Abstract
I en xenograft modell, karakterisert ved, oppdaterte nyrekreftceller ble implantert under nyrekapselen på mus avslørte en 30 gangers økning i tumorvolum over en periode på 26 dager, og dette ble fulgt med en 32-ganger økning i nivået av lactosylceramide (LacCer). Mus foret D- treo-1-fenyl-2-decanoylamino-3-morfolino-1-propanol (D-PDMP), en inhibitor av glukosylceramidsyntase og lactosylceramide syntase (LCS: p-1,4-Galt-V), viste markert reduksjon i tumorvolum. Dette ble ledsaget av en nedgang i massen av lactosylceramide og en økning i glukosylceramid (GlcCer) nivå. Mekanistiske studier viste at D-PDMP hemmet celleproliferasjon og angiogenese ved å hemme p44MAPK, p-AKT-en sti og mammalian target for rapamycin (mTOR). Ved å knytte glykosphingolipid syntese med tumorvekst, kan nyrekreft progresjon og regresjon evalueres. Dermed hemme glykosphingolipid syntese kan være en bonafide mål å hindre utviklingen av andre typer kreft
Citation. Chatterjee S, Alsaeedi N, Hou J, Bandaru VVR, Wu L, Halushka MK, et al. (2013) Bruk av en glykolipid Inhibitor å bøte Nedsatt Kreft i en musemodell. PLoS ONE 8 (5): e63726. doi: 10,1371 /journal.pone.0063726
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 26 september 2012; Godkjent: 05.04.2013; Publisert: 09.05.2013
Copyright: © 2013 Chatterjee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble finansiert gjennom TEDCO, State of Maryland stipend, Johns Hopkins University institusjonell støtte og en National Institutes of Health gi PO-en-HL-107153-01. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. SC serverer i den vitenskapelige Advisory Board of Amalyte Pharmaceuticals og mottar godtgjørelse for sine tjenester og slik informasjon er lagret i de institusjonelle eOPC poster. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle andre forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser
Innledning
Nyere studier tyder på at sphingolipids kan indusere fenotyper som spredning, heft og angiogenese-kjennetegnene i tumorvekst og metastase [1] -. [ ,,,0],6]. Anvendelse av medikamenter som hemmer glykosfingolipid syntese gir en mulighet for å undersøke rollen av disse forbindelser i dyremodeller av human sykdom. Her viser vi at ved å knytte glykosfingolipid syntese og dens inhibering i en musemodell av nyrekreft, er det mulig å observere fotavtrykket av interaksjoner mellom medikamentet og glykosfingolipid enzymer, og for å forutsi utbruddet av sykdommen /tumorprogresjon og tumorregresjon. Blokkering av glykosylering av ceramid til å behandle kreft er dokumentert i cellen og i dyremodeller [2], [3].
Svulster krever dannelsen av nye blodkar fra pre-eksisterende (angiogenese) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) spiller en avgjørende rolle i å indusere angiogenese i en rekke forskjellige tumorer [4], [5]. Derfor rasjonaliserte vi at målretting endotelceller som linje tumorblodårer, som er beriket med en isoform av LCS kan ha flere teoretiske fordeler som målgruppe for levering av legemidler i flere typer kreft. Vår begrunnelse stammer fra våre tidligere funn, karakterisert ved at VEGF ble vist å stimulere LCS: β-1,4-Galt-V aktivitet i humane arterielle endoteliale celler til å produsere LacCer, og som resulterte i aktivering av «oksygen følsom» signalreaksjonsveien som fører til angiogenese [4]. Videre vil bruk av små interfererende RNA (siRNA) forårsaker LCS: p-1,4-Galt-V-gen ablasjon eller farmakologisk manipulering ved anvendelse av D-PDMP, en inhibitor for uridindifosfat glukose ceramid glukosyltransferase (UGCG), og LCS [7], markert dempet VEGF-indusert angiogenese [5]. Også, observerte vi at D-PDMP kan signifikant (
P
0,0005) dempe VEGF /β-FGF-indusert angiogenese
in vivo
i nakne mus [4] og hemme eksperimentelle metastaser fra murine Lewis lungekarsinom [8].
