Abstract
Annonaceous acetogenins, en stor familie av naturlig forekommende polyketider isolert fra ulike arter av planten genus
annonaceae
, har blitt funnet å vise signifikant cytotoksisitet mot en rekke kreftceller. Tidligere studier viste at disse forbindelsene kan fungere på mitokondrier kompleks-I og blokkerer den tilsvarende elektrontransportkjeden og avslutte ATP produksjon. Men flere detaljer om virkningsmekanismer forbli tvetydig. I denne studie ble det undersøkt virkningen av et sett av mimetika av Annonaceous acetogenin på enkelte kreftcellelinjer, og rapporterer at blant dem AA005 oppviser den mest potente antitumoraktivitet. AA005 utarmer ATP, aktiverer AMP-aktivert protein kinase (AMPK) og hemmer mTOR kompleks 1 (mTORC1) signal sti, som fører til veksthemming og autofagi av tykktarmskreftceller. AMPK hemmere sammensatte C og inosine undertrykke, mens AMPK aktivator AICAR forsterker, AA005-forårsaket spredning undertrykkelse og påfølgende autofagi av tykktarmskreftceller. AA005 forbedrer ATP uttømming og AMPK aktivering forårsaket av to-deoksyglukose, en hemmer av mitokondrie respirasjon og glykolyse. AA005 hemmer også kjemoterapeutisk middel cisplatin-utløst oppregulering av mTOR og synergizes med dette stoffet i undertrykkelse av spredning og induksjon av apoptose av tykktarmskreftceller. Disse data indikerer at AA005 er en ny metabolsk inhibitor som oppviser terapeutiske potensialer i tykktarmskreft
relasjon:. Liu Y-Q, Cheng X, Guo L-X, Mao C, Chen Y-J, Liu H-X, et al. (2012) Identifisering av en Annonaceous Acetogenin Mimetic, AA005, som AMPK Activator og Autophagy induser i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 7 (10): e47049. doi: 10,1371 /journal.pone.0047049
Redaktør: Xiaolin Zi, University of California Irvine, USA
mottatt: 31 januar 2012; Godkjent: 11 september 2012; Publisert: 08.10.2012
Copyright: © Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Key Program for Basic forskning (2012CB910800, 2010CB833200 og 2009CB940900), National Natural Science Foundation (No. 81071930, 81171925, 20972160 og 21172220), Spesial Foundation av presidenten og Key Prosjekt of Knowledge Innovation Program av den kinesiske Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 og KSCX2-YW-R-235), og National store vitenskapelige og tekniske Program for Drug Discovery (2009ZX09103-101). Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i tumorceller er det en økt glykolysen enzymer og glukosetransportører selv i nærvær av en høy O
2-konsentrasjon, til slutt fører til en forhøyet ATP produksjonshastighet [1]. Klinisk bevis har koblet celle metabolisme med kreft utfall, og omprogrammering energiomsetningen er godkjent for å være en voksende kjennetegn på kreft [2]. Disse observasjonene har hevet interessen rettet mot energiomsetningen for kreftbehandling for både hypoksisk (glycolytic) og oksidative svulster [1], riktignok også bekymring for at disse behandlingene vil ha uakseptable effekter på normale celler. Forbløffende nok noen av de første kreft terapi rettet mot spesifikke metabolske behov kreftceller forblir effektiv i klinikken i dag, re-inspirerende innsats for å målrette metabolske avhengig av kreftceller som en selektiv kreft strategi [3].
AMP- aktivert protein kinase (AMPK) som finnes i celler som en heterotrimeric kompleks sammensatt av et katalytisk subenhet kinase (α) og to regulatoriske subenheter (p og y) er en sensor av energistatus som opprettholder celle energihomeostase. Den aktiveres ved et fall i ATP (samtidig med en økning i ADP og AMP) eller stimuli som øker den cellulære AMP /ATP-forholdet, noe som resulterer i aktivering av katabolske veier og inhiberingen av anabole trasé [4], [5]. Vesentlig til aktivering av AMPK er dets fosforylering ved Thr-172 ved en oppstrøms AMPK kinaser (AMPKKs) [6] og tumor suppressor LKB1 [7] som er en serin /treonin kinase forbundet med gastrointestinal polyposis og kreft [8] og lungekreft [ ,,,0],9]. AMPK fosforylerer to hastighetsbegrensende enzymer i fettsyrer og kolesterol syntese: acetyl-CoA-karboksylase (ACC) og HMG-CoA-reduktase, så vel som andre nedstrøms mål, som kulminerte i hemming av anabole trasé og aktivering av katabolske veier [5] . AMPK aktivering begrenser direkte translasjons-initierende og proteinsyntese [10], ved hemming av translasjon elongeringsfaktor 2 (EF2) [11], og indirekte gjennom TSC2, som fører til undertrykkelse av pattedyr målet for rapamycin (mTOR) [12] som kan fosforylere og aktiverer p70 S6-kinase og 4E-bindende protein (4EBP) [13].
