Abstract
På diagnose, de fleste av kreft i bukspyttkjertelen pasienter til stede med avansert sykdom når kurativ reseksjon er ingen lenger gjennomførbare og aktuelle terapeutiske behandlinger er stort sett ineffektiv. En forbedret forståelse av molekylære mål for effektiv intervensjon for kreft i bukspyttkjertelen er derfor haster. The Met reseptortyrosinkinasehemming er en kandidat innblandet i bukspyttkjertelkreft. Spesielt, Met er over uttrykt i opptil 80% av invasive bukspyttkjertel kreft, men ikke i normale duktale celler korrelerer med dårlig generelle pasient overlevelse og økt tilbakefall etter kirurgisk reseksjon. Men den funksjonelle rollen til Met signalering i kreft i bukspyttkjertelen fortsatt er dårlig forstått. Her har vi brukt RNA interferens til direkte undersøke pathobiological viktigheten av økt Met signalering for kreft i bukspyttkjertelen. Vi viser at Met knockdown i bukspyttkjertelen kreftceller resulterer i redusert celleoverlevelse, celle invasjon, og migrasjon på kollagen I
in vitro
. Bruke en orthotopic modell for kreft i bukspyttkjertelen, tilbyr vi
in vivo
bevis for at Met knockdown redusert tumorbyrde korrelere med redusert celle overlevelse og tumor angiogenese, med minimal effekt på cellevekst. Spesielt, rapporterer vi at Met signale regulerer utskillelsen av pro-angiogene kjemokin interleukin-8 /CXCL8. Våre data viser at interleukin-8 reseptorer CXCR1 og CXCR2 ikke uttrykkes på bukspyttkjertelen kreftceller, antyder en parakrint mekanismen som Met signale regulerer interleukin-8 sekresjon til oppussing svulsten mikromiljøet, et nytt funn som kan ha viktige kliniske implikasjoner for forbedring effektiviteten av behandlinger for kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Hill KS, Gaziova jeg, Harrigal L, Guerra YA, Qiu S, Sastry SK, et al. (2012) Met reseptortyrosinkinasehemming Melde induserer Utskillelse av angiogene chemokine Interleukin-8 /CXCL8 i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE syv (7): e40420. doi: 10,1371 /journal.pone.0040420
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 15 februar 2012; Akseptert: 6 juni 2012; Publisert: 17.07.2012
Copyright: © 2012 Hill et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health CA-119 075 til LAE, DK-052067 til CDL, og CA-118 405 til SKS K.S.H. ble støttet av opplæring stipend NIH /NCI Tverrfaglig opplæring i Cancer Research, T32 (CA117834-03). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en aggressiv kreft med en median overlevelsesrate på mindre enn ett år, og er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i USA [1]. Den høye dødeligheten av PDAC pasienter skyldes flere faktorer. I fravær av effektive screeningmetoder, 80-85% av pasientene med langt fremskreden sykdom er tilstede som ofte er til hinder for kurativ reseksjon [2]. Videre standard behandling for fremskreden sykdom er stort sett ineffektive [3], [4]. Dermed er det et presserende behov for å forstå den molekylære grunnlaget for PDAC vekst for å identifisere mål av høy terapeutisk verdi. Nyere genetisk analyse av bukspyttkjertelsvulster identifisert flere genetiske mutasjoner som er felles for 75-90% av pasientsaker viktige for PDAC initiering og påfølgende utvikling av preinvasive bukspyttkjertelen intraepitelial svulster (PanINs 1-3) [5] – [7]. Etter avtale med dette, har genmanipulerte musemodeller for PDAC bekreftet rollen av spesifikke genetiske mutasjoner i initiering og utvikling av tidlig stadium sykdommen. Eksempler er Panins-1 (Kras aktivering, tap av Notch2) [8], [9], Panins-2 (tap av funksjonsmutasjoner i tumor suppressor p53 og p16INK4a) [10] og Panins-3 (inaktivering av p53, SMAD4 /DPC4 og BRCA2) [8], [11], [12]. I motsetning til disse tidlig stadium preinvasive lesjoner, har PDAC en mangel på definerte mekanismer.
