Abstract
Motstand mot epidermal vekstfaktor-reseptor tyrosin kinase hemmere (EGFR-TKI), gefitinib og erlotinib, er et kritisk problem i behandlingen av
EGFR
mutant lungekreft. Flere mekanismer, inkludert bypass signale av hepatocytter vekstfaktor (HGF) -triggered Met aktivering, er innblandet som formidlere av motstand. Pattedyr målet for rapamycin (mTOR), er en nedstrøms ledning av EGFR og MET signalisering, og regnes derfor en terapeutisk attraktivt mål for behandling av forskjellige typer kreft. Hensikten med denne studien var å undersøke om 2 klinisk godkjent mTOR-hemmere, temsirolimus og everolimus, vinne HGF avhengig motstand mot EGFR-TKI i
EGFR
mutante lungekreftceller. Både temsirolimus og everolimus hemmet fosforylering av p70S6K, og 4E-BP1, som er nedstrøms mål for den mTOR-reaksjonsveien, og redusert levedyktighet
EGFR
mutante lungekreftceller, PC-9, og HCC827, selv i tilstedeværelsen av HGF
in vitro
. I en xenograft modell, temsirolimus undertrykte veksten av PC-9 celler overekspresjon
HGF
-Gene; Dette var forbundet med undertrykkelse av mTOR signalveien og tumorangiogenese. I kontrast, gjorde erlotinib ikke undertrykke denne signalveien eller tumorvekst. Flere mekanismer, inkludert inhibering av vaskulær endotelial vekstfaktor produksjon av tumorceller og undertrykkelse av endotelial cellelevedyktighet, bidra til den anti-angiogene virkning av temsirolimus. Disse funnene tyder på at mTOR-hemmere kan være nyttig for å kontrollere HGF-utløst EGFR-TKI motstand i
EGFR
mutant lungekreft, og de gir begrunnelsen for klinisk utprøving av mTOR-hemmere hos pasienter stratifisert etter
EGFR
mutasjon og HGF uttrykk status
Citation: Ishikawa D, Takeuchi S, Nakagawa T, Sano T, Nakade J, Nanjo S, et al. (2013) mTOR-hemmere kontrollere veksten av EGFR Mutant Lung Cancer Selv etter Anskaffelse Resistance av HGF. PLoS ONE 8 (5): e62104. doi: 10,1371 /journal.pone.0062104
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea
mottatt: 29 november 2012; Godkjent: 18 mars 2013; Publisert: 14. mai 2013
Copyright: © 2013 Ishikawa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av KAKENHI (Grants-i-Aid for Scientific Research på innovative områder «Integrative kreftforskning mikromiljøet Network «(for å SY) og Grant-i-Aid for Unge Forskere (til TY og ST)), og Grants-in- Støtte til prosjekt for utvikling av innovative kreftforsking Therapeutics (P-Direct) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Seiji Yano mottatt honorarer fra Chugai Pharmaceutical Co., Ltd og Astrazeneca. Seiji Yano mottatt forskningsmidler fra Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Kyowa Hakko Kirin Co Ltd og Eisai Co, Ltd Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, og mer enn 80% av tilfellene er klassifisert som ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) aktiverende mutasjoner, for eksempel exon 19 delesjon og ekson 21 L858R punktmutasjon, er funnet i en populasjon av NSCLC, og er forbundet med en klinisk respons til de EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (EGF-TKI), gefitinib og erlotinib [1] – [3]. Men nesten alle respondere utvikler resistens og utvikle tilbakefall etter varierende tidsperioder (ervervet resistens) [4]. I tillegg er 20-30% av pasientene viser ugunstige reaksjoner, selv om deres tumorer har målet mutasjoner (indre motstand) [5]. Mange studier har blitt utført for å avgrense strategier som kan overvinne ervervet og indre motstand. Disse studiene har identifisert flere mekanismer for ervervet resistens, inkludert
EGFR
T790M mutasjon [6], [7],
MET