AMPK aktivering av AMP analog 5-aminoimidazol-4-karboksamid ribonukleotid (AICAR) akkumulerer cyklinavhengig kinase inhibitorer p21 og p27 og ned-regulerer cyklin D1 i humane leverkreft-celler, noe som fører til cellesyklus-stans ved G1 fase [14]. Befolkningsstudier gi ledetråder at bruk av metformin som er en AMPK aktivator, kan være forbundet med redusert forekomst og forbedret prognose for visse kreftformer [15], [16]. I brystkreft, utøver metformin hemmende effekter via hemming av mTOR-avhengige oversettelse initiering [17], [18]. Metformin hemmer proliferasjon, minsker cellenes levedyktighet og blokkerer cellesyklus i G1 fase i prostatakreftceller, og in vivo-behandling med metformin fører til en betydelig reduksjon av tumorvekst i mus som bærer xenotransplantater av prostatacancerceller [19]. Metformin og AICAR indusere apoptose og undertrykker svulst vekst av tykktarmskreft linjen HCT116 p53 (- /-) xenografter, og utløse autofagi av HCT116 p53 (+ /+) celler [20]. AICAR og protein folding hemmer 17-AAG, spesielt når kombinert, viser effekt mot aneuploide humane kreftcellelinjer [21]. Disse resultatene indikerer at AMPK kan være en rasjonell medikamentmålet og blyforbindelser skal identifiseres eller utformet for utvikling av terapeutiske muligheter for krefttyper.
Annonaceous acetogenins representerer en klasse av naturlig forekommende polyketider isolert fra ulike arter av planten slekten
annonaceae product: [22]. Disse forbindelsene utviser forskjellige bioaktivitet, inkludert lovende cytotoxicites og Antiparasittiske aktiviteter [23]. Selv om studier viser at Annonaceous acetogenins kan forstyrre mitokondrienes funksjon gjennom å blokkere mitokondriene kompleks I og ubiquinone bundet NADH oxidase [23], og binde den tredje matrise-side løkke av ND1 subenheten i mitokondrielle NADH-ubiquinone oksidoreduktase [23], [24], virkningsmekanismer av disse forbindelsene i bekjempelse av kreft fortsatt i stor grad ukjent. Kjemien gruppen av vårt team hadde designet og syntetisert en rekke Annonaceous acetogenin etterligninger [25] – [28]. I dette arbeidet har vi testet biologisk aktivitet av noen nye analoger og undersøkt mekanismene bak Annonaceous acetogenins «Cytotoksisiteten, og rapporterte at en mimetisk AA005 som viste kraftige og selektive inhiberende aktivitet mot en rekke kreftceller, var i stand til å aktivere AMPK og indusere celle syklus arrest fulgt av autofagi, demonstrere sine terapeutiske potensialer
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Annonaceous acetogenin etterligninger (tabell 1) ble oppløst i DMSO og lagret ved. – 20 ° C. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble innkjøpt fra Amresco Inc. (Solon, OH). Forbindelse C, rapamycin, rotenon, inosine, Rhodamine 123, 2-DG og AICAR ble kjøpt fra Sigma. MitoTracker Deep Red FM ble kjøpt fra Invitrogen. ATP Assay Kit ble kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Haimen, Jiangsu, Kina)
Antistoffer
De antistoffer som brukes i denne undersøkelsen var som følger:. Anti-β-Actin ( Sigma); anti-p-AMPKα1, anti-p-ACC, anti-p-mTOR, anti-p-S6K, anti-AMPKα1, anti-ACC, anti-mTOR, anti-S6K, anti-PARP, geit anti-kanin IgG- HRP og geit anti-mus IgG-HRP-antistoff (Cell Signaling Technology); anti-CyclinD1 (Abcam), anti-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology), og anti-LC3 (Sigma).
