og Metoder. C. Relativ overlevelse av CR HT-29-celler i nærvær av økende doser av metformin med og uten 2 x FuOx. Kombinasjonsbehandling er mer effektiv ved alle konsentrasjoner. Veh: Kjøretøy alene. Hver behandling ble utført i quadruplicates, Stolper representerer gjennomsnitt ± standardavvik. * P-verdi. 0,05
De fraksjoner av celler påvirkes i respons til hver behandling, ble brukt til å utføre synergi analyse med Calcusyn programvare. CI som formulert av programvaren, avslørte verdier som indikerer moderat synergistisk interaksjon mellom de to agentene i CR HCT-116 celler ved metformindose 5 mm og høyere og en sterk synergi på 10 og 20 mM metformin i CR HT-29 celler (tabell 1). Ingen synergisme ble sett i foreldre celler (data ikke vist). Som chemo-resistente celler blir opprettholdt i 2 x FuOx (50 uM FU, 1,25 uM oksaliplatin), ved siden vi studert effekten av doser av metformin som strekker seg 0,6 til 20 mM i kombinasjon med 2 x FuOx på veksten av CR HT- 29 celler. Resultatene viser at ved alle konsentrasjoner som benyttes, kombinasjonsterapien var mer effektiv til å inhibere cellevekst enn metformin alene (figur 1C.). Chemo-resistente celler var mer motstandsdyktig mot FuOx og mer følsom for kombinasjonsterapi sammenlignet med de parentale celler (data ikke vist).
Metformin og FuOx kombinasjonsterapi hemmer dannelsen colonosphere (antall stamceller /stilk lignende celler)
Det ble rapportert at FuOx overlevende celler er anriket i cscs /CSLCs som vokser som store, runde ufestede flytende sfæroide kolonier (colonospheres) når de dyrkes i serumfritt stamcelle medium ved en forholdsvis lav densitet [38] [29]. Fig. 2A og B (venstre panel) viser at i nærvær av 2 x FuOx, økende konsentrasjoner av metformin redusert antall og størrelse på colonospheres. Metformin også induserte vedlegg og oppløst de colonospheres (Fig. 2A og B (høyre panel)) Når colonospheres ble trypsinert og sådd i nærvær av metformin + FuOx, økende antall kuler mistet sine stilk-lignende egenskaper som de er sett til å feste til bunnen av fatet
A B:. Dannelse av primære colonospheres i nærvær av metformin og FuOx (venstre panel). Induksjon av differensiering og feste av colonospheres i nærvær av metformin /FuOx (høyre panel). A: grafisk representasjon av tall B: photomicrographs av representative kuler. C:. Strømningscytometrisk analyse av CD44 og CD166-positive celler etter metformin /FuOx behandling
Vi evaluerte også kreft stamcelle egenskaper til de behandlede celler ved å utføre en ekstrem begrensende fortynningsanalyse (ELDA). CR HT-29 celler ble behandlet med metformin + FuOx for 72 timer og sådd i normal stamcelle medium. Mens metformin alene redusert hyppigheten å danne colonospheres av 1,5-2 folder, kombinasjonsbehandlingen reduseres det med 7-8 folder som i ubehandlet kontroll (tabell 2).
For å finne ut om og i hvilken grad gjeldende behandlingsstrategier vil påvirke andelen av cscs /CSLCs, flowcytometrisk analyse ble utført etter metformin og /eller FuOx behandling av CR HT-29 celler. Resultatene viste en reduksjon (~65%) i CD44
høy /CD166
lav fenotype cellepopulasjon sammenlignet med FuOx behandlede kontroller. I kontrast, andelen av CD44
høy /CD166
lave celler økte 5,12 til 7,34% i nærvær av FuOx, som kan delvis skyldes dødsfallet FuOx sensitive celler. Kombinasjonsbehandling reduserte andelen av CD44
høy /CD166
lave celler til 2,8% (Fig 2C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at kombinasjonen av metformin og FuOx ikke bare reduserer CR kolon CSC /CSLC befolkningen, men også reduserer sine stamcelleegenskaper.
Metformin og FuOx kombinasjonsbehandling hemmer cellemigrasjon
Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved Boyden kammer (figur 3A) og sårheling (figur 3B) analyser. Boyden kammeret analysen viser at mens foreldre HT-29 cellene vise begrenset migrasjon, CR HT-29 celler viser sterk migrasjon mot Matrigel. Imidlertid metformin ble funnet å hemme migrering på en doseavhengig måte, og kombinasjonsbehandlingen forårsakes ytterligere reduksjon: 10 mM metformin + FuOx, ~6 fold hemning i migrasjon ble observert i CR HT-29-celler (figur 3A)
Metformin /FuOx behandling redusert migrasjon av CR HT-29 celler. Hvert punkt representerer et gjennomsnitt av 6 målinger. Barer representerer gjennomsnitt ± standardavvik (A). Sårheling analyse ved hjelp av endothelial (topp /rød) og CRC (bunn /grønn). Øverst til venstre panel: såret ved 0 timer; nedre venstre panel: fullstendig sårtilheling ved 48 timer i CR HT-29 celler; panel øverst til høyre: delvis sårtilheling i HT-29 celler etter 48 timer; panel nederst til høyre: ufullstendig sårheling hos CR-HT-29-celler i nærvær av 5 mM metformin /FuOx ved 48 t (B). Western blot-analyse av metformin /FuOx behandlede CR H29-celler som indikerer redusert pakt nivåer (C); relative endringer i fosfo-Akt (pakt) ble beregnet som forholdet mellom pakt /Akt etter normalisering til p-aktin, som ble benyttet som kontroll lasting. * P. 0,05
sårtilheling analysen ble utført for å studere migrasjon av foreldre og CR HT-29 celler mot endotelceller. Fig. 3B viste CR HT-29 og endotelceller migrerer mot hverandre. Ved 48 timer ble såret fullstendig helbredet etter kolon CR celler, mens foreldre celler viste bare ~46% lukking av sår (Fig.3B). Behandling med metformin + FuOx bremset ned såret helbredelsesprosessen. Mens 54% og fullstendig lukking av sår ble observert hos ubehandlede CR HT-29 celler ved 24 og 48 timer henholdsvis, metformin + FuOx behandling resulterte i en 46% og 77 lukking av sår ved 24 og 48 timer henholdsvis. Disse resultatene bekrefter ytterligere at metformin + FuOx kombinasjonen er effektiv til å dempe de tumorigene /trekkende /invasive egenskaper av chemo-resistente tykktarmskreftceller.
