Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er en av de tre viktigste årsakene til kreftdødelighet. CRC dreper over 600000 mennesker hvert år på verdensbasis. Den vanligste dødsårsaken fra CRC er den metastaser til fjerntliggende organer. Men biomarkører for CRC metastase forbli dårlig definert. Vi sammenlignet primære og metastatisk CRC cellelinjer for sine angiogenese-protein profiler og intracellulære signal profiler for å identifisere nye biomarkører for CRC metastaser. For å oppnå dette har vi brukt primære og metastatiske CRC-cellelinjer som et modellsystem og normal human colon-cellelinje som en kontroll. Den angiogenese profiler to isogene CRC cellelinjer, SW480 og SW620, og HT-29 og T84 avdekket at VEGF ble oppregulert i både SW620 og T84 mens koagulasjonsfaktor III, IGFBP-3, DPP IV, PDGF AA /AB, endotelin jeg og CXCL16 ble nedregulert spesielt med metastatisk cellelinjer. Videre fant vi at TIMP-1, amfiregulin, endostatin, angiogenin ble oppregulert i SW620 mens nedregulert i T84. Angiogenin ble nedregulert i T84 og GM-CSF ble også nedregulert i SW620. For å indusere CRC celle metastase, behandlet vi cellene med pro-inflammatoriske cytokin IL-6. Ved IL-6 behandling ble epitelial-mesenkymale overgang induseres i CRC-celler. Når DLD-1 og HT-29 celler ble behandlet med IL-6; Akt, STAT3, AMPKα og dårlige fosforylering nivåene økte. Interessant, SW620 viste samme signal aktiveringsmønster med IL-6 behandling av HT-29 og DLD-1. Våre data tyder på at Akt, STAT3, AMPKα og Bad aktivisering kan være biomarkører for metastatisk kolorektalcancer. IL-6 behandling spesielt redusert fosforylering nivåer av EGFR, HER2-reseptoren, Insulin R og IGF-1R i reseptor-tyrosinkinase matrise studie med HT-29. Til sammen har vi identifisert nye biomarkører for metastatisk CRC gjennom angiogenese-antistoff matrise og intracellulære signal array-studier. Denne studien tyder på at disse nye biomarkører kan brukes som CRC prognose biomarkører, og som potensielle mål for metastatisk CRC terapi
Citation. Chung S, Dwabe S, Elshimali Y, Sukhija H, ArOH C, Vadgama JV (2015) identifisering av nye biomarkører for metastatisk kolorektalcancer Bruke Angiogenese-antistoff Array og intracellulære signal Array. PLoS ONE 10 (8): e0134948. doi: 10,1371 /journal.pone.0134948
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 05.11.2014; Godkjent: 15 juli 2015; Publisert: 10 august 2015
Copyright: © 2015 Chung et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH, NCI, NIMHD, NCATS) Tilskudd til JV Vadgama: U54 CA143931, U54MD007598, UL1TR000124. S. Steven Chung er en lærd støttes av klinisk forskning utdanning og yrkesmessig utvikling av NIMHD 5MD007610, pilot award fra U54MD007598 og karriereutvikling støtte fra U54CA143931
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer .
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen hos menn og den andre hos kvinner over hele verden, og står for cirka 608 000 dødsfall på verdensbasis [1]. Til tross for betydelig forbedring i de terapeutiske modaliteter, over 50% av CRC pasientene etter hvert utviklet residiv og metastaser som fører til død innen 5 år etter diagnose [2]. Metastasering skjer i en fase av tumorprogresjon ved metastatiske variant celler som innehar invasive aktiviteter preget av økt cellemigrasjon, vev invasjon, og orgel kolonisering. Til dags dato er de mekanismene som forårsaker CRC metastaser ikke fullt ut forstått.