Cell Kultur og Transfeksjon
lungekreft cellelinje A549, brystkreft celle linje MCF-7, ble livmorhalskreft cellelinje HeLa, koloncancercellelinjer LoVo, SW480, HCT116 og HT29, og humane embryonale nyre HEK-293T-celler oppnådd fra American Tissue Culture Collection (ATCC). Humane embryonale lunge fibroblast MRC-5, magekreft cellelinje SGC7901, og leverkreft cellelinje BEL7402 ble kjøpt fra Celle Resource Center, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing). Den normale menneskelige bronkiale epitelceller (HBEpiC) ble kjøpt fra ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, California). Den 293T, A549, BEL7402, HeLa, MCF-7, SGC7901 og de humane normale bronkiale epitelceller BEAS-2B [29]-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL , Grand Island, New York), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. LoVo, SW480, HCT116 og HT29-celler ble dyrket i DMEM /F12 supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. MRC-5-celler ble dyrket i MEM /EBSS medium supplementert med ikke-essensielle aminosyrer, 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. HBEpiC celler ble dyrket i et serumfritt medium bronkiale epitelceller (ScienCell Research Laboratories) inneholdende bronkial epitelial cellevekst supplement (ScienCell Research Laboratories). De pQCXIP-GFP-LC3 og pQCXIP-GFP plasmider [30] ble transfektert inn i Lovo-celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Qiagen) i henhold til den anbefalte protokoll fra produsenten.
celleviabilitet, celleproliferasjon og klonogene Assays
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP (5 x 10
3) ble sådd ut i hver brønn av 96-brønners vevskulturplater (Coaster, Charlotte, NC) og behandlet med Annonaceous acetogenin mimetika i 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. MTT-analysen ble utført som beskrevet [31], og IC
50-verdier ble beregnet ved anvendelse av CalcuSyn software (versjon 2.0, Biosoft, Cambridge, UK). Cellelevedyktigheten ble bedømt ved trypan blå eksklusjon fargestoff. Potensialet synergistisk, additiv eller antagonistisk effekt mellom AA005 og 2-DG eller cisplatin ble nøye vurdert ved hjelp av Calcusyn programvare (Biosoft, Cambridge, UK) som beskrevet [32]. Den dose-effektkurver for enkel eller kombinert behandling ble analysert ved hjelp av median-effekt-metoden [33], hvor kombinasjonsindeksene (CI) mindre enn, lik, og som er større enn en indikerer synergistisk, additiv og antagonistisk effekt, henhold .
For foci formasjon, HT29, Løvø eller HCT116 behandlet med AA005 ble sådd i tre eksemplarer til 35 mm plater (200 celler per plate). Etter 8 dager med dyrking ble cellene farget med Giemsa og kloner som inneholder mer enn 50 celler ble telt [29].
Analyse av Cellesyklus og apoptose
For å oppdage cellesyklus distribusjon, tykktarm kreftceller ble synkronisert til G1 /S-grensen ved en dobbel tymidin blokk [31], og deretter eksponert for AA005 ved indikerte konsentrasjoner i 24 timer. Cellene ble høstet, fiksert med 70% kald etanol i 4 ° C over natten. Cellene ble sentrifugert og vasket med PBS, etterfulgt av inkubasjon med RNase og propidiumjodid (PI) (Sigma-Aldrich). Cellesyklus distribusjon ble analysert ved flowcytometri (BD FACS Vantage Diva, USA). Cell apoptose ble målt ved hjelp av PE Annexin V /PI apoptose Detection kit (BD Biosciences, San Jose, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Analyse av Celler med GFP-LC3 vesikler
Celler ble transfektert med pQCX-IP-GFP-LC3 og pQCX-IP-GFP-uttrykkende plasmider i 24 timer, og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AA005 i ytterligere 24 timer. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd /PBS i 15 minutter ved romtemperatur og analysert ved hjelp av konfokal mikroskopi ved 63 x forstørrelse. Prosentandelen av GFP-positive blemmer celler ble undersøkt [30].