forsterkning [8], [9], hepatocytter vekstfaktor (HGF) overekspresjon [10], tap av PTEN [11], transformasjon til en liten celle lungekreft (SCLC) fenotype [12] – [14], epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) [15] – [17], aktivering av den NFkB vei [18], endring av mikroRNA [19], og Gas6-Axl aksen aktivering [20]. Kompleksiteten av NSCLC er reflektert ved samtidig forekomst av forskjellige kombinasjoner av disse resistensmekanismer i ulike individer. Vi har tidligere oppdaget at HGF utløser EGFR-TKI motstand ved å aktivere MET /PI3K /AKT akse [10]. Videre viste vi at HGF overekspresjon er til stede i tumorer fra japanske pasienter med ervervet og iboende tumorresistens til EGFR-TKI ved frekvenser på omtrent 60% og 30%, henholdsvis [21]. Dette indikerer at HGF er et ideelt mål for å overvinne EGFR-TKI motstand i
EGFR
mutante lungekreftpasienter. For å overvinne HGF-utløste motstand, bør 2 signaler fra EGFR og HGF-MET blokkeres samtidig. Vi har allerede rapportert at HGF avhengig motstand kan styres av et anti-HGF nøytraliserende antistoff [22], HGF antagonist-NK4 [22], MET-TKI [23] – [25], og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitorer [26] i kombinasjon med EGFR-TKI. Imidlertid er disse inhibitorer ikke klinisk godkjent og kan derfor ikke brukes for behandling av kreftpasienter.
mammalian målet for rapamycin (mTOR), en serin /treonin-kinase, i en nedstrøms mål for PI3K og AKT trasé , og det spiller en avgjørende rolle i celle overlevelse og spredning [27] – [29]. Aktivering av PI3K /AKT og påfølgende fosforylering av mTOR initierer fosforyleringen av viktige nedstrøms mål, også ribosomal p70S6 serin /treonin-kinase (S6K1) og eukaryote initiering faktor (EIF) -4E-bindende protein (4E-BP1), noe som resulterer i en økning i mRNA oversettelse og cap-avhengig protein-syntese, henholdsvis. Således er mTOR-kinase en sentral node i PI3K /AKT-signalveien [27] – [30]. Hittil har flere mTOR-hemmer rapamycin analoger blitt utviklet, inkludert temsirolimus og everolimus, som har blitt brukt til å behandle nyrecellekarsinomer og bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster. Rapamycin og dets analoger binde FK506-bindende protein-12 (FKBP12) og samhandle med mTOR, begrenser sine kinase aktivitet og stanse oversettelse av proteiner kritiske for celledeling og overlevelse.
Fordi mTOR er nedstrøms både EGFR og MET, hypotese vi at mTOR-hemming, selv som monoterapi agent, kan blokkere EGFR og MET-mediert signale samtidig og overvinne HGF-utløst EGFR-TKI motstand. I denne studien undersøkte vi om klinisk godkjent mTOR-hemmere, temsirolimus og everolimus, omgå HGF-utløst EGFR-TKI motstand i
EGFR
mutante lungekreftceller ved hjelp av
in vitro Hotell og
in vivo
modeller, og vurdert underliggende mekanismer.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kulturer~~POS=HEADCOMP og reagenser
EGFR
mutant adenokarsinom celle human lunge linjer PC-9 (del E746_A750) og HCC827, med slettinger i
EGFR
ekson 19, ble kjøpt fra Immuno-Biological Laboratories Co. (Takasaki, Gunma, Japan) og American Type Culture Collection (Manassas, VA ), respektivt. Menneskelig
HGF
-Gene transfektanter (PC-9 /HGF) og vektor kontroll (PC-9 /Mer) celler ble etablert som tidligere beskrevet [10]. Alle cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og antibiotika. Alle celler ble passert for mindre enn 3 måneder før fornyelse fra frosset, tidlig-passasje aksjer. Celler ble regelmessig testet for mycoplasma ved hjelp MycoAlert Mycoplasma Detection Kits (Lonza, Rockland, ME). Cellelinjene ble godkjent på laboratoriet av National Institute of Biomedical Innovation (Osaka, Japan) etter kort tandem repeat analyse. Erlotinib, everolimus, og temsirolimus ble innhentet fra Selleck Chemicals (Houston, TX). Human rekombinant HGF ble fremstilt som tidligere beskrevet [10].