Flere signalveier er sannsynligvis involvert i PDAC. En kandidat er Met /hepatocytter Growth Factor (HGF) signale aksen. Under fysiologiske betingelser, er Met-reseptor-tyrosinkinase og dens ligand HGF uttrykt ved lave nivåer i bukspyttkjertelen akinærceller og stromal rommet henholdsvis [13] – [15]. Parakrin binding av HGF til Met resulterer i fosforylering reseptoren fører til økt celleoverlevelse og motilitet [16], [17]. I motsetning til lunge og mage adenokarsinomer i hvilken aktiverende mutasjoner forlenge Met signalering, slik gain-of-funksjon Met mutasjoner er ennå ikke identifisert i PDAC. Normale bukspyttkjertelen kanaler uttrykke lave Met nivåer. Motsatt Met er over-uttrykt i opptil 80% av PDAC tilfeller [18], er en sterk indikator for økt tilbakefall og generelt dårlig PDAC pasient overlevelse [13], [19] – [22]. Møtte uttrykk er til stede i opp til 29 tumorigene bukspyttkjertelen cellelinjer med ulike genetiske bakgrunn, herunder ASPC-en, Panc-1, BxPC-3 og Suit-2-celler [13], [23]. Et unntak er dårlig differensiert MIA PACA-2 cellelinje som ikke uttrykker endogen Met [13], [23]. Nylig ble Met lite molekyl-inhibitor SGX523 rapportert å redusere veksten og infiltrasjon av subkutane pankreatiske tumorer [24] heve interesse i Met som et potensielt terapeutisk mål for langt fremskreden sykdom. Men den nøyaktige rollen Met system for PDAC forblir uløst.
I denne studien brukte vi RNA interferens for å redusere Met signalering i menneskelige bukspyttkjertelen xenografter å bruke en
in vivo
mus orthotopic modell. Møtte knockdown (MetKD) celler forble kompetent for å danne ortotopiske pankreastumorer
in vivo
; Men de resulterende MetKD xenotransplantater var signifikant veksten hemmet i forhold til tumorer som følge av kontrollceller som uttrykker et ikke-målretting (NT) shRNA. Immunhistokjemisk analyse av MetKD xenotransplantater viste økt celle apoptose ledsaget av redusert celleproliferasjon og bety kar tetthet (MVD i periferien av MetKD xenotransplantater. I samsvar med dette scenariet, viser vi at Met knockdown reduserer sekresjon av interleukin-8 /CXCL8 (IL-8) , en potent pro-angiogene kjemokin som fungerer som en parakrin regulator av endotelcelleproliferasjon, en aktivator av nøytrofiler og en kjemoattraktant for fibroblaster og andre immunceller [25]. Våre funn at Met er et oppstrøms regulator for IL-8-sekresjon er betydelig og foreslår en mekanisme som Met signale kunne regulere bukspyttkjertelkreft
in vivo
, et nytt funn som kan gi unike muligheter for klinisk intervensjon.
Materialer og metoder
Etikk Statement
Alle dyr var ivaretatt i samsvar med Office for beskyttelse fra Research Risks (OPRR) og dyrevelferdsloven retningslinjer under en dyr protokoll godkjent av University of Texas MD Anderson Institutional Animal Care og bruk komité. Denne studien ble godkjent av University of Texas MD Anderson Institutional Animal Care og bruk komité.