Kreft spesifikke biomarkører spiller viktige roller i kreft deteksjon, prognose, forebygging og behandling. I løpet av de siste fire tiårene har betydelig innsats blitt gjort for å karakterisere nyttige biomarkører for CRC [3-5]. Men det er ingen verdifulle biomarkører for CRC metastaser. Derfor er det viktig å identifisere nye biomarkører som kan brukes til å forutsi metastatisk potensial for CRC, tjene som prognostiske indikatorer og tjene som cellulære mål for målrettet terapi på CRC. I vår nåværende studie har vi benyttet de angiogenese-relaterte antistoff matriser med primær eller metastatisk CRC cellelinjer for å identifisere og karakterisere de nye biomarkører forbundet med kolorektal kreft metastasering.
Angiogenese og utvikling av metastaser er egentlig tilkoblet. Eksperimentelle data tyder på at tumormetastaser er påvirket av løselige faktorer som skilles fra den opprinnelige tumor [6-8]. Heri har vi undersøkt angiogenese-relaterte protein ekspresjonsprofiler for å identifisere metastasespesifikke angiogenese gen set. I utgangspunktet studerte vi to isogene kolorektal kreft cellelinjer SW480 og SW620. Den primære kreftcellelinjen SW480 ble avledet fra en Dukes fase B colon carcinoma erholdt fra en 50 år gammel mannlig pasient og den metastatisk SW620 varianten ble avledet fra den samme pasientens tumor spredning til lymfeknuten [9]. Siden variasjonen av genetisk bakgrunn kan i stor grad unngås i disse to cellelinjer, de utgjør en unik modell for å studere kolorektal kreft metastasering. Vi studerte videre et annet par av primære og metastatisk kreft cellelinjer, HT-29 og T84. T84 ble avledet fra de CRC-celler som var spredning til lungen [10].
Mange pro-inflammatoriske cytokiner utgitt av medfødte og ervervede immunceller er blitt vist å regulere kreftcellevekst og bidra til tumorvekst og metastase . Blant disse, interleukin-6 (IL-6) tar et midtpunktet i menneskelig utvikling kreft og metastasering. En økt ekspresjon av IL-6 er blitt forbundet med en ugunstig prognose hos pasienter med forskjellige typer kreft, inkludert kolorektal kreft [11]. Flere studier har funnet en økt ekspresjon av IL-6 i pasienter med CRC, hvor IL-6-nivåer er forhøyet i serum fra pasienter og i tumorvev seg selv [12-13]. IL-6-ekspresjon ble forbundet med tumorstadium, størrelse, metastase og overlevelse av pasienter med kolorektal kreft [14]. Basert på disse observasjonene, behandlet vi kolorektal kreft celler med IL-6 for å få dem til å bli mer invasive og metastatisk. Vi overvåket endringer i epitel-mesenkymale overgang fenotype, stamcelle markør Okt-4 og EMT driver STAT3 (signal transduser og aktivator av transkripsjon 3) fosforylering som respons på IL-6 behandling på en doseavhengig måte. Vår studie gir ytterligere bevis på CRC metastaser patofysiologi, og enda viktigere, oppdagelsen av nye biomarkører og potensielle narkotika mål for metastatisk CRC terapi.
Materialer og Metoder
Kreftcellelinjer og cytokin
SW480, SW620, HT-29, RKO, T84 og DLD-1 CRC cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Normal menneskelig kolon cellelinje FHC (CRL-1831) ble også kjøpt fra ATCC. De ble holdt i et monosjikt kultur i DMEM /F12 (Dulbeccos modifiserte Eagle medium) med 10% føtalt bovint serum, 2,5% L-glutamin og 0,5% penicillin /streptomycin i denne studien. IL-6 ble kjøpt fra Sigma (katalognummer: I3268, Sigma, St. Louis, MO). IL-6 ble tilsatt til cellekulturen ved 1, 5, 10 enheter pr ml etter behov. En enhet er definert som mengden av IL-6 er nødvendig for å indusere en halv-maksimal proliferasjon av T-1165-celler
in vitro
.