Fremstilling av HGF og VEGF i cellekultursupernatanter
Celler (2 x 10
5) ble dyrket i 2 ml medium med 10% FBS i 24 timer, vasket med PBS og inkubert i 48 timer i medium med 10% FBS. I noen eksperimenter, ble HGF tilsatt til mediet. De kulturmedium ble høstet og sentrifugert, og supernatantene ble lagret ved -70 ° C inntil analyse. Konsentrasjonene av HGF og VEGF ble bestemt ved EIA IMMUNIS HGF (Institute of Immunology, Tokyo, Japan) og VEGF Quantikine ELISA (R 0,01 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
mTOR-hemmere undertrykke levedyktighet
EGFR
mutante lungekreft celler i nærvær av HGF.
PC-9 og HCC827 er menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer med sletting av ekson 19 i
EGFR
, noe som resulterer i konstitutiv aktivering av dette proteinet. Disse cellelinjene var følsomme for erlotinib, mens HGF indusert erlotinib motstand (Fig. 1). Behandling med enten mTOR-hemmer (temsirolimus eller everolimus) alene discernibly trykt levedyktigheten til disse cellelinjene. Under disse forsøksbetingelser ble HGF ikke redusere følsomheten av disse cellelinjene til noen av medikamentene. Disse resultatene antyder at mTOR-inhibitorer effektivt kan kontrollere veksten av
EGFR
mutante lungekreftceller, uavhengig av tilstedeværelsen av HGF som ville indusere EGFR-TKI motstand.
PC-9 eller HCC827 cellene ble inkubert med eller uten erlotinib, temsirolimus, eller everolimus, i nærvær eller fravær av HGF (20 ng /ml) i 72 timer. Deretter ble cellelevedyktigheten bestemt ved MTT-analyse. Søylene viser SD. Dataene som vises er representative for 5 uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Vår tidligere studie viste at pasienter med NSCLC, er HGF primært oppdaget i kreftceller med ervervet resistens mot EGFR-TKI, noe som tyder på at fremstilling av HGF av disse cellene skjer hovedsakelig via en autokrin mekanisme. For ytterligere å undersøke effekten av mTOR-hemmere på autokrint HGF produksjon, genererte vi stabile
HGF
-Gene transfektanter i PC-9 celler (PC-9 /HGF). PC-9 /HGF-celler utskilt høye konsentrasjoner av HGF (28 ± 1 ng /48 h), mens konsentrasjonen av HGF utskilt ved hjelp av PC-9- og kontroll vektor-transfiserte PC-9 /vec celler var under påvisningsgrensen. I tillegg PC-9 /HGF cellene ble motstandsdyktige mot erlotinib (fig. 2). Vi fant ut at temsirolimus eller everolimus discernibly redusert levedyktigheten til både PC-9 /Vec og PC-9 /HGF celler i samme grad, mens kombinasjonen av mTOR-hemmer pluss erlotinib hadde ingen effekt på PC-9 /Mer celler i nærvær av HGF, noe som indikerer at mTOR-hemmere ikke lenger bevisstgjøre disse cellene til å erlotinib
in vitro plakater (fig. S1). Slå ned av mTOR ved siRNA resulterte i inhibering av levedyktigheten til PC-9 /Vec og PC-9 /HGF-celler med 30% (Fig S2 B), noe som indikerer at inhiberte cellelevedyktigheten ved temsirolimus selv i nærvær av HGF er på grunn av mTOR inhibering. Vi utførte også flowcytometri ved hjelp Annexin V og funnet at temsirolimus induserte ikke merkbar apoptose i PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF celler (fig. S3). Disse funnene tyder på at mTOR-hemmere, når det brukes som enkle midler, undertrykke vekst av
EGFR
mutante lungekreftceller via hemming av spredning i stedet for induksjon av apoptose.