Måling av mitokondrie transmembranpotensiale, ATP innhold og NAD
+ /NADH Ratio
Celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av Annonaceous acetogenin etterlignere i 24 timer. Den mitokondrielle transmembrane potensialet ble undersøkt som beskrevet [34], ATP-innholdet ble målt ved hjelp av en ATP Bioluminesens Assay Kit (Beyotime Institutt for bioteknologi), og NAD
+ /NADH ratio ble målt ved hjelp av Amplite ™ Colorimetric NAD /NADH Assay Kit ( AAT Bioquest, Inc., Sunnyvale, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
konfokalmikroskopi Analyser
Celler ble dyrket på Dekk og faste i 4% paraformaldehyde. Etter en kort vasking i PBS supplert med 100 mM glycin, ble objektglass blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA; Sigma) og 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter ved romtemperatur, og farget for fluorescens mikroskopi som beskrevet [ ,,,0],31]. Celler ved AA005-influensa ble undersøkt ved bruk av et Zeiss LSM 510 META mikroskop utstyrt med et 63 x olje-neddykking objektiv. Bildebehandling og analyse ble gjort med Zeiss LSM 510 programvareversjon 3.2, ImageJ Versjon 1.42 (National Institutes of Health), og Adobe Photoshop versjon 7.0 (Adobe Systems).
Western Blotting
Cell pellets ble lysert i RIPA-buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% deoksycholat, 1% TritonX-100, 1 mM EDTA, 5 mM NaF, 1 mM natrium-vanadat, og proteasehemmere cocktail ( Sigma). Celler ble lysert på is i 30 minutter i RIPA-buffer, ble sentrifugert lysater, proteinekstrakter ble kvantifisert og lastet på 10% til 15% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel, elektroforese og overført til en nitrocellulosemembran (Whatman). Membranen ble inkubert med primært antistoff, vasket og inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff. Deteksjon ble utført ved hjelp av en kjemiluminescerende vestlig deteksjonssett (Cell Signaling Technology) [35].
Statistical Analysis
Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD med mindre annet er angitt. Forskjeller mellom datagruppene ble evaluert for signifikans ved hjelp av Student
t
-test av uparede data eller enveis variansanalyse og Bonferroni post-test.
P
verdier 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
Struktur aktivitet Sivil (SAR) Analyse av Annonaceous Acetogenin etterligninger
En seriell Annonaceous acetogenin etterligninger. var blitt syntetisert ved utskifting av både tetrahydrofuran (THF), ringer naturlig bullatacin med en enkel dietylenglykol-eter enhet av kjemien gruppen av vårt lag [25] – [28]. Ni nye analoger ble syntetisert i dette arbeidet, og vi har funnet at det mimetika AA005 [25] og AA093, en forbindelse med innføringen av en 10-hydroksygruppe på AA005, representerte de to forbindelser som hadde de laveste IC50-verdier i denne innstillingen ( tabell 1). Observasjonen at forbindelse AA090 og AA091 mangler den høyre lakton enheten og venstre 11-karbon-hale oppviste en 17 til 170 ganger lavere cytotoksisitet i kreftceller foreslått at disse gruppene er avgjørende for cytotoksisitet av AA005. AA101 med en ytterligere lakton enhet innleiret i den venstre hydrokarbonkjede del oppviste en 23-142 ganger lavere cytotoksisitet i kreftceller, noe som ytterligere bekrefter viktigheten av lang hydrofob hale og den høyre terminalen lakton i etterligning. Tilsetning av et midtre eter enheten til mimetika (forbindelser AA102-105) litt forbedret deres anti-proliferativ aktivitet sammenlignet med AA101, noe som tyder på at en dietylenglykol-ether enhet er viktig for anti-proliferativ aktivitet. Den mangfoldige biologiske aktiviteten til disse etterligninger indikerer at de strukturelle analoger ikke kan være funksjonelle analoger.