Formålet med denne studien var å finne ut om hemme glykosphingolipid syntese vil også hemme celledeling /redusere tumorvolum
in vitro Hotell og
in vivo
. Denne studien oppnådde målet at hemme glykosphingolipid syntese vil også hemme celledeling /redusere tumorvolum
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og metoder
Etikk Uttalelse
Denne studien ble godkjent av The Johns Hopkins Medicine Institutional Animal Care og bruk komité, tillatelse # MO03M615. De aktuelle tiltak tas for å bøte dyrs lidelser inkludert anestesi (Ketamin og xylazine) og post-kirurgi oppfølging (periodisk kontroll på dyrene i opptil 8 timer etter kirurgi). Antibiotisk salve ble gitt på stedet av snittet og en optisk salve ble brukt for å hindre at øynene tørker ut under operasjonen.
Forsøk med mus
Musen nyrekreft (Renca) cellesuspensjon ble lastet i en 1 ml sprøyte. Resipientmus (BALB /c-mus) ble forhånds bedøvet med i.p. injeksjon (100 ul) av en stamløsning av ketamin /xylazin (8 mg /kg), festet på en jordet plate med rygghuden barbert og fremstilt på en steril måte. Et snitt ble gjort i venstre flanke og venstre nyre og exteriorized. 100 ul av tumorcellesuspensjon (1 x 10
6 celler /podestoff) ble injisert i den subkapsulære rom hos den venstre nyre. Nyrene ble deretter plassert i den opprinnelige posisjon og snittet ble lukket med sterile metall sikre klipp. Utprøvende behandling begynte 2 dager etter subcapsular svulst implantasjon. Mus ble foret med oral gavage D-PDMP (3 og 10 mg /kg kroppsvekt) daglig. D-PDMP ble oppløst i 5% Tween-80 i saltløsning. Ti mus (N = 10) ble anvendt i hver gruppe.
placebo-gruppen av mus som har den tumorimplantering fikk daglig, et like stort volum av 100 ul av kjøretøyet. Etter denne fremgangsmåten ble dyrene overvåkes daglig. Endepunkt for dette settet med eksperimenter var tumorvekst vurdering i nyrene. Tumorvekst overvåking i dyr implantert orthotopically i nyren ble utført ved manuell palpasjon to ganger i uken. Etter 4 uker, (dag 26-28 post- svulst implantasjon) ble dyrene avlivet med CO
2 og obdusert. Tumorvekst målingen ble utført ved direkte tumorvekt vurdering ved slutten av forsøket.
Histologiske studier
primære tumorer ble sendt for histologi (N = 4). De vevssnitt ble farget med hematoksylin -eosin og med antistoffer mot CD31 (en viktig markør for angiogenese) og caspase-3 (en viktig markør for apoptose). Lactosylceramide antistoff (CD17) ble innkjøpt fra Ancell Laboratories og ble anvendt for å identifisere lokaliseringen av LacCer i nyrevevet. Vevene ble høstet fra de andre 4 mus, og anvendes i Biochemical /molekylære assays som er beskrevet i teksten.
Utvinning av D-PDMP og sfingolipider
Prøve ekstraksjon ble utført ved bruk av en modifisert Bligh og Dyer fremgangsmåte som tidligere beskrevet [9]. Hver prøve ble homogenisert ved romtemperatur i 10 volumdeler avionisert vann. Tre volumer av 100% CH
3OH inneholder 53 mM HCOONH
4, 17 ng /ml C
12:00 ceramid, og 17 ng /ml C
12:00 sphingomyelin (interne standarder, IS ) ble tilsatt, og blandingen ble vortex-blandet. Fire volumer av CHCI
3 ble tilsatt, vortex-omrørt og deretter sentrifugert ved 1000 x
g
i 10 minutter. 100 ul av den CHCI
3 lag ble separert, tørket under en strøm av nitrogen, og residuet ble oppløst i 100% metanol inneholdende 10 ng /ml C
02:00 ceramid som en indre standard for kvantifisering av D -PDMP. Deretter ble prøvene overført til hetteglass innsatser for LC /MS /MS-analyse; 10 pl ble injisert inn i LC /MS /MS. Alle løsemidler og kjemikalier var HPLC-kvalitet. Lipid ekstraksjoner ble utført ved hjelp av borosilikat-belagt glass rør og pipetter, for å redusere vedheft av lipider til overflater.
