Abstract
Kantkonvall
lectin (POL), isolert fra tradisjonell kinesisk medisin urt
(Mill.)
Druce, har trukket økende oppmerksomhet på grunn av sitt store biologiske aktiviteter. I den foreliggende undersøkelse, anti-tumorvirkninger, inkludert apoptose- og Autophagy-induserende egenskaper av POL, ble bestemt ved en serie av cellebiologiske metoder så som MTT, cellulær morfologi observasjon, strømningscytometri, immunoblotting. Heri, fant vi at POL kunne samtidig indusere apoptose og autofagi i menneskelige ikke-småcellet lungekreft A549 celler. POL initiert apoptose gjennom å hemme Akt-NF-kB vei, mens POL utløst autofagi
via
undertrykke Akt-mTOR vei, noe som tyder på det molekylære bryteren rolle Akt i å regulere mellom POL-indusert apoptose og autofagi. Videre ROS var involvert i POL-indusert hemming av Akt uttrykk, og kan derfor formidle både apoptose og autofagi i A549 celler. I tillegg vises POL ingen signifikant cytotoksisitet mot normale humane embryoniske lungefibroblaster helf celler. På grunn av den anti-tumor aktivitet, kan POL bli en potent anti-kreft narkotika i fremtiden terapi, som kan bane vei for å utforske GNA-relaterte lektiner til effektive medisiner i behandling av kreft
Citation. Li C, Chen J, Lu B, Shi Z, Wang H, Zhang B, et al. (2014) Molekylær Switch rolle Akt i
Kantkonvall
lektin apoptose og Autophagy i Human Ikke-småcellet lungekreft A549-celler. PLoS ONE 9 (7): e101526. doi: 10,1371 /journal.pone.0101526
Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 15 januar 2014; Godkjent: 08.06.2014; Publisert: 03.07.2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Natural Science Foundation National of China (No. 81373311, nr 31300674, nr 30970643, nr 81173093 og nr J1103518), spesielle program for Youth Science and Technology Innovative Research Group i Sichuan-provinsen, Kina (No. 2011JTD0026). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lektiner er utpekt som karbohydratbindende proteiner som allment finnes i dyr, planter og mikroorganismer, og de kunne binde karbohydrater, agglutinate celler eller fremskynde polysakkarider og glycoconjugates [1]. Rapid fremskritt er oppnådd i isolering og karakterisering av plante lektiner, og nylig klassifisering av lektiner er emended fra 7 familier til 12 familier [2] – [4].
Av notatet, er kreft assosiert med programmert celledød (PCD), som spiller viktige roller i homeostase bevaring, cellulær differensiering, vekstkontroll, celle forsvar og etc., i fellesskap å tette endelige skjebnen til kreftceller [5]. Vanligvis er det to hovedtyper av PCD, med henvisning til apoptose og autofagi. Autophagy er en evolusjonært konservert cellulær mekanisme for klarering av skadede eller unødvendige makro komplekser og organeller i eukaryote celler, noe som fører til enten pro-overlevelse eller pro-døden effekter [6]. Apoptose, som kan reguleres ved en rekke molekylsignalveier, er hovedsakelig rettet for tumor selvmord. Autophagy og apoptose bærer tydelige morfologiske egenskaper og fysiologisk prosess, men det finnes fortsatt intrikate sammenhengen mellom dem [7].
Kantkonvall product: (Mill.) Druce, en typisk representant for Liliaceae familie, er en viktig tradisjonell kinesisk urtemedisin på grunn av sin brede varianter av biologisk aktive forbindelser.
Kantkonvall
lectin (POL), isolert fra
Kantkonvall product: (Mill.) Druce, er en mannose-bindende spesifikk
snøklokke
agglutinin (GNA) -relaterte familie lektin, og utøver bemerkelsesverdig vekst-hemming effekter mot A375 celler [8]. Tidligere rapport har vist at POL fremkalt L929-celle apoptose gjennom både død-reseptoren og mitokondrielle veier, samt forsterket TNFa-fremkalt L929-celle apoptose [9]. Men om POL kunne samtidig indusere apoptose og autofagi i kreftceller er fortsatt i sin barndom. Og hittil, kan bare
Polygonatum cyrtonema
lectin (PCL) samtidig indusere både apoptose og autofagi i humane melanoma A375 celler [10] og L929 celler [11]. Derfor apoptose- og autofagi-induserende effekter av POL skal utforskes.
