Abstract
Hovedproblemet oppstår fra prostatakreft (PCA) er dens tilbøyelighet å metastasere til ben. MicroRNAs (mirnas) spiller en avgjørende rolle i mange kreftmetastaser. Betydningen av mirnas i beinmetastasering av PCa er ikke blitt klarlagt ennå. Vi undersøkte om uttrykket av visse miRNAs ble assosiert med bein metastasering av PCa. Vi undersøkte miRNA uttrykket profiler av seks primære og syv bein metastatisk PCA prøver av miRNA microarray analyse. Uttrykket av 5 mirnas betydelig redusert beinmetastaser sammenlignet med primær PCA inkludert Mirs-508-5p, -145, -143, -33a og -100. Vi undersøkte videre andre prøver av 16 primær PCa og 13 benmetastaser ved hjelp av real-time PCR-analyse. Uttrykk for Mirs-143 og -145 ble bekreftet å ned-regulere betydelig i metastaseprøver. Ved å undersøke forholdet mellom nivåene av Mirs-143 og -145 med clinicopathological funksjoner i PCA pasienter, fant vi ned-reguleringer av Mirs-143 og -145 ble negativt korrelert til beinmetastaser, Gleason score og nivå av fritt PSA i primær PCa . Over-ekspresjon MIR-143 og -145 av retrovirus transfeksjon redusert evne til migrering og invasjon
in vitro
, og tumorutvikling og ben invasjon
in vivo
av PC-3-celler, en human PCa cellelinje som stammer fra et metastatisk bein PCa prøven. Deres oppregulering også økt E-cadherin uttrykk og redusert fibronektin uttrykk for PC-3 celler som avslørte en mindre invasiv morfologiske fenotype. Disse funnene tyder på at Mirs-143 og -145 er assosiert med bein metastasering av PCa og foreslår at de kan spille viktige roller i beinmetastaser og være involvert i regulering av EMT Begge kan også klinisk anvendt som nye biomarkører i diskriminerende ulike stadier av menneskets PCa og forutsi bein metastase
Citation:. Peng X, Guo W, Liu T, Wang X, Tu X, Xiong D, et al. (2011) Identifisering av Mirs-143 og -145 som er forbundet med benmetastaser fra prostatakreft og involvert i reguleringen av EMT. PLoS ONE 6 (5): e20341. doi: 10,1371 /journal.pone.0020341
Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrike
mottatt: 27 januar 2011; Godkjent: 21 april 2011; Publisert: May 27, 2011
Copyright: © 2011 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NSFC- Guangdong Joint finansiering, Kina (nr u0732001); Foundation Natural Science i Guangdong-provinsen, Kina (nr 06021290); Vitenskap og teknologi planlegging prosjekt i Guangdong-provinsen, Kina (No. 2008B030301037) og Science and Technology Planning Project Zhuhai, Kina (2009). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatteren Tiejian Liu er ansatt av et kommersielt selskap, Laura Biotech Co., Ltd ., og sluttet seg til forfatternes forskningsgruppe for private grunner. På grunn av sitt arbeid i forskningsgruppen, vil han få betydelig erfaring som vil være nyttig for sin søknad for sin doktorgrad. Dette papiret har ingen kommersiell relevans i forhold til Laura Biotech, og dataene og resultatene som er beskrevet her, bærer ingen relasjon til det selskapet. Forfatterne bekrefter at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den hyppigst diagnostisert ondartet svulst og den andre ledende årsak til kreft dødsfall i vestlige land [1]. Hovedproblemet oppstår fra PCa er dens tilbøyelighet til å metastasere til ben. Skjelettmetastaser opptrer i så mange som 90% av pasienter med avansert PCa. Viktigere, når svulster metastaserer til bein, de er nesten uhelbredelig og resultat i betydelig sykelighet før en pasients død [2], [3]. Det er svært viktig å forstå mekanismen av metastase formasjon for å forhindre metastasering og utvikling av anti-metastatiske behandlinger som kan gi ytterligere reduksjon av sykelighet og dødelighet av PCA pasienter.