LC /MS /MS-analyse for sphingolipids og D-PDMP
Identifikasjon av sphingolipid arter og D-PDMP ble utført ved anvendelse av en 3000 PE Sciex væskekromatografi med elektrospray ionisering tandem massespektrometer, operert i positivt modus (LC-ESI /MS /MS; Applied Biosystems, Thornhill, Ontario, Canada), og i henhold til metoder som er rapportert i tidligere studier [ ,,,0],10]. Systemet består av to Perkin Eimer LC pumper er koblet til en HTC PAL autoinjektor (CTC Analysis, Zwingen, Sveits) utstyrt med en 50 pl prøvesløyfe. Strømningshastighet var 400 ul /min for ceramider og 1 ml /min for sfingomyeliner. Flow fra prøven injektor førte til en 2,6 mikrometer C kolonnen for ceramider og D-PDMP, og en 5 mikrometer C
18 kolonne for sfingomyeliner (Phenomenex, Torrance, CA). Kolonnen ble pre-ekvilibrert i 0,1 minutter med oppløsningsmiddel A som besto av CH
3OH: dH
2o (85:15, v /v) med 5 mM HCO
2NH
4, og den prøven ble eluert med løsningsmiddel B som bestod av CH
3OH: HCOOH (99:1, v /v) med 5 mM HCO
2NH
4. Den eluerte prøve ble automatisk innført i ionekilden. Instrument parametere for LC-ESI /MS /MS ble optimalisert individuelt for hver art av ceramid, ceramid-1-fosfat, sphingosine, sphinganine, sphigosine-1-fosfat, sphingomyelin, og D-PDMP av flere reaksjon overvåking. Ceramider og sfingomyeliner ble kvantifisert ved areal under kurven (AUC) av tellinger pr sekund (CPS) normaliserte interne standarder (ceramid C
12:00 og sphingomyelin C
12:00). D-PDMP Konsentrasjoner ble bestemt ved å opprette en standardkurve som ble konstruert ved hjelp av forholdene mellom referansestandarder (D-PDMP, 0,1-100 ug /ml) til IS (ceramid C
02:00; 10 ng /ml) plottet mot prosenter av referanse og er fra eksperimentelle prøver. Alle stamløsninger ble lagret ved -20 ° C og stabil over 6 måneder.
glykosyltransferase og glycosylhydrolase aktivitetsanalyser
LCS aktivitet i nyre preparater ble målt ved anvendelse av en protokoll beskrevet tidligere [11] med
følgende modifikasjoner. Kort sagt ble flash-frosset nyrevevet homogenisert i Tris-HCl-buffer (pH 7,4) inneholdende Triton-X-100 og sentrifugert ved 10000 rpm i 15 min. Den proteinmasse i supernatanten ble målt og 100 ug av prøven protein ble anvendt i enzymatiske analyser, i tre eksemplarer. 14C-UDP-galaktose (amerikansk radiomerkede Company, St. Louis, MO) fungerte som donor av galaktose. Og glukosylceramid (Matreya Chemicals, PA) fungerte som akseptor i denne analysen. 14C-LacCer generert fra denne analysen ble kvantifisert ved scintillasjons-spektrofotometri. Glukosylceramidsyntase aktivitet ble målt ved bruk av ceramid som akseptor, og [3H] UDP- glukose som glukosedonor. Glukosylceramid hydrolase aktivitet ble målt ved hjelp av [3H] glukosylceramid (amerikansk radiomerkede Company), som substrat i henhold til tidligere publiserte protokoller.