Materialer og metoder
Molekylær modellering
Tredimensjonal struktur av POL ble konstruert ved hjelp av SWISS -modellen server (https://swissmodel.expasy.org/) med strukturen i PCL (PDB ID: 3A0E). som mal [12], [13]
Cell kultur
lunge adenokarsinom A549 cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA), mens normale menneskelige embryonale lunge fibroblast HELF cellelinjer ble kjøpt fra cellen bank (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina). Human ikke-småcellet lungecancer A549-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Gibco) inneholdende 10% FBS, 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen), 100 U /ml penicillin (Invitrogen), og holdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktig atmosfære. Og menneskelige embryonale lunge fibroblast HELF celler, brukt som tilsvarende kontrollgruppe, ble dyrket i Dulbecco minimal essensielt medium (Gibco) som inneholder de samme materialene.
Reagenser
POL ble renset og vedlikeholdt av vår lab [8]. Føtalt bovint serum (FBS), 3- (4,5-dimetrylthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB), monodansylcadaverine (MDC), autophagy inhibitor 3- metyladenin (3-MA), acridinoransje (AO), ble rhodamin-123 og z-VAD-FMK kjøpt fra Sigma Chemical (St. Louis, Missouri, USA). cytokrom
c
apoptotiske WB antistoff cocktail (ab110415) ble oppnådd for MitoSciences (Eugene, Oregon, USA). Små forstyrrende RNA (siRNAs) mot humant Beclin1 (# 6222), LC3 (# 6212) og kontroll siRNA (# 6568) ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies, USA
Følgende antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotech.: pro-caspase3 (# sc-7148), pro-caspase9 (# sc-56073), Bax (# sc-493), Bud (# sc-6538), BCL-2 (# sc-492), Bcl-X
L (# sc-8392), PARP (# sc-7150), NF-kB (# sc-109), fosfo-NF-kB (Ser536) (# sc-136 548) og β-aktin (# SC- 47 778). Dessuten antistoffer inkludert Phospho-Beclin1 (Ser234) (ab183335), mTOR (ab2732) og Phospho-mTOR (Ser2448) (ab109268) var fra Abcam. Antistoffer for LC3 (mAb # 12741), Akt (pan) (mAb # 4685), Phospho-Akt (Thr308) (mAb # 2965), Phospho-Akt (Ser473) (mAb # 4060), Phospho-p70S6K (Thr389) ( mAb # 9234) og Phospho-4EBP1 (Thr37 /46) (mAb # 2855) ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies, USA. Proteiner ble synliggjort ved anvendelse av anti-kanin eller anti-mus-IgG konjugert med peroksidase (HRP) og 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) som HRP-substrat.
konstitutivt aktivert Akt (Myr-Akt, Addgene plasmid 9008 ), ble NF-kB (T7-rELA, Addgene plasmid 23251), mTOR (Flag-mTOR, Addgene plasmid 26603), tom vektor (pcDNA3, Addgene plasmid10792) kjøpt fra Addgene.
vekst~~POS=TRUNC hemming~~POS=HEADCOMP analyse
A549-celler ble sådd på 96-brønners plater og dyrket i angitt tid, og de cytotoksiske effektene av forskjellige konsentrasjoner av POL ble utført som tidligere beskrevet [14]. Absorbans ved 570 nm ble målt med et spektrofotometer (modell 3550 mikroplateleser, Bio-Rad).
Celleviabilitet (%) = (OD
570 nm (narkotika) /OD
570 nm (kontroll )) x 100%.
mannose-inhiberingsanalysen
MTT-analysen ble bestemt som nevnt ovenfor, bortsett fra at lektiner ble preinkubert ved 37 ° C i 30 minutter med forskjellige typer mannoses, slik som mannose α (1,3), mannose α (1,6) og mannose α (1,3:1,6), som kan fullstendig inhibere den hemagglutinerende aktivitet ved forskjellige konsentrasjoner av POL.