Skeletal metastasering av tumor er en komplisert flertrinns prosess som inkluderer cellular utkobling og motilitet fra den lokale mikromiljøet, degradering av de omkringliggende ekstracellulære matrise, cellulær bevegelse, arrestert i distale kapillærer, ekstravasere og til slutt spre seg til å danne fjerne sekundære bein svulster. Alle disse prosessene er regulert av flere faktorer og molekylære reaksjonsveier [4]. Selv om grunnleggende kunnskap knyttet til denne strukturert prosess har økt den siste tiden, mange av de viktigste elementene er fortsatt dårlig forstått.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende regulatoriske RNA (19-25 nukleotider) uttrykt av planter og dyr som er involvert i regulering av genekspresjon. De utøve sin funksjon ved å binde seg til det 3′-utranslaterte område av en undergruppe av mRNA som resulterer i deres nedbrytning eller undertrykkelse av oversettelses [5]. Bioinformatiske analyser har spådd at enkelt miRNA har flere mål, og dermed mirnas kunne mekle regulering av et stort antall proteinkodende gener. Nyere anslag tyder på at en tredjedel av menneske mRNA kan reguleres ved mirnas [6], [7]. mirnas har blitt vist å påvirke cellulære funksjoner slik som celleproliferasjon, celledifferensiering, og apoptose [8].
Mange rapporter har belyst den rollen av visse mirnas som promotorer eller suppressorer av tumorer [9], [10] , [11]. Et økende antall observasjoner gir også en kollektiv bevis på at mirnas koordinere noen av de intrikate gen-uttrykk programmer og spiller en avgjørende rolle i metastase [12]. mirnas kan påvirke flere trinn av metastatisk cascade, for eksempel svulst celle migrasjon, invasjon og intravasation. For eksempel er brystkreft en av de viktigste bidragsyterne av benmetastaser [13]. En rekke microRNAs har blitt identifisert som metastase arrangører, inkludert la-7, MIR-9, MIR-10b, MIR-21, MIR-373, MIR-520C, og MIR-103/107 [12], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Omvendt, MIR-335, MIR-206, MIR-31, MIR-145, MIR-661 og MIR-126 har blitt identifisert som metastase suppressor mirnas i human brystkreft [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27].
I PCA flere mirnas har blitt identifisert som formidlere av metastasering. Det ble demonstrert at dereguleringen av MIR-221 og MIR-222 var assosiert med PCa progresjon, dårlig prognose, og utvikling av metastaser [28]. MIR-21 var også overuttrykt i PCa og fungerer som en nøkkel onkogen regulator som bidrar til tumorvekst, invasivitet og metastase [29], [30], [31]. En studie har avdekket at Mir-146a rettet ROCK1, og forhøyet ROCK1 nivåer fremme celleproliferasjon, invasjon og metastasering i PCA celler [32]. I tillegg er den genomiske tap av MIR-101 i humant PCa, er involvert i kreft progresjon, fører til overekspresjon av EZH2 [33], [34]. Imidlertid har betydningen av mirnas i beinmetastasering av PCa ikke blitt klarlagt ennå.
Epithelial-mesenchymale overgang (EMT) er en viss signalveien for å beskrive en nøkkel trinn av utviklingen av tumorcellemetastase som inkluderer sammenhengende prosesser av celle-avtrekk migrere, invaderende, dispergeringsmidler og endelig bosatt [35]. Det har blitt identifisert som et kjennetegn på metastase i flere svulster, tilkobling til massevis av transkripsjonsfaktorer [36], [37], [38], [39]. mirnas er også komponenter av den cellulære signaleringskretsen som regulerer EMT-programmet [40]. Nyere arbeider har vist flere mirnas, inkludert MIR-200 familie og MIR-205, spilt viktige roller i EMT [41], [42]. Inntil nå, er fortsatt uklart nøyaktig rolle miRNAs i å regulere EMT.