Vest Immunoblotanalyse studier
Nyrer ble høstet fra kontroll, placebo, 3 MPK og 10 MPK av D-PDMP matet muntlig og daglig til mus. Nyre vev ble homogenisert i RIPA-buffer (Sigma Aldrich), plassert på is i 15 minutter, sentrifugert ved 13 000 rpm, og supernatantene ble samlet. For å bestemme proteinkonsentrasjonen, ble Bradford-analysen benyttet. Til en 4-15% gel (Bio-Rad Ready gel), ble 45-90 ug av proteinprøver og 10 ul av lav molekylvekt proteinstandard (Bio-Rad Dual Color Precision Plus) lastet. Etter gel-elektroforese i 1,5 time, ble Immuno-blot PVDF-membraner (Bio-Rad) dyppet i kald metanol, dH
2o, og overføringsbuffer (Bio-Rad). Deretter ble gelen overført til en PVDF-membran (Bio-Rad), på 30 V over natten. Membranene ble blokkert i 3% melk, 1 x TBST (0,05% Tween-20), inkubert i primære antistoffer mot: p-1,4-Galt-V, Beta aktin, UGCG (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (glyceraldehyd-3- fosfat dehydrogenase, USA biologisk), p44MAPK (Thr202 og Tyr204), p-AKT-1 (Thr308) (cellesignalisering Technologies) og mTOR (Sigma-Aldrich) i 1 × TBS med 1:200 fortynning og 0,5% BSA, og inkubert i sekundært antistoff, geite-anti-kanin-IgG-HRP-konjugat (Sigma Aldrich) i 5% melk, 1 x TBST med 1:1000 fortynning. Alle primære antistoffer kreves inkubering over natten ved 4 ° C, mens sekundære antistoffer kreves 1 timers inkubasjon ved romtemperatur. Deretter membraner ble vasket i 1 × TBST i 5-10 minutter og gjentas 2 ganger og er utviklet ved hjelp av ECL kit (Amersham ECL Plus ™ Western Blotting Detection reagenser).
Datamaskin assistert kvantifisering av caspase-3 og CD31 positive celler
Alle immunohistochemically farget lysbilder ble digitalt skannet ved hjelp av en Aperio CS ScanScope (Vista, CA). For Caspase-3-analyse, ble det sjelden hendelse og atom algoritmer av Aperio Verktøykasse Kit utnyttet. Den sjeldne hendelsen detektoren identifisert caspase positive celler som ble bekreftet av håndforvaring. Denne verdien ble dividert med det totale celletall i området bestemt av kjernealgoritmen. CD31 området ble identifisert ved å dele en CD31 positiv maske området ved levedyktig svulsten maske område for hvert lysbilde, som likeledes beskrevet [12].
Statistiske studier
Data er uttrykt som en gjennomsnittlig ± standardavvik og som et gjennomsnitt ± standard feil måling. Den betydelige forskjellen mellom kontroll, placebo, og eksperimentelle gruppen ble evaluert ved bruk av studentens
t
test og enveis ANOVA. Parvise sammenligning ble utført for å bestemme signifikans mellom forskjellige behandlinger. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
P
. 0,05
Resultater
Vi observerte at D-PDMP men ikke L-PDMP hemmet veksten av Renca celler (se figur S1 ). Derfor hypotese vi at hemme LCS aktivitet og redusere LacCer belastning kan godt redusere nyrekreft hos mus. I denne studien brukte vi D-PDMP fordi det er ikke-toksisk og er tatt opp av nyre, hjerne og lever når de gis oralt til mus [13]. Dessuten er det raskt klarert av cytokrom P450-systemet som sin t
1/2 er -50 minutter [13]. Selv om D-PDMP ble syntetisert for å redusere Gaucher sykdom ved å hemme UGCG aktivitet, viste vi at det også hemmet LCS aktivitets LacCer produksjon og dermed angiogenese
in vitro Hotell og
in vivo
, i hårløse mus [5]. Heri, viser vi at hemme LCS aktivitet og LacCer produksjon spesifikt er sentrale for signale arrangementer som angiogenese og spredning som fører til en markert reduksjon i tumorvolumet i en musemodell av nyrekreft.