Det er blitt rapportert at Akt er en viktig nedstrøms Målet for PI3K ombygging av aktin filamenter for å øke cellemigrasjon [47]. Dette fikk oss til å analysere Akt /Pakt uttrykk i metformin og FuOx behandlede celler. Western blot-analyse avslørte reduserte nivåer av pakt i behandlede celler sammenlignet med kontroller (fig. 3). Vi foreslår at PI3K /Akt signalveien kan spille en rolle i regulering av metformin /FuOx-indusert hemming av cellemigrasjon.
Metformin og FuOx kombinasjonsbehandling minsker miRNA21 og øker miR145 uttrykk
I lys av den oppfatningen at MIR-21 er onkogene, mens MIR-145 er svulst undertrykkende, har vi analysert sine nivåer i chemo-resistente tykktarmskreftceller. Vi fant nivåene av miR21 å være høyere i CR tykktarmskreftceller [33] og miR145 å bli lavere, sammenlignet med tilsvarende foreldrekontroll (upubliserte data). Resultatene av den kvantitative sanntid PCR-analyse viste, mens metformin enten alene eller sammen med FuOx førte til en markert reduksjon av MIR-21expression, den induserte MIR-145, sammenlignet med deres respektive kontroller (fig. 4). Det er nok å nevne at QRT-PCR verdier for MIR-21 og MIR-145 ble normalisert til nivåene av RNU6B
C:. Metformin /FuOx behandling av CR HCT-116 celler hemmer transkripsjonen aktivitet av TCF /LSF. D: Western blot analyse viser en redusert ekspresjon av β-catenin og c-myc i metformin /FuOx behandlet CR HCT-116-celler. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. * P. 0,05
Som Wnt /β-catenin signal spiller en avgjørende rolle i reguleringen av tykktarmskreft stamcelle spredning, vi neste studert effekten av metformin behandling på β-catenin aktivitet, dets ekspresjon og nivåene av dens målprotein c-myc. Kombinasjonen behandling av metformin og FuOX forårsaket -50% reduksjon i den transkripsjonelle aktivitet av TCF /LEF i CR HCT-116-celler, sammenlignet med de ubehandlede kontroller (figur 4C). Western blot analyse viste en markert nedgang i nivåene av total β-catenin samt c-myc uttrykk i CR HCT-116 celler. Tatt sammen tyder disse resultatene på en inhibering av Wnt /β-catenin signalisering i chemo-resistente tykktarmskreftceller i respons til kombinasjonsterapi av metformin og FuOx.
Metformin og FuOx kombinasjonsterapi hemmer tumorvekst in SCID-mus
for å undersøke den terapeutiske effekten av kombinasjonen av metform og FuOx ble SCID mus xenograft modell for tykktarms svulst utnyttet. CR HCT-116 eller CR HT-29 celler ble injisert subkutant i flanken regionen i SCID-mus. Etter håndgripelig svulster ble dannet, ble en gruppe matet metformin i drikkevannet, og ble også injisert (i.p.) med FuOx, en gang i uken i 3 uker. Tumorvekst ble målt ved å beregne tumorvolum i 34 dager. Xenotransplantater dannet av CR HCT-116-celler viste en lineær vekst til 27 dager, hvoretter tumorvekst bremset ned. Et tilsvarende vekstmønster ble sett i metformin /FuOx behandlet mus, om enn veksten var betydelig lavere sammenlignet med kontroller. Ved dag 34 etter injeksjon, var det en statistisk signifikant (nesten 50%) reduksjon i tumorstørrelse i metformin /FuOx behandlede mus (figur 5A venstre panel). CR HT-29 celler injisert mus viste en langsom svulst vekst i første omgang. Imidlertid ble en vekst sprute sett i kontrolldyrene etter 27 dager. På den annen side, metformin /FuOx behandlet mus viste en rask nedgang i tumorvolum etter 27 dager.
Barer representerer gjennomsnitt ± standard feil. * P 0,05. Sanntids kvantitativ PCR av RNA ekstrahert fra celler isolert fra CR HT-29 tumor (B). CD44 nivåer redusert og CK20 nivåene økte i metformin /FuOx behandlet xenografter. Colonosphere dannelse i cellene isolert fra CR-HT-29 xenotransplantater (C).
Tumorene ble høstet, og enkeltcellesuspensjoner ble dyrket i stamcelle medium. Sanntids ble utført qPCR-analyse, som viste en signifikant reduksjon i CD44 og økning i CK20 mRNA-nivåer i tumorceller dannelse av metformin /FuOx-behandlede mus (figur 5B).