PC-9 /Vec og PC -9 /HGF celler ble inkubert med erlotinib (A), temsirolimus (B), eller everolimus (C) i 72 timer. Deretter ble cellelevedyktigheten bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Søylene viser SD. (D) PC-9 /vec og PC-9 /HGF-celler ble behandlet med eller uten erlotinib (0,3 uM), temsirolimus (0,3 uM), eller everolimus (0,3 uM) i 4 timer. Cellelysatene ble høstet og underkastet Western blotting. Dataene som vises er representative for 3 uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
mTOR-hemmere undertrykke p70S6K og 4EBP1 fosforylering selv i nærvær av HGF
For å utforske den molekylære mekanismen som mTOR-hemmere trykkes celleviabilitet selv i nærvær av HGF, undersøkte vi protein ekspresjon og fosforylering status av EGFR, MET, og deres molekylære (ERK1 /2, PI3K /AKT, p70S6K, og 4EBP1) i PC-9 /Vec og PC- 9 /HGF-celler ved western blotting (fig. 2D). PC-9 /Mer cellene uttrykte EGFR og møtte proteiner, mens bare EGFR var discernibly fosforylert. Erlotinib bart inhiberes fosforylering av EGFR, samt nedstrøms ERK1 /2 og AKT, men det marginalt hemmet p70S6K fosforylering. Mens verken temsirolimus eller everolimus påvirket fosforylering av EGFR, MET, ERK1 /2 eller AKT, de hemmet fosforylering av p70S6K og 4EBP1, nedstrøms molekyler av mTOR.
I PC-9 /HGF celler, MET var også fosforylert, antagelig på grunn av HGF som ble produsert på en autokrin måte. Erlotinib hemmet EGFR fosforylering, men det gjorde ikke bemerkelsesverdig hemme fosforyleringen av MET, AKT, p70S6K, eller 4EBP1. Mens verken temsirolimus eller everolimus hemmet fosforylering av EGFR, MET, ERK1 /2, eller AKT, de markert hemmet fosforylering av p70S6K og 4EBP1. Disse resultatene indikerer at mTOR inhibitorer undertrykke fosforyleringen av nedstrøms molekyler av mTOR, uavhengig av tilstedeværelsen av HGF.
mTOR inhibering undertrykker HGF-indusert vekst av erlotinib-resistente svulster
in vivo
Vi har evaluert ved om mTOR-hemmere vil kontrollere veksten av
EGFR
mutante lungekreftceller med HGF-utløst EGFR-TKI-motstand
in vivo
. Oral administrasjon av erlotinib undertrykte veksten av PC-9 /Mer-svulster, men ikke PC-9 /HGF svulster, indikerer motstand av PC-9 /HGF svulstene erlotinib
in vivo plakater (Fig. 3A). På den annen side, intravenøs administrasjon av temsirolimus undertrykte veksten av både PC-9 /Mer svulster og PC-9 /HGF svulster. Disse resultatene indikerte at mTOR-inhibering kan være anvendbar for å kontrollere veksten av HGF-induserte resistente tumorer
in vivo
.
(A) SCID-mus som bærer PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF-tumorer ble administrert 25 mg /kg en gang daglig erlotinib eller 50 mg /kg temsirolimus gang i uken fra dag 8 til dag 20. Tumorvolumet volumet~~POS=HEADCOMP ble målt ved anvendelse av calipers på de angitte dagene. Gjennomsnitt ± SE tumorvolumer er vist for grupper på 5 mus. * P 0,01 (enveis ANOVA). Dataene som vises er representative for 2 uavhengige eksperimenter med lignende resultater. (B) SCID-mus med PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF svulster ble administrert 25 mg /kg erlotinib gang daglig i 4 dager eller 50 mg /kg temsirolimus gang fra dag 8. Fire timer etter siste erlotinib administrasjon, svulster var høstet, og de relative nivåer av proteiner i kreftlysatene ble bestemt ved western blotting.
Vi videre vurdert de molekylære mekanismer som temsirolimus hemmet veksten av PC-9 /HGF-svulster. Western blot-analyser viste at erlotinib markert hemmet fosforylering av EGFR, ERK1 /2, og AKT, og litt trykkes fosforyleringen av p70S6K i PC-9 /Vec-tumorer (Fig. 3B). Mens erlotinib bemerkelsesverdig hemmet EGFR fosforylering, bare det litt hemmet ERK1 /2 og p70S6K fosforylering, mens det ikke hemme AKT fosforylering i PC-9 /HGF-svulster. På den annen side, selv om temsirolimus ikke markert påvirke fosforylering av EGFR eller ERK1 /2 i både PC-9 /Mer svulster og PC-9 /HGF svulster, det bemerkelsesverdig hemmet p70S6K fosforylering, noe som tyder på modusen for handling av dette stoffet som en mTOR-hemmer.