En uke etter påføring, den primære svulsten var makroskopisk synlig; etter 10 dager spontan metastaser utviklet i regionale lymfeknuter, lunger, bukhinne, og lever, slik at Renca modellen vil bli avholdt på samme måte som human nyrecellekreft. Gjennomsnittlig overlevelsestid på Renca-bærende mus er 32 dager når 10
6 Renca cellene er injisert. For å avgjøre om endring i glykosphingolipid profil er en viktig funksjon i nyrekreft, sammenlignet vi nivået av disse lipider i kontroll nyre (ikke peiling Renca) versus placebo mus nyre (peiling Renca). Samtidig undersøkte vi effekten av fôring D-PDMP på tumorvolum og lipid nivåer i nyrevevet. Vi observerte at implantering av Renca celler i subkapsulære rom i den venstre nyre (placebo mus, og ingen behandling) bidratt til ~ 30-gangers økning i tumorvolum over en periode på ~26 dager (figur 1A). Kroppsvekten ble ikke endret (figur 1B) og 20% av musene i placebogruppen døde. Oral fôring av tre MPK D-PDMP og 10 MPK D-PDMP for forsøksperioden reduserte tumorvolumet til -50% til placebo mus nyre svulster. Denne D-PDMP reduksjon doseuavhengig i tumorvolum kan delvis forklares ved vår observasjon at nivået av D-PDMP (målt ved hjelp av LC-MS /MS) i nyrevevet var lignende (figur 1C) som kan det har vært raskt utskilles. Detaljert tandem LC-MS /MS viste at C24, C16 og C22 var de store fettsyremolekyltyper i ceramider, mono og di hexosylceramide og sphingomyelin i kontroll, placebo, og D-PDMP-matet mus nyrevevet. Og C20, C18 og C26 var de mindre fettsyreinneholdende sfingolipider (figur S2). Den totale ceramid nivået økt ~2.5 ganger i placebo muse nyre vs. kontroll. Interessant, fôring 3 MPK D-PDMP ikke endre nivået av ceramid i nyre sammenlignet med placebo (figur 2A). Men i 10 MPK D-PDMP matet mus, nivået av ceramid redusert til kontrollnivået. Derfor, selv om D-PDMP hevdes å være en spesifikk hemmer av UGCG og dermed bidra til en økning i ceramid nivåer, i denne studien det gjorde ikke heve vev nivåer av ceramider i mus nyre. Og denne observasjonen er i overensstemmelse med en tidligere rapport som viste at D-PDMP (100 MPK) redusert nyre ceramider level~9% 5 timer senere [13]. Injisering 40 MPK D-PDMP to ganger om dagen i 4 dager også resulterte i en reduksjon på 23% i ceramid i nyre [13]. I en annen undersøkelse ved hjelp av iminosugar N- (5-adamantinane-1′-yl-metoksy) pentyl-1-deoxynoijirimycin (AMP-DNM), en inhibitor av UGCG også ikke heve ceramid-nivåer i lever og opprettholdt plasmanivået av ceramid til basalnivået i diett-indusert hyperlipidemi i apoE – /- mus [14]. Årsakene til en D-PDMP mediert nedgang i ceramid nivå i mus nyre er ikke klart fra denne studien. Siden ceramid er en direkte forløper for syntese sfingomyelin, forventet vi et høyere nivå av sfingomyelin i D-PDMP behandlede mus. Men den nivå av sphingomyelin i vår studie og i en tidligere studie [13] ikke endres vesentlig (figur 2 H). Dette kan være fordi mens en høyere pool av ceramid kan indusere en økning i sphingomyelin syntese; imidlertid, ettersom D-PDMP øker også aktiviteten av sfingomyelinase, kan det bidra til å opprettholde homeostase sfingomyelin [13]. Ceramid kan også hydrolyseres for å generere sfingosin og dets derivater (figur 2C-E). For eksempel, våre ytterligere studier viser at nivået av ceramid-1-fosfat (figur 2B), sfingosin (figur 2C), sfingosin-1-fosfat (figur 2D) og sphinganine (figur 2E) varieres på placebo mus nyre sammenlignet med kontrollen og ved behandling med D-PDMP. Spesielt 20 gangers økning i nivået av sfingosin-1-fosfat i placebo-mus sammenlignet med kontroll ble notert. Behandling med 3 MPK D-PDMP ikke redusere nivået av sfingosin-1-fosfat sammenlignet med placebo mus nyre. Imidlertid ved å mate 10 MPK D-PDMP, vi har observert en 50% reduksjon i nivået av dette lipid. Nivået på monohexosylceramides ble hevet fem ganger i placebo mus i forhold til at av kontroll mus nyre men ikke endre på fôring tre MPK D-PDMP (figur 2F). Overraskende, er nivået på denne lipid økt noe på fôring 10 MPK av D-PDMP. Denne observasjonen kan tolkes til å indikere en kompenserende reduksjon i nivået av LacCer i