hemmende effekter av AA005 på kreftceller
Fordi AA005 var den mest potente cytotoksiske middel blant disse etterligninger, vi ytterligere testet dens effekter på 11 humane kreftcellelinjer og 4 noncancerous cellelinjer (HBEpiC, MRC5, HLF og 293T), og fant ut at AA005 viste ulike effekter på kreftceller i at det hadde potent hemmende effekt på tykktarmen (HCT116, HT29, Løvø og SW480), mage (SGC7901), lever (BEL7402), lunge (A549) og bryst (MCF7-) kreft linjer, og svak effekt på livmor (HeLa) kreftceller (figur 1A). AA005 oppviste hemmende effekter på HCT116 (figur 1B), HT29 (figur 1C) og LoVo (figur 1D) celler i en dose- og tidsavhengig måte. Interessant, AA005 viste en enda svakere aktivitet mot noncancerous (HBEpiC, MRC5, HLF, BEAS-2B og 293T) celler (figur 1A og tabell 1). Disse resultatene indikerer at de relative selektive inhibitoriske virkninger av AA005 på kreftceller berettige ytterligere undersøkelse.
(A) IC
50 verdier av AA005 (i 48 timer) for ulike human kreft og noncancerous cellelinjer. IC
50-verdier (gjennomsnitt ± SD, uM) ble beregnet fra 3 uavhengige eksperimenter. (B til D) MTT analyser av HCT116 (B), HT29 (C) og Løvø (D) celler ved AA005 på Målt konsentrasjon og tidspunkter.
AA005 Undertrykker celleproliferasjon og kolonidannende aktivitet av Colon kreft celler
Vi videre analysert virkningene av AA005 på tykktarm kreft celler. Ved hjelp av trypanblått-utelukkelse analyser viste vi at behandling med AA005 på 50 til 200 nM i 24 til 48 timer markert inhibert proliferasjon av HT29, LoVo og HCT116, men ikke HBEpiC eller BEAS-2B-celler (figur 2, A og B) . Foci-analysen viste AA005 potente hemmende effekt på kolonidannende aktivitet av tykktarmskreftceller (Figur 2C). Vi analyserte virkningene av AA005 på cellesyklus og fant at AA005 forårsaket en vesentlig økning i prosentandelen av tykktarmskreftceller i G1 fase på en doseavhengig måte (figur 2D).
(A, B) Indikert cellene ble behandlet med eller uten AA005 i 48 timer eller indikerte tidspunkter, og analysert ved hjelp av trypanblått-eksklusjon assay. (C) kolonidannelse analyse for klonogene aktiviteten av tykktarmskreftceller behandlet med eller uten AA005. (D) koloncancer-celler ble behandlet med AA005 ved indikerte konsentrasjoner i 24 timer. Cellesyklus distribusjon ble bestemt ved flowcytometri.
AA005 Targets Mitokondrier, utarmer ATP og aktiverer AMPK i tykktarm kreft celler
Fluorescein-merket AA005 (AA005-influensa, figur 3A) var vellykket gjennomført av en biologisk aktivitet vurdering assistert protokollen etter å ha undersøkt en rekke potensielle derivatposisjoner parallelt [36]. AA005-influensa ble funnet å vise tilsvarende celle selektivitet til sin foreldre molekyl, og akkumuleres i mitokondriene av leverkreft, men ikke normale celler [36]. Ved å bruke immunofluoresence konfokalmikroskopi analyse, viste vi at AA005-influensa kan co-lokalisere med mitokondrier i HT29, HCT116 og Løvø celler (Figur 3B). Men AA005-influensa signal var veldig svak i mitokondriene av HBEpiC eller 293T celler (Figur 3B). Mens AA005-influensa hemmet spredning av Løvø, HT29 og HCT116 cellene på en doseavhengig måte, dets cytotoksiske effekt på HBEpiC var svak (Figur 3C). Videre rapporterte vi at AA005 kunne øke rhodamin 123-negative fraksjonene i HT29 og Løvø, men ikke HBEpiC celler (Figur 3D). Disse resultatene tyder på at AA005 kan målrette mitokondrielle molekyler og således forurolige energiske reaksjonsveien av kreftceller.