Antistoffer, cellelinjer og vedlikehold
Et antistoff mot C-terminalen av Met (C-28 ) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Et mus monoklonalt antistoff mot β-actin ble innkjøpt fra Sigma. Stedsspesifikke anti-fosfor tyrosin antistoffer for Met Y1234 /1235 var fra Upstate. Et antistoff som er spesifikt for det ekstracellulære domene av Met (anti-hHGFR) ble innkjøpt fra R E farget xenograft vevsprøver avbildes ved hjelp av en 5 × objektiv og analysert ved hjelp MetaMorph v7.3.1. Prosentandelen av nekrose (% N) for hver tumorprøve ble beregnet ved anvendelse av følgende ligning% N = (A
N /A
T) * 100, hvor A
N og A
T representerer den nekrotiske og total områder hhv. CD31 /blodplate-endotelcelle adhesjonsmolekyl 1 (PECAM-1) farging ble vurdert i frosne pankreatiske vev som ble seksjonert (8-10 um), som er montert på positivt ladet lysbilder og lufttørket i 30 minutter og farget ved hjelp av CD31-antistoffer som beskrevet tidligere [28]. Kontrollprøver utsatt for et sekundært antistoff alene viste ingen spesifikk farging. For kvantifisering av midlere fartøy tetthet (MVD) i avsnitt farget for CD31, ble 3 felt per svulst seksjon avbildes med en 20 × mål på en Zeiss Axiovert 200 mikroskop og antall diskrete CD31 positive fartøy per felt ble scoret.
Angiogenese Arrays og ELISA
3 x 10
6-celler ble sådd ut på en 10 cm vevskultur-plate, og cellene ble tillatt å holde seg over natten i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO
2. Celler ble vasket i medium med 1% FBS og serum-utarmet over natten før behandling med DMEM inneholdende 1% FBS alene (uten ligand) eller med 100 ng /ml HGF i 48 timer. Kondisjonert medium ble oppsamlet og sentrifugert for å fjerne eventuelle cellerester før analyse. Menneskelig Angiogenese Arrays, VEGF (R 0,001, ANOVA, n = 3). Redusert forankringsuavhengig vekst av BxPC-3 (E) og ASPC-1 (F) MetKD-celler i bløt agar i forhold til NT-celler (*** p 0,001, ANOVA, n = 3). Møtte knockdown hatt minimal effekt på veksten av BxPC-3 (G) og ASPC-1 (H) MetKD celler i forhold til NT celler.
For å vurdere om Met signale påvirker tumorigent potensialet i BxPC- 3 og ASPC-1 celler, utførte vi forankrings uavhengige vekstanalyser i myk agar. NT og MetKD celler ble sådd ut på 0,4% agarose i nærvær eller fravær av HGF og antallet resulterende kolonier, som defineres som en klynge av tre eller flere celler ble bedømt. I NT cellelinjer, HGF behandling resulterte i en betydelig økning i antallet kolonier som er tilstede i bløt agar i overensstemmelse med en rolle for Met signalering i forankringsuavhengig cellevekst. Omvendt, HGF-behandlede MetKD celler viste redusert kapasitet til å vokse i en anker uavhengig måte i myk agar (figur 1E 1F). Vi neste undersøkt effekten av Met knockdown på HGF-indusert celleproliferasjon. Interessant, HGF-indusert proliferasjon ble ikke påvirket av Met knockdown i BxPC-3 og ASPC-1-celler (figur 1G 1 H).
Effekten av Met knockdown på HGF-indusert cellemigrering ble undersøkt ved anvendelse av en sårheling analysen. Som vist i Figurene 2A-amp; B (Hjelpemiddel Informasjon S1), MetKD celler konsekvent viste redusert HGF-indusert motilitet i forhold til NT celler. Ved hjelp av en matrigel basert invasjon analysen, viser vi også at tap av Met signaliserer betydelig redusert invasiv fenotype av BxPC-3 MetKD celler (Figur 2C). PDAC er preget av et rikt desmoplastic stroma som er høyanriket i ekstracellulære matrix komponenter inkludert kollagen I. Som et resultat, vi spilte live-cell imaging studier for å måle forskjeller i HGF-indusert migrering av ASPC-en NT og MetKD cellelinjer seedet på kollagen I (figur 2D). Celler ble tillatt å holde seg i 1 time på kollagen I før behandling med HGF, hvoretter bor cellemigrering ble undersøkt ved å måle den totale veilengde av migrerende celler i løpet av en 2 timers periode. I fravær av HGF, ble sammenlignbare trekk veilengder detektert for ASPC-1 MetKD og NT-celler (NT: 87,2 um +/- 12,0; MetKD-2: 112,1 nm +/- 12,3; MetKD-5: 76,5 um +/- 7,0) (figur 2D). Behandling med HGF økt banelengde på APSC-en NT-celler (216,7 nm +/- 13,1), korrelere med økt celle hastighet (data ikke vist). Omvendt, gjorde HGF behandling av MetKD-2 og MetKD-5 celler ikke føre til økt veilengden (Movie S1, Movie S2, Movie S3). Derfor Met knockdown resulterer i redusert ASPC-en celle migrasjon på kollagen I.