mus behandlet med 10 MPK av D-PDMP som redusert aktiviteten av LacCer syntase. Det er således et uventet resultat i denne studien er at langvarig (26days) mating av D-PDMP ikke redusere nivået av monoglycosylceramides i mus nyre, selv om D-PDMP har tidligere vist seg å fungere som en inhibitor av glykosylceramidsyntesen. Den største økningen i nivået av dihexosylceramide, ~32 ganger, skjedde i placebo nyre sammenlignet med kontroll. Imidlertid er graden av lactosylceramide redusert doseavhengig i mus foret 3 MPK MPK og 10 av D-PDMP (figur 2G). Dette ble fulgt av en D-PDMP doseavhengig reduksjon i aktiviteten av LacCer syntase (figur 3C), men ikke GlcCer syntase (figur 3A). I motsetning til dette ble det observert at aktiviteten av glukosylceramid hydrolase ble redusert med en økning i dosen av D-PDMP fra 3 til 10 MPK MPK (figur 3B). Redusert aktivitet av glukosylceramid glukosidase i mus behandlet med 10 MPK D-PDMP (figur 3B) kan ha bidratt til en økt grad av GlcCer (figur 2F). Interessant nok ble nivået av sfingomyelin ikke endres i kontroll, placebo, og D-PDMP-matet mus nyre (figur 2 H). I sum, den økning i nyretumorvolum i Renca bærende mus og dens reduksjon ved behandling med D-PDMP korrelert best med nivåene av LacCer masse, sammenlignet med en hvilken som helst annen sfingolipid undersøkt i denne studien.
Mus (BALB /C) ble pre-bedøvet og Renca tumorcellesuspensjon (10
6 celler) ble injisert i den subkapsulære rom hos den venstre nyre. Utprøvende behandling begynte for to dager etter subcapsular svulst implantasjon. Mus tilført ved oral gavage D-PDMP (3 og 10 mg /kg kroppsvekt, MPK) daglig. D-PDMP ble oppløst i 5% Tween-80 i saltløsning. Placebo mus mottok bærer (5% Tween-80 i saltløsning 100 pl bare). Etter 26 dager ble musene avlivet. Den høyre nyre tjente som kontroll, og den venstre nyre tjente som placebo eller medikament behandlet med 3 og 10 MPK av D-PDMP. A: En markert økning i mus nyre tumor volum er sterkt redusert ved å mate D-PDMP. B. D-PDMP (3 og 10 MPK) ikke redusere total kroppsvekt hos mus. C: Nivået av D-PDMP i nyrene hos mus behandlet med 3 og 10 MPK av D-PDMP var lik
Nivået av forskjellige sfingolipider ble målt ved hjelp av tandem LC-MS /MS.. A: D-PDMP redusert nivået av ceramid, B: ceramid-1-fosfat, og D: sfingosin-1-fosfat. D-PDMP beskjedent økt nivå av sfingosin; C, E: sphinganine og F: monohexosylceramide. G: D-PDMP doseavhengig redusert nivået av dihexosylceramide i mus nyrekreft. H: D-PDMP ikke endre nivået på sphingomyelin i musenyrekreft. (* P 0,05, ** p 0,01 N = 4).
Måling av lactosylceramide syntaseaktiviteten i mus nyre ble utført ved bruk av UDP [14C] galaktose som galaktose donor og GlcCer som akseptor, som beskrevet [11]. Vi observerte at mating av D-PDMP doseavhengig redusert aktiviteten av dette enzym A: glukosylceramidsyntase aktivitet ble redusert i samme grad uavhengig av om tre MPK eller 10 MPK av D-PDMP ble tilført til mus med renal kreft, B: glucosylceramidehydrolase aktiviteten ble redusert med D-PDMP behandling og C:. lactosylceramide syntaseaktiviteten var doseavhengig redusert i D-PDMP matet mus med nedsatt kreft (N = 4; * p 0,05)
Neste , ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig monoklonalt antistoff mot LacCer, vi avgjort om LacCer var en stor lipid akkumuleres i nyrekreft. Våre immunhistokjemiske studier viste akkumulering av store mengder av lactosylceramide innenfor cytoplasmatiske vesikler (hvite piler) utelukkende i kreftceller (sammenlign figur S3A; DAPI flekk vs. fig S3b; CD17-antistoff farget celler). Tidligere har vi vist at i humane tumornyre proksimale tubulære celler, blir aktiviteten til LCS økt, og denne er sammen med en økning i nivået av LacCer sammenlignet med normal human nyre [15]. Økt nivå av LacCer har også blitt rapportert i human nyrekreft [16]. Disse funnene antyder at i musemodellen av nyrekreft, er økningen i lactosylceramide massen best korrelert med økning i tumorvolumet og progresjon av sykdom. Således målretting glykolipid syntese, spesielt LCS og LacCer kan være en bonafide terapeutisk tilnærming for å redusere renal kreft.