For å undersøke hvilken rolle miRNAs i bein metastasering av PCa og deres forhold til EMT, er det for det første trenger å vite miRNA uttrykket profilering i grunn bein metastatisk PCa. I denne studien sammenlignet vi miRNA uttrykk profiler i grunnskolen og beinmetastatisk PCa av mennesker og identifiserte Mirs-143 og -145 knyttet til bein metastasering. Videre viste vi at upregulations av Mirs-143 og -145 trykt migrasjon og invasjon
in vitro
, tumorutvikling og bein invasjon
in vivo
, og EMT av PC-3 celler, en menneskelig PCa cellelinje stammer fra en beinmetastatiske PCA prøven.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Vevsprøver fra to grupper av PCA pasienter ble undersøkt. Primære PCA vev var fra prostatektomi eller transuretral reseksjon ved behandling av lokale prostata carcinoma. Skjelettmetastatiske vev av PCa ble ved driften ved behandling av benmetastase. Alle prøvene var formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) med standard prosedyrer. Regioner av vevsprøver 70% kreftvev ble anvendt for ekstraksjon av total RNA. Den histologiske diagnosen ble gjort av en patolog og har blitt re-bekreftet av en andre patolog (D.H.). Bone metastaser ble diagnostisert i henhold til kliniske symptomer og tegn, bein skanner, røntgen, computertomografi, og MR. Ingen av pasientene hadde fått neoadjuvant hormon, stråling eller kjemoterapi før du får tumorvev. Den kliniske informasjonen ble anmeldt om alder, bein metastasering, total PSA nivå, fritt PSA nivå og Gleason score i grunnskolen PCA pasienter. Studien ble godkjent av Institutional Etisk Board (IRB) i First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen-universitetet og samtykket av pasienter involvert.
RNA ekstraksjon
Alle prøver ble sendt til CapitalBio Corp . og total RNA fra FFPE-vevsprøver ble isolert som tidligere beskrevet [43]. I korte trekk, ble vevsprøver skåret i skiver fra parafinblokker og plasseres i 1,5 ml nuklease-fri mikrosentrifugerør (Eppendorf), deretter deparaffinized tre ganger i 1 ml limonen, etterfulgt av vask med 1 ml 100% etanol to ganger og lufttørking ved værelses temperatur. Prøvene ble deretter inkubert med fordøyelse buffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1% SDS) og proteinase K (Merck) ved 55 ° C natten over for å oppnå fullstendig nedbrytning av prøvene. Deretter ble TRIzol reagens (Invitrogen) tilsatt, og resten av protokollen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. RNA prøver ble resuspendert i RNase-fritt vann etter den endelige utfellingstrinnet. RNA kvalitet og kvantitet ble vurdert ved hjelp av en biophotometer (Eppendorf).
Microarray analyse
Total RNA prøver ble analysert ved CapitalBio (CapitalBio Corp.) for miRNA microarray eksperimenter. Hver miRNA microarray chip inneholdt 924 sonder i tre eksemplarer, tilsvarende 677 menneske (inkludert 122 spådd mirnas), 461 mus, og 292 rotte mirnas funnet i miRNA registeret (https://microrna.sanger.ac.uk; miRBase Slipp 10,0, 2007). Prosedyrer ble utført som beskrevet i detalj på nettstedet til CapitalBio (https://www.capitalbio.com). I korte trekk ble det lav-molekylvekt-RNA (LMW-RNA) isolert ved anvendelse av PEG-oppløsningen utfelling Fremgangsmåte ifølge et foregående protokoll [44]. LMW-RNA ble defosforylert med alkalisk fosfatase (NEB) ved først å følge protokollen gitt av Wang H, et al. [45]. Deretter ble defosforylert LMW-RNA ble merket med 500 ng 5′-fosfat-cytidyl-uridyl-cy3-3 «(Dharmacon) med 2 enheter T4-RNA-ligase (NEB) [44]. Merket RNA ble utfelt med 0,3 M natriumacetat, 2,5 volumer etanol og resuspendert i 20 ul hybridiseringsbuffer inneholdende 3 x SSC, 0,2% SDS og 15% formamid. Matrisen ble hybridisert ved 42 ° C over natten og vasket med to påfølgende vaskeløsninger (0,2% SDS, 2 x SSC ved 42 ° C i 4 minutter, og 0,2% SSC i 4 min ved romtemperatur). Arrays ble skannet med en dobbel-kanal laserskanner (LuxScan 10K /A, CapitalBio). Skanneinnstillingen ble justert for å oppnå en visualisert lik intensitet av U6 flekker over hele arrays. Data ble hentet fra TIFF-bilder ved hjelp av LuxScanTM 3.0-programvaren (CapitalBio Corp). Rådata ble normalisert og analysert ved hjelp av betydning Analyse av mikromatriser (SAM, versjon 2.1, Stanford University, California, USA) programvare. Clustering analyse ble utført av Cluster 3.0 [46]. Alle data er MIAME kompatibel og at rådata har blitt deponert i en MIAME kompatibel database (GEO, tiltredelse ID: GSE26964).