Apoptose assay
A549 og helf-celler ble behandlet med PBS og 23 mikrogram /ml POL i 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer. Cellemorfologi ble fotografert ved fasekontrastmikroskopi (Leica, Wetzlar, Tyskland) så vel som fluorescens mikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan) med Hoechst 33342 farging. Deretter, totalt 6 x 10
5 A549-celler /brønn ble sådd ut i 6-brønns plater og inkubert i 24 timer, og ble behandlet med PBS eller 23 pg /mL POL i ytterligere 12 timer, 24 timer, 36 timer eller 48 h inkubasjon. Høstede celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri-analyse som beskrevet tidligere [15]. For ytterligere å klassifisere tidlig og sen apoptose i POL-behandlede A549-celler, ble Annexin V-FITC /PI dobbeltfarging analyse utført av Annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) apoptose deteksjon kit ifølge produsentens instruksjoner (BD Pharmingen, San Diego , CA, USA).
Autophagy analysen
etter inkubasjon med 23 mikrogram /ml POL for angitt tid, A549 og HELF celler ble dyrket med 0,05 mM MDC ved 37 ° C i 60 min. Fluorescensintensiteten av celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. I tillegg ble A549-celler inkubert med PBS og 23 mikrogram /ml POL for angitt gang farget med acridin oransje (10 ng /ml) i 15 minutter og underkastet flowcytometri. Celler ble henholdsvis transfektert med Beclin1 siRNA, LC3 siRNA og kontroll siRNA på 33 nm med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. De transfekterte celler ble brukt for senere eksperimenter 24 timer senere.
caspase analysen
Apoptose ble undersøkt ved å måle aktiviteten av caspase-3 ved hjelp av caspase-3-aktivitet kit (Beyotime Institutt for bioteknologi , Haimen, Kina) etter produsentens anvisninger.
Påvisning av mitokondriemembranen potensial
mitokondriell membranpotensialet ble målt ved hjelp av fluorescerende fargestoff rhodamine-123 som beskrevet tidligere [15]. Fluorescensintensiteten av A549-celler blandet med 23 mikrogram /ml POL i 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer ble analysert ved hjelp av strømningscytometri.
Bestemmelse av intracellulær ROS
Etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av POL for de indikerte tidsperioder ble A549-celler inkubert med 10 pM 2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) i 60 minutter ved 37 ° C. Fluorescensintensiteten av A549-celler ble målt ved flowcytometri med en eksitasjonsbølgelengde på 480 nm og en emisjonsbølgelengde på 525 nm. Intracellulær GSH-innhold og GPX-enzymaktiviteten ble målt i henhold til produsentens instruksjoner.
trans
A549-celler ble sådd ut i 60-mm skåler med RPMI 1640 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin nådde til en tetthet på 1 x 10
6 celler /skål. Deretter A549-celler kontinuerlig dyrket i PRMI 1640 uten 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i ytterligere 2 timer. For å danne plasmid-Lipofectamine LTX-komplekset, ble plasmidene blandet med 25X fortynningsmiddel Lipofectamine LTX, og inkubert i 20 minutter i romtemperatur. Da transfeksjoner ble henholdsvis gjennomført i OptiMem redusert serummedium (Invitrogen) inneholdende 1 mg /ml DNA, 0,1% PLUS-reagens og 0,3% Lipofectamine LTX transfeksjon reagens, og tilsatt mediet med plasmidet i 60-mm skåler for en annen 48 timer kultur av A549 celler. Til slutt ble transfeksjonseffektiviteten detektert ved Western-blot-analyse.
Western blot-analyse
A549-celler ble behandlet med 23 mikrogram /ml POL for angitte tid, og deretter både vedhengende og flytelegemer ble oppsamlet. Western blot-analyse av cellelysatene ble utført som tidligere nevnt [16], [17].
Statistisk analyse av dataene
Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter . Statistiske sammenligninger ble gjort av to-veis ANOVA og enveis ANOVA med Bonferroni post hoc test. En p value≤0.05 ble ansett som signifikant.
Resultater
Molekylær modellering av POL
Lektiner fra GNA-relaterte familien bærer forskjellig aminosyresekvens grunnlov, men de alle utstilt lignende tre-dimensjonal struktur. GNA-relaterte familie lektiner bære strenge mannose-bindende aktivitet, og konservert aminosyre motiv av «QXDXNXVXY» spiller viktige roller i mannose anerkjennelse. POL besatt tre bevarte «QXDXNXVXY» underdomener, og derfor POL var streng mannose-bindende lektin. Som vist på fig. 1A, den tredimensjonale struktur av POL ble bygget, og monomeren av POL oppviste en β-fat struktur som omfatter tre underdomener (I, II, III), hvor hver underdomene består av tre eller fire tråder av antiparallell β ark samspill av Ω loop.