Serum fattige, sammenflytende NT eller MetKD BxPC-3 (A) eller ASPC-en (B) celler ble såret med en ripe, seks områder merket, og straks fotografert (0 timer) før behandling med HGF. Identiske områder langs bunnen ble fotografert etter at 3, 9, 18, og 24 timer, og verdiene ble normalisert til den opprinnelige størrelsen på bunnen ved 0 timer. Cell migrasjon er rapportert som% gap nedleggelsen på hvert tidspunkt (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). MetKD reduserer BxPC-3-celle invasjon i respons til HGF i forhold til kontroll-celler (C). Verdier representerer ganger endring i antall celler /felt og er angitt som middelverdi +/- SEM (*** p 0,001, ANOVA, n = 3). Levende celle avbildning av ASPC-1 MetKD-celler sådd ut på kollagen-belagte glassbunn cellekulturskåler viser redusert cellemigrering som reaksjon på 100 ng /ml HGF (D). Bilder ble oppsamlet hvert 2 min for en total på 120 min og dataene er uttrykt som gjennomsnitt +/- SEM veilengde pr tilstand (*** p 0,001, ANOVA, n 30 celler).
Met knockdown Svekker
in vivo
tumorvekst
Vi har søkt å undersøke konsekvensen av Met avbrudd på tumorvekst
in vivo
, ved hjelp av en orthotopic musemodell for kreft i bukspyttkjertelen . Siden kryssartsforskjeller i interaksjonen av murine HGF med human Met er blitt rapportert [31], vi først brukt Western-analyse for å bekrefte aktiveringen av human Met ved murine HGF i BxPC-3 og ASPC-1-celler. Ved anvendelse av betingelser som resulterer i maksimal Met fosforylering av human HGF, viser vi at human Met ble aktivert av den murine og humane ligand ved hjelp av stedsspesifikke anti-Met-fosfo-tyrosin-antistoffer og Western-analyse (figur 3A 0,01 *** p 0,001, ANOVA, to separate eksperimenter). Tumorstørrelse ble målt hver 10. dag ved hjelp av
in vivo
bioluminescent bildebehandling for BxPC-3 (C) eller ASPC-1 (D) celler etter injeksjonen og er rapportert som gjennomsnittlig tumorstørrelse i fotoner /sek /cm
2 (* p 0,05, ** p 0,01; ANOVA). Representative bioluminescerende bilder vises umiddelbart før obduksjon på 30 dager (BxPC-3) eller 45 dager (ASPC-1). Vekten og generelle forekomsten (%) av BxPC-3 primære svulster (E) og ASPC-1 (F) primære og metastatiske svulster er oppført. Stabil knockdown av Met mRNA i BxPC-3 (G) og ASPC-1 (H) MetKD xenotransplantater ble bekreftet ved hjelp av QRT-PCR. Data ble normalisert til GADPH og rapporteres i forhold til den respektive NT kontroll (** p0.01, *** p 0,001; ANOVA, n = 2).
For å undersøke effekten fra Met knockdown på PDAC vekst, brukte vi BxPC-3 og ASPC-1 celler pre-merket med ildflue luciferase å følge tumorbyrde ikke-invasiv [26]. Like mange MetKD og NT kontrollceller ble sprøytet inn i kroppen i bukspyttkjertelen av atymiske nakne mus og tumorbyrde kvantifiseres ved hjelp av
in vivo
bioluminesens [26]. Sterk tumorvekst ble detektert i mus injisert med kontrollceller som uttrykker NT shRNA (figur 3C E farget deler av MetKD svulster i samsvar med bioluminescence data (Støtte Informasjon S2). Hos mus injisert med ASPC-1 celler, viser MetKD cellene redusert primær tumorstørrelse i orthotopic modellen sammenlignet med mus injisert med NT celler (Figur 3D), korrelerer med redusert forekomst av lokale (leveren) og fjernt (lunge) tumormetastase (Figur 3F). QRT-PCR bekreftet redusert Met mRNA nivåer i MetKD svulster i forhold til NT tumorer (figur 3G 3H). Dermed tap av Met signalanlegg i BxPC-3 og ASPC-1 celler hemmer tumorbelastning
in vivo
.