Angiogenese-relaterte antistoff Array
Humant angiogenese Array Kit ble kjøpt fra R CXCL16, GM-CSF, endotelin-1, endostatin, IGFBP-3 og PDGF-AB /BB kan utgjøre en universell metastase signatur i CRC. I mellomtiden, SW620 spesifikt protein, for eksempel koagulasjonsfaktor III, kan være en lymfeknute rettet angiogenese-faktor. Tilsvarende T84 spesifikke proteiner, f.eks angiogenin og amfiregulin, trolig lungespesifikke metastatiske angiogenese proteiner. Våre resultater tyder på at i primærtykktarmskreftceller, er PDGFs uttrykt mens i metastatisk tykktarmskreftceller, kan PDGF uttrykk bli nedregulert. Imidlertid kan stromal PDGF signal for metastatiske kreftceller bli overuttrykt i kolon kreftpasienter. Det gjenstår å se om dette er tilfelle i kliniske prøver av kolorektal tumorer.
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT), en transdifferensiering prosess preget av redusert epiteliale markører som E-cadherin og økte mesenchymale markører som vimentin har vært innblandet å spille en rolle som transform epitelceller tilegne seg evnen til å invadere, motstå apoptose og metastaserer [29]. Spesielt, EMT prosess resulterer ofte i uttrykket av kreft stamcelletrekk [30]. Vi har behandlet CRC-celler med cytokin IL-6 og induserte fenotype EMT samtidig med pSTAT3 og Oct-4-ekspresjon. Både autokrint og parakrint IL-6 signal indusert tumor aggressivitet. Våre data er i overensstemmelse med de kliniske data som IL-6 spiller en rolle i tumorigenese og metastase (28). Videre har vi vist de spesifikke intracellulære signalkomponenter som aktiveres av IL-6, STAT3, Akt, AMPKα og dårlig. Til slutt oppdaget vi at spesifikk reseptor tyrosinkinase (EGFR, HER2) aktiviteter er nedregulert av IL-6 i menneskelige CRC HT-29 celler. Videre studier er rettet mot utvikling av inhibitor cocktails for disse nye CRC biomarkører i klinisk anvendelse. Oppsummert har vår studie identifisert en potensiell vei for målrettet terapi for CRC ved hjelp av nye biomarkører for metastatisk CRC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Angiogenese-relaterte protein uttrykk profiler av FHC, SW480, SW620, HT-29 og T84.
Primære og metastatisk kolorektal kreft cellelinjer SW480, SW620, HT29 og T84 ble analysert for angiogenese protein uttrykk profiler. SW480 uttrykt koagulasjonsfaktor III, CXCL16, GM-CSF, endotelin 1, endostatin, IGFBP-3, PDGF-AB /BB klart mens uttrykte ikke VEGF. SW620 uttrykt VEGF mens downregulated koagulasjonsfaktor III, CXCL16, GM-CSF, endotelin 1, endostatin, IGFBP-3, PDGF-AB /BB uttrykk. Parallelt med kolorektal kreft cellelinjer HT-29 og T84 ble analysert for angiogenese-proteinekspresjon profiler. I HT-29. DPP IV, TIMP-1, angiogenin, endotelin, amfiregulin og PDGF /AB, BB-proteiner ble uttrykt mens VEGF ikke ble uttrykt i HT-29. Uttrykt i T84 VEGF ble mens DPP IV, TIMP-1, angiogenin, endotelin, amfiregulin og PDGF /AB, BB uttrykk nivåer ble redusert
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134948.s001 plakater (JPG)
S2 fig. Menneskelig angiogenese rekke justering for metastase signatur.
Å identifisere felles proteiner som ble oppregulert eller nedregulert selektivt i metastatisk CRC cellelinjer, to metastatisk CRC cellelinjer, SW620 og T84, deres angiogenese arrays ble justert med primær cellelinje SW480. Primær CRC-cellelinjen SW480 ble anvendt som en referanse cellelinje, ble lymfe-metastatisk SW620 cellegruppe presentert. Parallelt ble lunge-metastatisk T84 rekke justert. VEGF ble oppregulert i både SW620 og T84 celler. Tvert imot, CXCL16, GM-CSF, endostatin, endotelin-1, IGFBP-3 og PDGF /AB, BB protein ekspresjonsnivåer ble redusert i begge SW620 og T84 cellene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134948.