(A) molekylære strukturen av POL monomer. (B) colon carcinoma Caco-2-celler, livmorhals carcinom HeLa-celler, ikke-småcellet lungekreft A549-celler, leverkreft HepG
2 og 7721-celler, brystkarsinom MCF-7-celler, melanom A375-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av POL i 24 timer, og IC
50-verdier ble kvantifisert ved MTT-analyse (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3). (C) A549-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av POL, og deretter ble cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analysen ved det angitte tidspunkt (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3). (D) forskjellige konsentrasjoner av POL ble preinkubert ved 37 ° C i 30 minutter med mannose (1-3), mannose (1-6) og mannose (1-3; 1-6), og deretter behandlet med A549-celler i 24 h. Cellen hemmende forholdet ble målt ved MTT-analyse (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3).
cytotoksiske effektene av POL på A549 celler
Den veksthemmende effekter av POL ble evaluert av MTT-analyse på humane kreftceller, inkludert tykktarmskreft Caco-2 celler, cervix karsinom HeLa-celler, ikke-småcellet lungekreft A549 celler, leverkreft HepG
2 og 7721 celler, brystkreft MCF- 7-celler, melanom A375-celler, og IC
50-verdier var 47 pg /ml, 30 ug /ml, 23 ug /ml, 42 ug /ml, 38 ug /ml, 50 ug /ml og 26 ug /mL henholdsvis (fig. 1B). Dette resultat viste at POL var mer følsom for ikke-småcellet lungecancer A549-celler, og derfor, A549-celler ble valgt ut for videre undersøkelser.
POL induserte A549 celledød i en dose- og tidsavhengig måte, , 0 ug /ml til 100 ug /mL POL som utøves sterke hemmende effekter på veksten av A549-celler (fig. 1C). Etter 24 timers inkubering med 23 ug /ml POL, inhiberingsgraden nådde nesten til 50%.
Korrelasjonen mellom sukker-binding og anti-proliferativ aktivitet av POL
mannose-inhiberingsanalysen ble utført for å bestemme forholdet mellom sukker-bindende aktivitet av POL, og dens anti-proliferativ egenskap. Forskjellig konsentrasjon av POL ble pre-inkubert med mannose α (1,3), mannose α (1,6) og mannose α (1,3:1,6) i 30 min, respektivt. På grunn av det mannose-bindende aktivitet av POL, inhiberte alle tre typer av mannoses fullstendig den hemagglutinerende aktivitet av POL. Som vist på fig. 1D, den veksthemmende effekter av forskjellige konsentrasjoner av POL gikk tapt ved den tilsvarende nivå med tape av mannose-bindende aktivitet, noe som indikerer at det kan være en nær sammenheng mellom den hemagglutinerende aktivitet og anti-proliferativ egenskap av POL.
POL induserer apoptose i A549 celler
Merkede apoptotiske morfologiske endringer som membran blebbing, cellevolumreduksjon og avrunding, ble observert i 23 mikrogram /ml POL-behandlet A549 celler ved fasekontrastmikroskop (fig. 2A). Dessuten ble betydelig DNA-fragmentering i kjerner observert i POL-induserte A549-celler, mens den PBS-behandlede kontrollgruppen viste normal, rund og homogent fargede kjerner (fig. 2B). Imidlertid, 23 ug /ml POL ikke resultere i tilsynelatende apoptotisk morfologi i løpet av ikke-kreft helf celler etter 24 timer eller 48 timer behandling (Fig. 2C og 2D fig.). Disse resultatene antydet at POL kan selektivt indusere A549 celler apoptose, men kunne ikke utløse apoptose av normale HELF celler. I tillegg, som vist i fig. 2E, 23 ug /ml POL markert førte til forbedring av Sub-G