Interessant, temsirolimus litt hemmet Akt fosforylering i PC-9 /HGF svulster, men det økte AKT fosforylering i PC-9 /HGF celler
in vitro
tilstand (fig. 2D). For å klargjøre årsaken til dette avviket, vi undersøkte tidsforløpet av mTOR-hemmer behandling på AKT fosforylering
in vivo plakater (figur S4). Vi har funnet at i samsvar med resultatene fra
in vitro eksperimenter
, AKT-fosforylering i tumorene ble øket 4 timer etter temsirolimus behandling. Men da, nivået av AKT-fosforylering ble redusert, og det ble lett inhibert ved 96 timer etter behandling, i samsvar med de resultatene som er vist i fig. 3B. Derfor er avviket av resultatene mellom fig. 2D og fig. 3B var på grunn av forskjellen av de midlertidige prøvene ble høstet.
mTOR-hemming undertrykker angiogenese
in vivo
Vi har også undersøkt tumor celleproliferasjon (Ki-67) og angiogenese (CD31) ved immunhistokjemi. Erlotinib behandling markert hemmet tumor celleproliferasjon og angiogenese i PC-9 /Mer xenografter, mens erlotinib ikke påvirker celleproliferasjon eller angiogenese betydelig i PC-9 /HGF xenografter (Fig. 4). I kontrast, temsirolimus markert hemmet celleproliferasjon og angiogenese i både PC-9 /Vec og PC-9 /HGF svulster. Disse funnene tyder på at temsirolimus hemmer veksten av PC-9 /HGF svulster (i hvert fall delvis) ved å hemme angiogenese.
SCID-mus med PC-9 /Vec eller PC-9 /HGF svulster ble administrert som beskrevet i fig. 3B. Fire timer etter siste administrasjon av erlotinib, ble tumorer høstet, og tumorcelle-proliferasjon (A, B: Ki-67) og angiogenese (C, D: CD31) ble bestemt ved immunohistokjemi. B og D viser kvantifisering av positive celler.
* P 0,01, (enveis ANOVA). Søylene viser SD.
For ytterligere å utforske de molekylære mekanismer som hemmet temsirolimus angiogenese, undersøkte vi effekten på tumorcelleproduksjon av VEGF, en fremstående pro-angiogenic molekyl. Både PC-9 og PC-9 /Mer celler konstitutivt produsert påvisbare nivåer av VEGF, som ble stimulert av HGF (Fig. 5A). I samsvar med disse observasjonene, PC-9 /HGF celler produsert høyere nivåer av VEGF enn PC-9 og PC-9 /vec celler. Temsirolimus trykt VEGF produksjon i disse kreftceller i nærvær eller fravær av HGF. Slå ned av mTOR av siRNA resulterte i hemming av VEGF produksjon av PC-9 /Vec og PC-9 /HGF celler, akkurat som temsirolimus behandling (Fig S2). Disse resultatene indikerer at inhiberte VEGF produksjon av temsirolimus selv i nærvær av HGF skyldes mTOR inhibering. Vi vurderte også den direkte effekten av temsirolimus på levedyktigheten til endotelceller
in vitro
. Temsirolimus hemmet ikke konstitutiv levedyktighet HMVEC celler i medium med 10% FBS alene (Figur 5B). VEGF og HuMedia-MVg, som inneholder EGF og fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2), økt levedyktighet HMVECs. Temsirolimus, ved konsentrasjoner på 1 nM og høyere, hemmes denne økningen i levedyktighet. Disse resultatene indikerer at temsirolimus hemmer angiogenese ved flere mekanismer.