(A) Kjemisk struktur av AA005-fluorescein. (B) Den intracellulære lokalisering av AA005. Cellene ble ko-inkubert med AA005-influensa ved 100 nM i 12 timer og analysert ved konfokal mikroskopi ved anvendelse av en mitotracker (rød) for å motvirke-flekk mitokondriene. (C) MTT-analysen av LoVo, HT29, HCT116 og HBEpiC celler ved AA005-influensa ved indikerte konsentrasjoner i 48 timer. (D) AA005 reduserer mitokondrie transmembrane potensialet i tykktarm kreft celler avslørt av økningen i rhodamin 123-negative celler. Cellene ble behandlet med AA005 ved angitte konsentrasjon i 24 timer og analysert ved hjelp av rhodamin 123 farging og flowcytometri. (E) Cellene ble behandlet med eller uten AA005 ved angitte konsentrasjon i 24 timer, ble NAD
+ /NADH-forholdet målt ved anvendelse av en kolorimetrisk AmpliteTM NAD /NADH Assay Kit. (F) Cellene ble behandlet med eller uten AA005 ved angitte konsentrasjon i 24 timer, og ATP-innhold ble målt ved bruk av en ATP-Bioluminesens Assay Kit. (G) Cellene ble behandlet med AA005 ved angitte konsentrasjon og tidspunkter, lysert, og Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av angitte antistoffer.
Mitokondrier målsøkende midler (mitocans) er tilbøyelige til å forstyrre oksydasjon fosforylering pathway og reduksjon av NAD
+ /NADH-forholdet, noe som resulterer i hemming av ATP-produksjon og aktivering av AMPK som er reflektert ved fosforylering og inaktivering av acetyl-CoA-karboksylase (ACC) (Ser79) som er en indikator for AMPK aktivitet [37]. Vi har testet effekten av AA005 på celle NAD
+ /NADH-forhold og ATP-innhold, og fant at i HT29 og LoVo-celler, behandling med AA005 på 50 til 200 nM for 24 timer redusert NAD
+ /NADH-forhold ( Figur 3E) og utarmet ATP i en doseavhengig måte (figur 3F), mens interessant, AA005 kunne ikke betydelig redusere NAD
+ /NADH-forhold og ATP-innhold i HBEpiC celler (figur 3E og F). Videre AA005 markert oppregulert p-AMPK og p-ACC i en dose- og tidsavhengig måte (figur 3G). Men disse fenomenene ble ikke observert i HBEpiC celler (Figur 3G).
Vi viste at AA005 samt mitocans AICAR og rotenon forårsaket ATP uttømming i HT29 og Løvø celler, mens AMPK hemmere forbindelse C og inosine svekket denne effekt (figur 4A). AA005, AICAR og rotenon oppregulert p-AMPK og p-ACC, mens forbindelse C og inosin redusert AA005-utløste oppregulering av de to molekyler (figur 4B). I tillegg, mens AA005 hemmet spredning av HT29 og Løvø celler, sammensatte C og inosine redusert denne effekten (Figur 4C). Disse resultatene tyder på at AMPK aktivering er nødvendig for AA005-indusert cytotoksisitet til tykktarmskreftceller.
(A) De indikerte Cellene ble behandlet alene eller sammen med combinatory AA005 (100 nM), AICAR (AA, 1 mM), retenone (1 uM), forbindelse C (CC, 10 uM), eller inosin (20 mM) i 24 timer, og ATP-innhold ble målt. (B) HT29 og LoVo-celler ble behandlet med den angitte protokoll, lysert, og Western blotting ble utført ved bruk av angitte antistoffer. (C) HT29 og Løvø celler ble behandlet med ulike behandlingsregimer for 48 timer, og celleviabilitet ble oppdaget av MTT-analyse.
AMPK aktivering som megler AA005-indusert mTOR kompleks 1 (mTORC1) Hemming in vitro
Aktivert AMPK phosphorylates TSC2 på Thr-1227 og Ser-1345 og øker aktiviteten av TSC1-TSC2 komplisert å hemme mTOR [12]. Vi testet effekten av AA005 på mTORC1, og rapporterte at AA005 redusert p-mTOR og p-S6K (P85 og P70 S6K) i Løvø og HT29 men ikke HBEpiC celler (figur 3G). AICAR og rotenon også nedregulert p-mTOR i HT29 og Løvø celler (figur 4B). Imidlertid AA005-indusert p-mTOR nedregulering kan være delvis undertrykt av inosin og forbindelse C (figur 4B). Forbindelse C og inosine også delvis svekket cyclin D1 nedregulering forårsaket av AA005 (figur 4B).