1 fag andel av A549-celler i en tidsavhengig måte (b: 27,34 ± 4,1%, c: 39,27 ± 5,8%), noe som indikerer at POL indusert apoptose i A549 celler. Videre ble Annexin V-FITC og PI dobbel farging utført for å klassifisere blant levende celler (Annexin V /PI-), tidlig apoptotisk (Annexin V + /PI-), sen apoptotisk (Annexin V + /PI +) og nekrotiske celler (Annexin V – /PI +). Som vist på fig. 2F, etter 23 ug /ml POL behandling var prosentandelen av levende celler ble gradvis redusert (en: 98,25 ± 1,3%, b: 74,63 ± 4,7%, c: 55,71 ± 3,9%), mens forholdet for tidlig (b: 15,34 ± 2,6%, c: 23,75 ± 2,8%) og sen (b: 13,94 ± 3,6%, c:. 22.14 ± 4,5%) apoptotiske celler ble forbedret med økende tid
(A) A549 celler ble behandlet med PBS (24 h) eller 23 pg /mL POL for angitte tid, og de morfologiske varianter ble oppdaget i henhold til fasekontrastmikroskopi og (B) fluorescerende mikroskopi (x 200). (C) Etter å ha behandlet med helf celler med PBS (24 h) eller 23 pg /mL POL for angitte tid, ble de morfologiske varianter oppdaget i henhold til fasekontrastmikroskopi og (D) fluorescerende mikroskopi (x 200). (E) Flere faser prosentandel av A549-celler interfererte med 23 ug /ml POL i 24 timer eller 48 timer ble målt ved strømningscytometri. Kontrollgruppen ble behandlet med PBS i 24 timer. (F) A549 celler ble eksponert for 23 ug /ml POL i 24 timer eller 48 timer, ble forholdene mellom tidlig og sen apoptose apoptose målt ved strømningscytometri ved bruk av Annexin V-FITC /PI dobbeltfarging assay. Kontrollgruppen ble behandlet med PBS i 24 timer.
POL utløser autofagi i A549 celler
For å påvise dannelsen av autophagic vakuoler, MDC fluorescerende intensitet på 23 mikrogram /ml POL -behandlet A549 og helf celler i 24 timer eller 48 timer ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Som vist på fig. 3A, autophagic vakuoler ble dannet i A549-celler som er kjennetegnet ved øket MDC fluorescerende intensitet, noe som indikerer tilstedeværelse av autophagic celledød. Men i fig. 3B, MDC fluorescerende intensitet HELF celler behandlet med POL ble ikke økt verken etter 24 timer eller 48 timer, noe som tyder autophagic vakuoler ikke ble dannet i POL-indusert HELF celler. Vi kan omfatte at POL kan selektivt indusere autophagic celledød i A549 celler, men ikke i HELF celler. Ved videre å bruke akridin orange farging, dannelsen av sure vesikulær organeller (AVO) i POL-utløste A549-celler ble påvist (Fig. 3C). Siden Beclin1 forbedring og transformasjon av LC3I til LC3II var karakteristikkene av autofagi, ble uttrykk for Beclin1 og LC3 i POL-indusert A549 celler oppdages. Som vist på fig. 3D, POL induserte tidsavhengige forbedring av Beclin ett nivå og akkumulering av LC3-II på A549-celler. Deretter ble uttrykk for Beclin1 og LC3 slått ned ved hjelp av bestemte sirnas (Fig. 3E). Transfeksjon med Beclin1 eller LC3 siRNA redusert POL-indusert hemming av cellevekst (fig. 3F). Alle disse resultatene indikerte at POL indusert autophagy i A549-celler.
A549-celler (A) og helf-celler (B) ble behandlet med PBS (24 h) eller 23 pg /mL POL for angitte tid, og MDC fluorescerende intensitet ble analysert ved flow-cytometri. (C) A549-celler ble behandlet med PBS (24 h) eller 23 pg /mL POL for angitte tid, og akridinorange fluorescerende intensitet ble målt ved flow-cytometri. (D) A549-celler ble behandlet med 23 mikrogram /ml POL for angitte tid, etterfulgt av Western blot-analyse for deteksjon av fosforylerte-Beclin1 og LC3 nivåer. β-aktin ble benyttet som en lik lasting kontroll. (E) A549-celler ble transfektert med Beclin1, LC3 eller styre siRNA i 24 timer, ble den Beclin1 og LC3 nivåer undersøkt ved Western blot-analyse. (F) A549-celler ble transfektert med Beclin1, LC3 eller styre siRNA i 24 timer fulgt av stimulering med eller uten 23 ug /ml POL i 24 timer ble cellevekst inhibering forholdet som blir målt ved MTT-analyse (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3).