(A) Tumorceller ble inkubert med eller uten HGF (50 ng /ml) i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av temsirolimus i 48 timer. Deretter ble supernatanter ble høstet og antallet tumor celler ble tellet. VEGF-konsentrasjonen i supernatantene ble bestemt ved hjelp av ELISA. VEGF nivåer korrigert av tumorcelle nummer vises. (B) HMVECs ble inkubert i RPMI-1640 medium med 10% FBS (kontroll), RPMI-1640 medium med 10% -FBS pluss VEGF, eller HuMedia-MVg med forskjellige konsentrasjoner av temsirolimus i 72 timer. Deretter ble cellelevedyktigheten bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Søylene viser SD. Dataene som vises er 2 uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at mTOR-hemmere undertrykte veksten av
EGFR
mutant lunge kreftceller, selv i nærvær av HGF,
in vitro
og
in vivo
. Våre resultater tyder også på at mTOR inhibitorer undertrykke angiogenese ved inhibering av VEGF-produksjon og endotel proliferasjon stimulert med forskjellige pro-angiogene faktorer. Disse observasjoner tyder på at mTOR-inhibitorer, som monotherapeutic midler, er nyttige for å kontrollere utviklingen av
EGFR
mutant lungekreft og HGF-utløste motstand mot EGFR-TKI.
HGF, også kalt spredningsfaktoren , er et multifunksjonelt cytokin [31]. Nyere studier viser at HGF er involvert i kreftutvikling, invasjon /motilitet, EMT, angiogenese og metastase i lungekreft, og det er derfor forbundet med dårlig prognose av pasienter [32]. Vi har tidligere rapportert at HGF induserer EGFR-TKI-motstand i
EGFR
mutante lungekreftceller ved å gjenopprette MET /PI3K /AKT vei signaliserer [10]. HGF Overuttrykte er involvert ikke bare i ervervet resistens men også iboende motstand mot EGFR-TKI [21]. I tillegg HGF stimulerer VEGF produksjon av
EGFR
mutante lungekreftceller, så vel som letter angiogenese, for derved å fremme tumorprogresjon [24]. HGF overekspresjon er ofte co-oppdaget med
EGFR
-T790M gatekeeper mutasjon i oppkjøpte resistente svulster [9], [11], [21]. HGF induserer resistens mot irreversible EGFR-TKI og mutante EGFR-selektive TKI [33], som er utviklet for å overvinne T790M-mediert EGFR-TKI motstand. Nyere kliniske studier med irreversible TKI monoterapi ikke klarte å demonstrere en objektiv respons i
EGFR
mutante lungekreftpasienter som var resistente mot behandling med reversibel EGFR-TKI-gefitinib og erlotinib [34]. Disse funnene tyder på at sameksistens av endret HGF signalering bidrar til ugunstig reaksjon til irreversible EGFR-TKI hos disse pasientene [32]. I tillegg tilstedeværelsen av HGF akselererer veksten av eksisterende EGFR-TKI-resistente kloner som havn
MET
forsterkning [35]. Flere nylig, HGF ble rapportert å indusere resistens mot ALK-hemmere i
EML4-ALK
lungekreft [36] og BRAF-hemmere i
BRAF
mutant melanom [37]. Slike akkumulere bevis indikerer at HGF er et felles mål for å overvinne motstanden mot målrettede medikamenter i onkogen avhengige tumorer.
Våre resultater tyder også på at mTOR-hemmere har nytte av flere mekanismer for å undertrykke veksten av EGFR-TKI motstand utløst av HGF i
EGFR
mutante lungekreftceller. For eksempel, disse hemmere sannsynlig blokk mTOR /p70S6K /4E-BP1 overlevelse signaler som vanligvis er engasjert i PI3K /AKT aktivering i kreftceller. Den PI3K /AKT /mTOR vei bidrar til overlevelse av
EGFR
mutante lungekreftceller [38], [39]. Vi har tidligere rapportert at denne veien er også avgjørende for å skaffe HGF-utløste motstand mot EGFR-TKI i
EGFR
mutante lungekreftceller [40]. I denne studien, både temsirolimus og everolimus delvis undertrykte fosforylering av p70S6K og 4E-BP1, samt hemmet overlevelsen av
EGFR
muterte kreftceller
in vitro
. Dermed mTOR-hemmere oppnå veksthemming ved å undertrykke både overlevelsessignaler fra EGFR og motstand signaler fra MET i kreftceller.