Met Signaremo tumorvaskulatur
ortotopiske ASPC-1 tumorer ble fjernet og behandlet for videre analyse. Immunpresipitasjon og Vest-analyse av menneskelig Met i ortotopiske svulster bekreftet aktivering av menneskelig Møtt av murine HGF
in vivo plakater (figur 4A), i tråd med våre tidligere studier som viser aktivering av menneskelig Møtt av rekombinant mus HGF (Se figur 3A 3B). Som forventet lavere nivåer av fosfo-Met ble påvist i Met KD tumorer i forhold til NT-xenotransplantater (figur 4A). Interessant, tumorer produsert av ASPC-1 MetKD celler rutinemessig inneholdt store områder med sentral nekrose (figur 4B) i forhold til de større svulster som følge av ASPC-1 NT celler. Kvantifisering oppdaget en 5-gangers økning i nekrotiske områder innenfor de mindre tumorer avledet fra MetKD-2 og MetKD-5-celler sammenlignet med NT kontrolltumorer (figur 4B). Den økte tumor nekrose observert i MetKD ASPC-1-xenografter kan skyldes hurtig tumorvekst som overstiger tumorvaskulatur, økt tumorcelle-apoptose eller redusert tumor angiogenese. For å skille mellom disse mulighetene, farget vi ASPC-en MetKD og NT tumorsnitt for Ki67 eller kløyvet caspase-3 for å vurdere graden av celleproliferasjon og apoptose hhv. Morfometrisk analyse av Ki67 flekker i svulster seksjoner som følge av MetKD celler avslørt færre Ki67 positive celler per felt i forhold til NT tumorer (Figur 4C). Undersøke tumor seksjoner for kløyvde caspase-3 flekker avdekket høyere antall spaltede caspase-3 positive celler i MetKD svulster i forhold til NT tumorer (figur 4D), noe som indikerer at tap av Met signalering kan føre til økt mottakelighet for apoptose. Den økte apoptose og nekrose observert i MetKD tumorer kunne tilskrives redusert tumor angiogenese. For å teste dette, bestemte vi den gjennomsnittlige fartøy tetthet (MVD) i NT og MetKD-svulster ved immunhistokjemisk farging hjelp antistoffer mot CD31, en markør for endotelceller [28]. I samsvar med våre data som viser økt nekrose i MetKD-2 og MetKD-5 svulster, MVD ble betydelig redusert i periferien av MetKD svulster i forhold til NT-avledet bukspyttkjertelen xenografter (figur 4E). Ingen signal ble oppdaget i den sentrale massen av xenograft vev, i samsvar med rapporter om menneskelige og musemodeller av bukspyttkjertelkreft [34]. Således tap av Met signalering i ASPC-1-celler reduserer tumorbelastning i en mus ortotopisk modell, sannsynligvis som et resultat av nedsatt celleoverlevelse og tumorangiogenese.
Immunutfelling og Western-analyse påvises sterkt fosforylert Met (pMet) i NT tumorer i forhold til lave nivåer i pMet MetKD tumorer (a). Seriesnitt av parafininnstøpte tumorer var enten H 0,01, *** p 0,001 ; ANOVA). Representative feltet bilder vises.
Met Signa Fremmer utskillelse av angiogene faktorer
Met signalering har vist seg å fremme ombygging av tumor blodkar i bryst og livmor svulster gjennom oppregulering VEGF og nedregulering av trombospondin-1 (TSP-1) [35]. VEGF er en potent agonist av angiogenese som aktiverer både endotelial celleproliferasjon og migrasjon. I opposisjon, undertrykker TSP-1 angiogenese ved å hemme endotelceller spredning og indusere endotelceller apoptose.