POL Induserer caspase-avhengig apoptose i A549 celler
Som vist i fig. 4A, etter autophagic inhibitor 3-MA behandling, 23 ug /ml POL forbedret signifikant caspase-3 aktivitet i en tidsavhengig måte, noe som indikerer POL-indusert apoptose skjer gjennom aktivering av vanlige apoptotiske testamentfullbyrdere som caspase-3. Videre analyser Western blot etter autofagi ble inhibert viste at etter behandling med 23 ug /ml POL for angitte tid, caspase-3 og -9 ble spaltet, ettersom procaspase-3 og -9 ble redusert mens spaltede caspase-3 og -9 var økes (fig. 4B a). Også oppregulering av pro-apoptotiske Bax og Bud-proteiner, så vel som nedregulering av anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-X
L-proteiner ble observert etter behandling POL. Dessuten, 23 ug /ml POL førte til spaltning av PARP fra et 116 kDa båndet til et 89 kDa-fragment med økende tid (fig. 4B b), og cytokrom
c
ble sluppet fra mitokondrier inn i cytoplasma etter behandling POL (fig. 4B c). Som vist på fig. 4C og fig. 4D, da autophagy ble undertrykt med 3-MA, redusert POL den rodamin 123 fluorescensintensiteten i en tidsavhengig måte. Videre er spaltingen av caspase-3 og -9 kunne bli reddet i nærvær av 10 pM Z-VAD-FMK i POL-induserte A549-celler (fig. 4E). Og, Sub-G
en celle andel analyse og Annexin V /PI dobbel farging ble også vist at caspase inhibitor z-VAD-FMK kan beskytte A549 celler fra apoptotisk celledød (Fig. 4F og 4G fig.). Alle disse resultatene viser tydelig at POL indusert apoptose gjennom mitokondrie-mediert vei i A549 celler.
(A) Effekter av 23 mikrogram /ml POL på caspase-3-aktivering med økende tid (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3) (* p 0,05
vs
0 h gruppe).. (B) 23 mg /ml POL indusert spaltning av caspase-3, caspase-9 (a). POL resulterte i spaltning av PARP, oppregulering av pro-apoptotiske Bax og bud, så vel som nedregulering av anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-X
L med dyrkningstiden (b). Cellelysater ble fraksjonert for å isolere cytoplasmisk og råolje mitokondrier, og nærværet av cytokrom
c
i cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner ble bestemt ved WB analyse ved anvendelse av antistoff ApoTrack cocktail. β-aktin ble benyttet som et cytosol lik belastning kontroll, mens prohibitin ble anvendt som mitokondrier lasting kontroll (c). (C) Innvirkningen av 23 mikrogram /ml POL på integriteten av mitokondrielle membraner ble målt ved hjelp av rhodamin 123-farging, og fluorescensintensiteten ble analysert ved flow-cytometri. (D) variantene av mitokondrielle membraner potensial ble videre presentert som søylediagram (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3) (** p 0,001
vs
kontrollgruppen, ns. No betydelig
vs
. kontrollgruppen). (E) Western blot-analyse av pro-kaspase 3, spaltes caspase 3, pro-caspase9 og spaltes caspase9 nivåer i A549-celler behandlet med 23 ug /mL alene eller i kombinasjon med 10 uM kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK i 24 timer. (F) A549-celler ble behandlet med 23 mikrogram /ml POL alene eller i kombinasjon med 10 uM kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK i 24 timer og farget med propidiumjodid (PI), kvantifisering av PI farge dataene presentert som prosentandelen av cellene i SubG
1 fase. (G) Innvirkningen av caspase på 23 mikrogram /ml POL-indusert SubG
1 faseforhold ble representert som stolpediagram (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3) (## p 0,001
vs
POL gruppe, ns:.. ingen signifikant
vs
POL-gruppen)
Hemming av autofagi delvis reduserer POL-indusert apoptose
As. vist på fig. 5A, etter at autophagy ble undertrykket, POL-indusert cellevekst-inhibering ble betydelig redusert. Inhibering av autophagy ved 3mA eller knockdown av Beclin1 ved forbehandling med Beclin1 siRNA (Fig. 5B) reduserte forholdet mellom MDC-positive celler (Fig. 5C a), som indikerer at autophagy ble undertrykt ved 3mA og Beclin1 siRNA. Dessuten trykke av POL-indusert autofagi hemmet POL-indusert apoptose i A549-celler, som ble kjennetegnet ved reduksjon av sub-G
en fag DNA-innhold (Fig. 5C b), såvel som tidlig og sen apoptotisk parti (Fig . 5C c). Konsekvent, undertrykkelse av autofagi enten 3mA eller Beclin1 siRNA førte også til reduksjon i PARP cleavage og LC3-II uttrykk i POL behandlet A549 celler (fig. 5D og 5E fig.). Alle disse resultater indikerer at inhibering av autophagy delvis reduserer POL-indusert apoptose i A549-celler.