Kvantitativ revers transkripsjon-PCR
cDNA oppnådd ved bruk av TaqMan miRNA Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia). Kort, miRNA ble reverstranskribert ved hjelp av sekvensspesifikk stilk-løkke primere (Invitrogen) til følgende mirnas: HSA-MIR-125b, HSA-MIR-145, HSA-MIR-153, HSA-MIR-210, HSA-MIR-143 , HSA-MIR-100, HSA-MIR-363, HSA-MIR-451, HSA-MIR-572 og HSA-MIR-508-5p, basert på microarray analyse og deres anslåtte målgener. Reaksjonen ble utført med de følgende parameterverdier: 15 min ved 37 ° C, 10 minutter ved 65 ° C, 5 min ved 85 ° C, og -20 ° C inntil bruk. Real-time PCR-analyse ble utført på en iQ5 Real Time PCR Detection System (Bio-Rad) med 20 mL volum reaksjon inneholder 2 mL revers transkripsjon produkt, 10 mL 2 × All-in-One ™ Q-PCR Mix, 2 mL PCR Forward Primer (2 mm), 2 mL Universal Adaptor PCR Primer (2 mm), 4 pl ddH2O. Reaksjonene ble inkubert i 96-brønners plater ved 95 ° C i 10 minutter, etter av 40 sykluser, og deretter trappet fra 66 ° C til 95 ° C for å oppnå smeltekurven. Hver prøve ble analysert i triplikat. Ingen mal og ingen revers transkripsjon ble inkludert som negative kontroller. U6 snRNA ble anvendt som kontroll normalisering. Relative uttrykk verdier fra tre uavhengige eksperimenter ble beregnet etter to
-ΔΔCt metode for Schmittgen og Livak [47].
Låst nukleinsyre (LNA) in situ hybridisering
Det ble gått utført som tidligere beskrevet [48]. Kort sagt ble parafininnstøpte vevssnitt deparaffinized, dehydrert, deretter behandlet med proteinase K (20 pg /ml; Roche) ved 37 ° C i 30 minutter. Etter å ha vasket med 0,2% glycin /PBS i 1 min og fiksert med 4% paraformaldehyd, ble seksjonene inkubert i hybridiseringsbuffer (50% formamid, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM sitronsyre for justering til pH 6,0, 50 ug /mL heparin, 500 ug /ml gjær RNA) ved 37 ° C i 2 timer. Digoxigeninmerket, LNA-modifiserte prober fra Mir-143 (20 nmol /l; 5′-GAGCTACAGTGCTTCATCTCA-3 «, Exiqon) og MIR-145 (20 nmol /l; 5′-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3», Exiqon) ble tilsatt henholdsvis, og inkubert ved 55 ° C i 18 timer. Snittene ble vasket med 2 x SSC to ganger, så med 2 x SSC og 50% formamid ved 50 ° C tre ganger (30 min hver). Den anti-DIG-AP (1:1000, Roche) ble tilsatt etter PBS-T (0,1% Tween 20) vask og inkubert ved 4 ° C over natten. Snittene ble vasket fire ganger med PBS-T, og nitro tetrazoliumklorid /5-brom-4-klor-3-indonyl-fosfat ble brukt for flekken.