En annen mulig mekanisme er hemming av angiogenese. Nyere studier har rapportert at mTOR-mediert signale stimulerer HIF-1α transkripsjon, som regulerer VEGF, via 4E-BP1 fosforylering [41]. mTOR-inhibitorer undertrykke HIF-1α transkripsjon og derved hemme VEGF produksjon [28], [29], [41] – [43]. Vi har tidligere rapportert at HGF aktiverer MET /GAB1 sti og øker VEGF produksjon av
EGFR
mutante lungekreftceller [24]. I denne studien fikk vi bekreftet dette funnet og videre vist at mTOR-hemmere trykt både konstituerende VEGF produksjon og HGF-stimulert VEGF produksjon. Videre fant vi at mens mTOR-hemmere ikke påvirker levedyktigheten av ustimulerte endotelceller, de hemmet endothelial spredning stimulert av ulike pro-angiogene faktorer, inkludert VEGF. mTOR aktiveres etter inngrep av flere reseptor-tyrosin-kinaser så som VEGFR-2, EGFR, og FGFR-1 [41]; dermed kan mTOR inhibitorer oppheve stimulering forårsaket av flere pro-angiogene faktorer på endotelceller. Derfor kan mTOR inhibitorer undertrykke angiogenese ved minst 2 moduser av handlinger. For det første kan de inhibere VEGF-produksjon, selv i nærvær av HGF. For det andre kan de hemme endotelceller spredning som er stimulert av ulike pro-angiogene faktorer.
Resultater av nyere kliniske studier med målrettede medikamenter viser viktigheten av pasientens valg. For eksempel, den svarprosent på gefitinib var bare 10-20% i uselektert NSCLC [44], men det var ca 80% i
EGFR
mutasjonspositive NSCLC [43]. Den progresjonsfri overlevelse av
EGFR
mutante lungekreftpasienter var også mye lenger enn for uselekterte NSCLC pasienter [45]. Mens et stort antall mTOR-hemmere er utviklet og blir evaluert i kliniske studier med lungekreft, verken av sirolimus, temsirolimus, eller everolimus, når det brukes som monotherapeutic midler, viser klinisk effekt i uselektert NSCLC [46] [47]. Videre nyere studier av mTOR-hemmere kombinert med EGFR-TKI også unnlatt å vise klinisk nytte i uselektert NSCLC [46], [48] – [50]. Vår nåværende studien er preklinisk, og vi viste at mTOR-hemmere har vist en betydelig effekt på lunge kreftceller med HGF-mediert resistens mot EGFR-TKI motstand både
in vitro Hotell og
in vivo
. Dong et al. rapporterte også anti-tumor aktivitet av mTOR inhibitorer mot EGFR-TKI-resistente
EGFR
mutante lungekreftceller med den T790M gatekeeperen mutasjonen [51]. Begge HGF og T790M gatekeeper mutasjoner er ofte oppdages i EGFR-TKI resistente svulster, hvor de bidrar til motstand. Derfor er disse observasjonene illustrerer nødvendigheten av kliniske studier med mTOR-hemmere i
EGFR
mutant lungekreftpasienter som blir motstandsdyktige overfor gefitinib og erlotinib. Dessuten, siden HGF gir resistens mot målrettede medikamenter i flere krefttyper, er kliniske studier av mTOR-hemmere garantert.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
mTOR-hemmere ikke lenger bevisst
EGFR
mutante lungekreftceller til erlotinib
in vitro
. PC-9 /vec celler ble inkubert med eller uten temsirolimus (A) eller everolimus (B), i nærvær eller fravær av HGF (20 ng /ml) og erlotinib (0,3 pM) i 72 timer. Deretter ble cellelevedyktigheten bestemt ved MTT-analyse. Søylene viser SD. Dataene som vises er representative for 3 uavhengige forsøk med samme resultat
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062104.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Knock-down av mTOR hemmet cellevekst og VEGF produksjon. Tumorceller ble transfektert med mTOR eller tak siRNA i 24 timer og (A) cellelysatene ble høstet og underkastet Western blotting.