AMPK /mTOR signale er involvert i AA005 Induced Autophagy in vitro
AMPK aktivering kan indusere autofagi via hemming av mTOR (49). Vi testet om AA005 kan indusere autophagy i tykktarmskreftceller, eller ikke ved å detektere forandringene i cytosoliske formen (LC3-I) og lipidert form (LC3-II) i autophagy markør LC3. Interessant, fant vi at AA005 indusert opphopning av LC3-II i Løvø celler i et tids- og doseavhengig måte (figur 5A). Den pQCXIP-GFP-LC3 plasmid ble transfektert inn i Lovo-celler som deretter ble behandlet med AA005 ved 100 nM i 24 timer, etterfulgt av konfokal mikroskopi vurdering. Vi viste at mens kontrollceller viste en diffus farging, Løvø celler ved AA005 eller mTOR-hemmer rapamycin (100 nM) viste en flekkete fluorescerende fargemønster, noe som indikerer omfordeling av LC3 å autophagosomes (figur 5B). Interessant, inosine svekket AA005-forårsaket dannelsen av LC3 autophagosomes (figur 5B) og akkumulering av LC3-II (figur 5C). Disse resultatene indikerer at AA005 induserer autofagi av tykktarmskreftceller via AMPK /mTOR signalveien. Imidlertid behandling med AA005 på 50-200 nM i 24 timer, eller 100 nM for 12 til 48 timer resulterte ikke i sterk apoptose av LoVo-celler, som reflekteres av Annexin V /PI farging og flowcytometri vurdering (figur 5D) eller Western blot-analyse fra spalting av PARP, et substrat av aktivert Casp-3 (figur 5E).
(A) Immunoblot-analyse av LC3-i og LC3-II i Lovo-celler behandlet med AA005. (B) LoVo-celler transfektert med pQCXIP-GFP eller pQCXIP-GFP-LC3 plasmid ble behandlet i 24 timer med AA005 (100 nM) og /eller inosin (20 mM), og rapamycin (100 nM), og vurdert ved immunofluorescens analyser. (C) LoVo-celler ble behandlet med den angitte protokoller, lysert, og Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av angitte antistoffer. (D) LoVo-celler ble behandlet med AA005 eller cisplatin (20 uM) i 24 timer, eller AA005 ved 100 nM for angitte tidspunkter. Cellene ble så analysert ved hjelp av Annexin V /PI farging og flowcytometri. (E) Western blot analyser av lysatene av Løvø celler behandlet med AA005 eller cisplatin (20 mikrometer i 24 timer).
AA005 synergizes med 2-deoxyglucose og Cisplatin i Hemme Colon Cancer Cell Proliferation av Modifisering av AMPK og mTOR
2-deoxyglucose (2-DG) er et syntetisk glukoseanalogenen stand til å hemme glykolyse og ATP produksjon [38]. Vi testet de kombinerte virkninger av AA005 og 2-DG i Lovo-celler, og funnet at kombinerte bruk av de to midlene som utøves synergisme i inhibering av celleproliferasjon (figur 6A og B) og undertrykkelse av ATP generasjon (figur 6C). AA005 i kombinasjon med 2-DG førte til forbedret opp-regulering av p-AMPK og p-ACC, og nedregulering av p-mTOR og CDK4 (figur 6D).
(A, B) Lovo-celler ble behandlet angitt-protokollene i 48 timer, analysert ved MTT-assay (A), og de kombinerte effekter ble evaluert av Chou-Talay fremgangsmåte og Calcusyn programvare (B). Kombinasjonen indekser (CI) mindre enn, lik, og større enn 1 indikerer synergi, additiv og antagonistiske effekter, henholdsvis. (C) LoVo-celler ble behandlet med 50 nM AA005 eller /og 5 mM 2-DG i 24 timer, og ATP-innhold ble bestemt som beskrevet ovenfor. (D) Western blot analyser av lysater av LoVo-celler ble behandlet med AA005 eller /og 2-DG ved hjelp angitte antistoffer. (E, F) LoVo-celler ble behandlet angitte protokoller i 48 timer, analysert ved MTT-assay (E), og de kombinerte effekter ble evaluert av Chou-Talay fremgangsmåte og Calcusyn programvare (F). (G) Western blot analyser av lysater av LoVo-celler ble behandlet med AA005 eller /og ved hjelp av cisplatin angitte antistoffer. (H) LoVo-celler ble behandlet med AA005 og /eller cisplatin, og analysert ved hjelp av Annexin V /PI farging og flowcytometri. (I) Cellene ble behandlet med AA005 og /eller cisplatin i 24 timer, og ATP-innhold ble målt ved bruk av en ATP-Bioluminesens Assay Kit. (J) LoVo-celler ble behandlet med AA005 og /eller cisplatin i 24 timer, og cellesyklusfordelingen ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri.