For å forstå de molekylære reaksjonsveier som bidrar til en reduksjon i tumorvolumet på grunn av D-PDMP mating i mus, vi utført vestlige Immunoblotanalyse analyser av flere markører, som er vist av andre, og oss [5], [17], [18], [19] for å bidra til celleproliferasjon, angiogenese, og apoptose. Våre mekanistiske undersøkelser viste at D-PDMP påvirkes en markert reduksjon i tumorvolum ved å redusere ekspresjon av forskjellige signaliseringsmolekyler involvert i banene som bidrar til celleproliferasjon og angiogenese. For eksempel, var det en markert økning i massen av LCS i placebo mus nyre sammenlignet med kontroll og denne observasjonen kan forklare en markert økning i LacCer nivå i placebo-nyre vs kontroll. D-PDMP doseavhengig redusert massen av LCS (figur 4A). I motsetning til dette ble nivået av UGCG økt i D-PDMP matet mus (figur 4A). Biomarkører for celleproliferasjon og angiogenese f.eks p44MAPK og p-AKT-1 var alle redusert i nyrene hos mus tilført D-PDMP sammenlignet med placebo nyre (figur 4B). Disse observasjoner tyder på at D-PDMP påvirker celleproliferasjon og angiogenese ved å hemme aktiviteten av LCS og LacCer produksjon. Parallelt
in vitro
studier vi har observert at D-PDMP men ikke L-PDMP doseavhengig redusert spredning av Renca celler, muligens på grunn av arrestasjonen av celler i G2-M fasen av celle syklus, ved behandling med D-PDMP [20] (fig S1).
Representative immunoblot av vevsekstrakter fra BALB /c-mus som bærer (placebo pluss Renca celler /tumor) og 3 og 10 MPK av D- PDMP i 26 dager og kontroll nyre og tilsvarende densitometriske skanninger vises. A: D-PDMP doseavhengig redusert protein ekspresjon av LacCer syntase (β-1,4-Galt-V) (N = 3-6), i musenyrekreft, men noe øket protein ekspresjon av UGCG (N = 2) i musenyrekreft. B: Western-immunoblot av markører for celleproliferasjon (p44MAPK, N = 3), angiogenese (pakt-1, N = 3; mTOR, N = 3 for placebo og 10 MPK) og huset holder protein GAPDH. D-PDMP behandling reduserte markører for celleproliferasjon og angiogenese. Data ble vurdert av enveis ANOVA.
Histologisk evaluering av nyrene avslørte omfattende vekst av aggressive Renca, med markert nekrose. Nekrose, som en prosent av tumorvolumet ble kvantifisert ved hjelp av verktøy digital analyse [21] og ble funnet å være 38,8%, 28,4% og 33,2% for henholdsvis placebo, 10 MPK, og 25 MPK-behandlede mus (figur S4A-H). Vi har tidligere vist at D-PDMP effektivt kan inhibere VEGF-indusert angiogenese
in vitro
i humane umbilikalvene endotelceller og humane arterielle endoteliale celler [4], [5]. Også i en tidligere studie ble VEGF + β-FGF indusert angiogenese dempet av D-PDMP i mus [4]. Dette ble målt ved en markert nedgang i uttrykket av CD31 og angiogenese. For å avgjøre om en nedgang i nyre tumor volum var også på grunn av en nedgang i tilførselen av blod i form av redusert angiogenese, utførte vi farging for CD31 (figur S4i, J). Det var en markert nedgang i CD31 positive vaskulær område i levedyktige deler av svulsten (0,3% vs. 0,05% for placebo kontra 25 MPK behandlet mus) som bestemmes ved hjelp av verktøy digital analyse [21]. Tidligere mTOR er etablert som en markør av angiogenese og har vært en validert mål å redusere flere typer kreft. Vi observerte at D-PDMP markert redusert mTOR-proteinekspresjon (figur 4B), som antyder at ved å inhibere angiogenese, D-PDMP fratatt tumorblodtilførsel og således bidrar til en reduksjon i tumorvolumet. Et uventet resultat var at D-PDMP betydelig redusert antall apoptotiske celler målt ved hjelp av caspase-3-immunfarging. Den prosent av kaspase-positive celler var 0,09%, 0,04% og 0,03% for placebo, 10 MPK, og 25 MPK behandlede mus henholdsvis, som bestemt ved digital analyse (figur S4K-N) [21]. Dermed vår
in vivo
studier tyder på at D-PDMP ikke reduserer tumorvolumet ved å indusere apoptose i mus nyre.