(A), A549-celler ble forbehandlet med 2 mM 3mA en time før administrering av 23 ug /ml POL for angitte tid , og cellen hemmende forholdet ble målt ved MTT-analyse. Kontrollgruppen ble behandlet med PBS. (Gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3) (* p 0,05, ** p 0,001
vs
kontrollgruppen, ns:.. Ingen signifikant
vs
Kontroll gruppe, # p 0,05, ## p. 0,001
vs
POL-gruppen). (B) A549-celler ble transfektert med kontroll siRNA og spesifikk Beclin1 siRNA i 24 timer ble Beclin1 nivå undersøkt ved Western blot-analyse. (C) A549-celler ble forbehandlet med 2 mM 3mA eller transfektert med spesifikk Beclin1 siRNA før administrering av 23 ug /ml POL i 24 timer, og den MDC fluorescerende intensitet (a), SubG
1 fag-celle-forhold (b ) og tidlig og sent apoptose (c) ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Kontrollgruppen ble behandlet med PBS i 24 timer. Data ble representert som søylediagram. (Gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3) (* p 0,05, ** p 0,001
vs
kontrollgruppen, ns. Ingen signifikant
vs
Control. gruppe, # p 0,05, ## p. 0,001
vs
POL-gruppen). (D) Spaltet PARP og LC3-II uttrykk i A549-celler behandlet med 23 pg /ml POL i 24 timer i fravær eller nærvær av 3mA (2 mM) ble målt. De representative tallene ble vist. (E) A549 celler ble fortrinnsvis transfektert med kontroll siRNA eller spesifikk Beclin1 siRNA i 24 timer før 23 ug /ml POL behandling i ytterligere 24 timer, og spaltning av PARP, så vel som ekspresjon av LC3II ble målt.
POL utløser apoptose gjennom å undertrykke Akt-NF-kB sti og initierer autofagi
via
hemme Akt-mTOR veien
Western blot analyser viste at behandling av A549 celler med 23 mikrogram /ml POL for angitt tid resulterte i redusert uttrykk for fosforylert-NF-kB (p65) (Ser536), fosforylert-Akt (Ser473), fosforylert-Akt (Thr308), fosforylert-mTOR (Ser2448), fosforylert-70S6K (Thr389) og fosforylert-4E -BP1 (Thr37 /46) (fig. 6A). Og nedstrøms substrater av mTORC1, p70S6K (70 kDa ribosomal S6 kinase) og 4E-BP1, ble også effektivt dephosphorylated av POL behandling i A549-celler (fig. 6A). For å bekrefte at signalveien i POL-behandlede A549-celler, har vi brukt genetisk tilnærming til henholdsvis over-uttrykke Akt, NF-kB og mTOR (Fig. 6B) i POL-behandlede A549-celler. Som vist på fig. 6B, var det sterk aktivering av Akt, NF-kB og mTOR i transfekterte A549-celler sammenlignet med vektor-transfiserte seg, noe som bekrefter transfeksjonseffektiviteten. Transfeksjon av Myr-Akt i A549-celler (over-ekspresjon av Akt) reversert POL-induserte reduksjon av fosforylert-NF-kB (p65) (Ser536) og fosforylert-mTOR (Ser2448) (Fig. 6B). Imidlertid Transfeksjon av T7-rela (over-ekspresjon av NF-kB) eller Flag-mTOR (over-ekspresjon av mTOR) resulterte ikke i noen motsatt av proteinene (fig. 6B), noe som indikerer at Akt kan være oppstrøms NF-kB og mTOR i POL-behandlede A549 celler.