kjemoterapeutisk middel cisplatin kan oppregulerer mTOR overlevelsesreaksjonsveien som gir legemiddelresistens til kreftceller [39]. Vi viste at mens AA005 og cisplatin forårsaket synergistisk inhiberende virkning på celleformering LoVo (figur 6E og F), redusert AA005 cisplatin-utløste oppregulering av mTOR og S6K (figur 6G). Kombinert bruk av AA005 og cisplatin førte til økt apoptotiske effekt på LoVo-celler, reflektert av Annexin V /PI farging og flowcytometri vurdering (fig 6H) eller Western blot-analyse av spalting av PARP (figur 6G). Men kombinasjonen av disse to midlene ikke forårsake synergi i uttømming av ATP-innholdet (figur 6I), cellesyklus-stans (figur 6J), eller autophagy (reflektert ved uttrykket LC3-II, figur 6G) i Lovo-celler.
Diskusjoner
Annonaceous acetogenins representerer en rekke C-35 /C-37 naturlige produkter med hydroksylerte THF og γ-laktonringer strukturer [25], [26], [28]. Mange medlemmer av denne familien skjerm cytotoksisk aktivitet ved forstyrrelse av terminal elektronoverføringstrinn i kompleks I i mitokondriene [40]. AA005 er et mimetisk av Annonaceous acetogenin hvor både THF ringene er erstattet med en etylenglykoleter enhet. AA005 beholder de funksjonene av de naturlige acetogenins og viser kraftigere biologisk aktivitet [41]. I denne studien rapporterer vi at AA005 er i stand til å aktivere AMPK og hemme mTOR, derfor arrestasjoner cellesyklus i G1 fasen og induserer autofagi av tykktarmskreftceller. AA005 synergi med glykolyse inhibitor 2-DG for merket ATP generasjon blokade, og antagoniserer cisplatin-indusert oppregulering av p-mTOR, som fører til økt proliferasjon inhibering og induksjon av apoptose i tykktarmskreftceller. Disse resultatene indikerer at AA005 bærer terapeutiske potensialer i hvert fall i denne type ondartet svulst
Målrette kreft celle metabolisme, spesielt glykolyse hemming, har dukket opp som en ny lovende strategi for å bekjempe kreft [42] -. [44]. Mitokondrier ikke bare administrere energiproduksjon via sitronsyresyklusen (tricarboxylic syresyklusen, TCA syklus), men også spille en sentral rolle i apoptose regulering gjennom frigjøring av cytokrom C. Selv om det har mye debatt om hvorvidt mitokondriene har defekter i oksidativ fosforylering vei, det kan være et potensielt mål for cancerterapi [42], [45]. Noen mitocans som metaformin og vitamin E-analoger som inhiberer kompleks I og II viser effektiv og selektiv anti-kreft-aktivitet. Disse agentene indusere kreft celledød gjennom generasjon av superoksid og mitokondrie destabilisering [46]. ATP kan også bli brukt i en viss grad ved behandling av mitocans [42], [45]. Mitokondrier kompleks I er blitt vist å bli målrettet ved Annonaceous acetogenin [40]. Vi rapporterer at AA005 kan co-lokalisere med mitokondrier i tykktarmskreft, men ikke HBEpiC eller 293T celler (figur 3a), noe som tyder på at AA005 kan redusere NAD
+ /NADH ratio og ATP produksjon i kreftceller. Denne muligheten er bekreftet i Løvø, HT29 og HCT116-celler (Figur 3C). Men hvorfor mitokondriene i kreftcellene er mer utsatt for å bli målrettet av AA005 fortsatt et åpent spørsmål. Inhibering av mitokondria ved metaformin og rotenon, kan føre til aktivering av AMPK [42]. Vi viser at AA005 kan også undertrykke mitokondrier og aktivere AMPK (figur 3).