Diskusjoner
Følgende observasjoner kan trekkes fra vår nåværende studien implicating rolle glykosfingolipider i nyretumorbiologi. For det første er det en sterk og statistisk signifikant sammenheng mellom økning i musenyretumorvolum og en parallell økning i massen av LacCer. For det andre, inhibering av glykosfingolipid glykosyltransferase-aktivitet, og særlig reduksjon i aktiviteten og massen av LacCer syntase ble korrelert med en reduksjon i tumorvolumet. For det tredje, selv om D-PDMP er kjent for å være en hemmer av UGCG, det gjorde ikke heve nyre nivåer av ceramider. Siden ceramid er innblandet i apoptose, våre studier tyder på at D-PDMP ikke reduserer tumorvolumet ved å indusere apoptose via ceramid sti i mus nyre. Heller, D-PDMP inhibert en signalveien-indusert av LacCer bidrar således til en hemning av celleproliferasjon og tumorangiogenese. Sammen er disse studiene tyder på at inhibering av glykolipid glykosyltransferase kan hemme proliferasjon /angiogenese i vev via mekanismer som er uavhengige av apoptose.
I den foreliggende undersøkelse, en ~ 30-gangers økning i tumorvolum hos placebo- mus nyre (sammenlignet til at av kontroll) ble stadig av en lik ganger økning i LacCer masse. Mate D-PDMP markert redusert tumorvolum ved hjelp av avtagende den enzymatiske aktiviteten til LCS, LCS masse, og følgelig LacCer masse, og det angiogene proteiner, slik som p-AKT-1 og mTOR. I våre tidligere studier, ble det observert at bruken av siRNA for LCS
in vitro i humane endotelceller
[5] og
in vivo i mus glioblastom product: [22] og bruk av D- PDMP i denne studien kan redusere tumorvolumet ved å dempe angiogenese. Således målretting glykolipid syntese generelt og LacCer syntase spesielt [5], [22] er en ny tilnærming for å redusere renal kreft hos mus. Vi har også tidligere rapportert at L-PDMP, som aktiverer LacCer-syntase i endotelceller kan også indusere angiogenensis på en doseavhengig måte [7] og også Renca celleproliferasjon i foreliggende studie (se vedlegg). Dermed aktivering /inaktivering av LacCer syntase av agonister /antagonister kan godt regulere angiogenese
in vitro Hotell og
in vivo
.
Våre studier og andres [13] har vist at D-PDMP er ikke-toksiske når de gis i doser som var ti ganger større enn konsentrasjonen som brukes i den foreliggende undersøkelse. Kroppsvekten i denne studien viste ingen forskjell i placebo vs D-PDMP-behandlede mus. Svulsten vekten redusert ca 50% i 3 MPK og 10 MPK matet mus sammenlignet med placebo. Imidlertid, når mus ble tilført større mengder av D-PDMP; 25 og 50 MPK, det gjorde ikke ytterligere redusere tumorvolum (data ikke vist). I en tidligere studie ble det vist at t
1/2 av D-PDMP i mus blod er -50 min [13]. Følgelig er det mulig at mer enn en terskel på 10 MPK, det meste av denne forbindelse raskt fjernes ved ekskresjon og derfor ytterligere reduksjon i tumorvolum ikke ble observert. Tidligere har D-PDMP blitt brukt i stor utstrekning for å undersøke rollen av glykosfingolipid og relaterte glycosytransferases i arteriell glattmuskel-celleproliferasjon [1], [23], [24], sårheling [1], [23], [24],