Cellekultur
Metastatisk pca cellelinjer inkludert PC-3 og LNCaP i denne studien. PC-3 ble ervervet fra American Type Culture Collection (ATCC) og holdt i F-12 kulturmedium (Hyclone) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone). LNCaP ble kjøpt fra Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, og vedlikeholdes i RPMI-1640 dyrkningsmedium (Gibico, Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone). Stabilt-transfekterte celler ble opprettholdt i media med nærvær av puromycin (Sigma-Aldrich). Cellene ble dyrket på en fuktig atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C.
Generering av stabilt transfekterte cellelinjer
Sekvensen av pri-MIR-143 og pri-MIR -145 ble klonet inn i pMSCV-puromycin plasmid med restriksjonsenzym Bgl II og EcoRI (New England Biolabs). 293ft Cellene ble så transfektert med nevnte konstruerte plasmider kombinert med PIK vektor eller tom pMSCV-vektor som kontroll, ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden som tidligere beskrevet [49]. Etter inkubering ved 37 ° C i 6 timer etter transfeksjon, ble mediet forandret, og cellene ble inkubert over natten. For å produsere nye virus, ble media samlet tre ganger om dagen til 293ft celler nå til total samløpet. Virus er anvendt for å infisere PC-3 og LNCaP-celler. 24 timer etter tilsetning av virus, ble infiserte celler utvalgt ved tilsetning av puromycin til vekstmedium. Stabile cellelinjer ble verifisert ved QRT-PCR. Begge pMSCV og PIK plasmider ble gitt av generøse Prof. Song LB, Sun Yat-Sen universitetet Cancer Center, Guangzhou, Kina.
Sårtilheling analysen
En dag før scratch, stabile cellelinjer PC-3 og LNCaP-celler ble trypsinert og sådd like inn i 6-brønners vevskulturplater, og vokste til nå nesten total konfluens i 24 timer. Når ikke-serum sult holdes i 24 timer etter celle-monolaget dannet, ble en kunstig homogen sår laget på monolaget med en steril 100 mL spiss. Etter riper, ble cellene vasket med serumfritt medium. Bilder fra celler som migrerer inn i såret ble tatt ved tidspunktene 0 av t, 6 timer, 12 timer og 24 timer etter invertert mikroskop (40 x).
In vitro
invasjon assay
invasjonen-analysen ble utført ved hjelp av Transwell kammer bestående av 8 um membranfilterinnsatser (Corning) belagt med Matrigel (BD Biosciences) som tidligere beskrevet [50]. I korthet ble cellene trypsinert og suspendert i serumfritt medium. Da 1,5 x 10
5-celler ble tilsatt til det øvre kammer, mens det nedre kammer er fylt med medium med 10% FBS. Etter å ha inkubert i 48 timer ble cellene invadert gjennom den belagte membran med den nedre overflaten, der cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med hematoksylin. Celletallet ble gjort under mikroskop (100 ×).
Heft analysen
vedheft analysen ble utført som beskrevet tidligere [51]. I korthet ble 96-brønners plater belagt med 50 ul fibronektin (50 ug /ml) i originalmediet ved celle-inkubator i 1 time. Etter å ha vasket med varm media ble platene blokkert med 1% BSA ved 37 ° C i 1 time og vasket to ganger. Etter trypsinering ble cellene suspendert utsådd i hver brønn med serum-fritt medium ved en tetthet på 1,5 x 10
4 celler per brønn. Når inkubert platene i 30 min, ble ikke-adherente celler fjernet og platene ble forsiktig vasket to ganger med PBS. Adherente celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur, deretter farget med hematoksylin og tellet under invertert mikroskop (100 x).