(A) etter behandlet med 23 mg /ml POL for angitt tid, nivåene av fosforylert-Akt, Akt, fosforylert-NF-kB (p65) , NF-kB (p65), fosforylert-mTOR, mTOR, fosforylert-p70S6K og fosforylert-4E-BP1 ble oppdaget. β-aktin ble benyttet som en lik lasting kontroll. (B) A549-celler ble transfektert med tom vektor, Myr-Akt (aktivert), T7-rela (aktivert) og Flag-mTOR (aktivert), og behandlet med 23 ug /ml POL for 0 timer eller 24 timer. Nivåene av fosforylert-Akt, Akt, fosforylert-NF-kB (p65), NF-kB (p65), fosforylert-mTOR og mTOR ble målt. β-aktin ble benyttet som en lik lasting kontroll. (C) kontinuerlig aktivering av Akt, NF-kB og mTOR prio til 23 ug /mL POL behandling i 24 timer ble de morfologiske varianter oppdaget i henhold til fasekontrastmikroskopi. Kontrollgruppen ble behandlet med PBS i 24 timer. (D) Etter en kontinuerlig aktivering av Akt, NF-kB og mTOR, ble 23 mikrogram /ml POL behandlet med A549-celler i 24 timer, den SubG
1 fag-forhold (a), tidlig og sen apoptose-forhold (b ), ble MDC fluorescerende intensitet (c), og AVO fluorescerende intensitet (d) analysert ved hjelp av strømningscytometri. Kontrollgruppen ble behandlet med PBS i 24 timer. Data ble representert som søylediagram. (Gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3). (* P 0,05, ** p 0,001
vs
kontrollgruppen, ns. Ingen signifikant
vs
POL gruppe, # p 0,05, ## p 0,001
. vs.
POL-gruppen).
For ytterligere å kontrollere om disse proteinene deltatt i POL-indusert apoptose eller autofagi, morfologi deteksjon og flowcytometri analyse ble brukt. Som vist på fig. 6C, over-ekspresjon av Akt reversert POL-indusert celledød, mens overekspresjon av NF-kB og mTOR fortsatt delvis opprettholdt POL-indusert celledød. Det er antydet at Akt kan være ansvarlig for POL-indusert både apoptose og autofagi i A549 celler. Videre Akt overekspresjon resulterte i reduksjon av SubG
en porsjon (fig. 6D a), tidlig apoptotisk (Annexin V + /PI-) og sen apoptotisk (Annexin V + /PI +) celler (fig. 6D b), MDC fluorescerende intensitet (fig. 6D c), så vel som sure vesikulær organeller (AVO) formasjon (fig. 6D d). Resultatene viste at over-uttrykk for Akt kunne reversere POL-indusert apoptose og autofagi samtidig, noe som indikerer Akt protein kan innebære både POL-indusert apoptose og autofagi. Imidlertid, over-ekspresjon av NF-kB bare resulterte i undertrykkelse av apoptotiske egenskaper, blant annet betydelig redusert partier av SubG
1 (fig. 6D a), så vel som tidlig og sen apoptotiske celler (fig. 6D b). Mens, over-ekspresjon av mTOR reverseres bare POL-indusert autophagy, som kjennetegnes ved redusert fluorescerende intensitet av MDC (fig. 6D c) og AO (fig. 6D d). Til sammen kan vi konkludere med at POL indusert apoptose gjennom å undertrykke Akt-NF-kB gangsti initiert autofagi
via
hemme Akt-mTOR veien. Akt driver veksle mellom autofagi og apoptose i POL-behandlede A549 celler.
POL-indusert molekylær bryter rolle Akt er ROS-avhengige
ROS-nivåer ble oppdaget ved hjelp av ROS-deteksjon av fluorescerende fargestoff DCFH -DA. Det er demonstrert at ROS-akkumulering ble forsterket i POL-induserte A549-celler i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 7A). Videre inkubasjon av A549-celler med 23 ug /ml POL førte til reduksjon av GSH-innhold og GPX-enzymaktiviteten i en tidsavhengig måte, noe som tyder på at POL avskaffet GSH antioksidantsystem og til slutt resulterte i massiv ROS akkumulering i A549-celler (Fig . 7B). Og, kan dette 23 mikrogram /ml POL-induserte økningen av ROS inhiberes ved forbehandling med ROS-scavenger, NAC (Fig. 7C).