Western blotting
For ekspresjon analyse av EMT- relaterte proteiner, immunoblotting analysen ble utført. Alle de stabile cellelinjer, inkludert PC-3 /vektor, PC-3 /MIR-143, PC-3 /MIR-145, LNCaP /vektor, LNCaP /MIR-143 og LNCaP /MIR-145, ble sådd i 100 mm vev kultur retter. Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS forhåndsavkjølt ved samløpet nådde 60-70%, etterfulgt av høstes i prøvebuffer [62,5 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol, og 5 % 2-β-merkaptoetanol]. Like mengder protein fra supernatanten ble lastet per kjørefelt og løses ved SDS-polyakrylamid elektroforese. I rekkefølge ble proteinet overført til PVDF-membran (Millipore), blokkert med 5% fettfri melk i 1 time ved romtemperatur, og probet med primære antistoffer (1:1000) i 3 timer, inkludert mus anti-E-cadherin (BD Biosciences ), mus anti-Fibronektin (BD Biosciences) og mus anti-vimentin (BD Biosciences). Membraner ble vasket tre ganger (10 minutter hver) i TBS-T-buffer og inkubert i 40 minutter ved romtemperatur med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-muse sekundære antistoffer. Blottene ble vasket tre ganger (10 min hver) i TBS-T og utviklet ved hjelp av ECL-systemet. Protein lasting ble normalisert ved reprobing de blotter med mus anti-α-Tubulin antistoff (Abcam).
In vivo
modeller av prostatakreft bein metastase
Intra-tibial injeksjon modellen ble anvendt. ti mann alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus av 3~4 uker gammel ble kjøpt fra HFK Bio-Technology.CO., LTD (Beijing, Kina). Før inokulering, ble PC-3-celler resuspendert i 40 pl serun fritt F-12 medium med en tetthet på 2 x 10
5 celler per 40 uL, og injisert med en 26-gauge nål inn i skinnebenet ved hjelp av en borebevegelse . Dyr ble randomisert i to grupper likt, hvor hver 5 dyr ble behandlet med PC-3 /MIR-143 eller PC-3 /MIR-145 på høyre skinnebein hhv. Alle 10 mus ble injisert med PC-3 /vektor på venstre tibias som selvkontroll. Mus ble overvåket ukentlig for tumorvekst. På uke 5, ble bakbena radiograferer bruker en Faxitron røntgenmaskinen (Faxitron X-ray Corp, USA) for å oppdage bein lesjoner. Deretter ble musene avlivet, og skinnebein ble samlet, decalcified og fiksert i formalin for ytterligere histologisk analyse. Bein lesjoner ble evaluert og beregnet som beskrevet som tidligere beskrevet [52], der 0 grade for ingen lesjon, en for små lesjoner, to for små lesjoner, 3 for betydelige lesjoner med mindre pause på marginer, og 4 for betydelige lesjoner med stor pause i perifere lesjoner.
Statistisk analyse
for å finne ut forskjellige uttrykk av miRNAs i Microarray, Betydning analyse av mikromatriser (SAM, versjon 2.1) ble utført ved hjelp av to klasse uparede sammenligning i SAM prosedyren. Betydelig forskjellig uttrykt mirnas ble valgt som følgende standarder: | Score (d) | ≥2 [Teller (r) /Nevner (s + s0)], Brett Change≥2 eller ≤0.5, og q-verdi (%) ≤5 ( falske funnrate, FDR) i bein metastasering av PCa forhold til primær PCa.
data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistikken ble vurdert ved hjelp av SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). I real-time PCR og dyreforsøk, ble data sammenlignet med Student
t-test
. Forholdet mellom nedregulert miRNA uttrykk og clinicopathological funksjoner i grunnskolen og beinmetastatisk PCa ble analysert ved hjelp av Spearman rank korrelasjon test. I metastaseanalysebaserte eksperimenter, ble dataene analysert med en enveis ANOVA. For å forstå forholdet mellom mirnas ble signifikante sammenhenger bestemmes ved hjelp av Kendall rank korrelasjon test.
p
-verdier på. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
miRNA uttrykket profilering mellom primær PCa og bein metastasering av microarray analyse
For å undersøke enten mirnas er forskjellig uttrykt i primær PCA og beinmetastatisk vev, samlet vi seks matchet-par av primære og metastatiske vev (fra samme pasient) og sammenlignet deres uttrykk profiler ved hjelp av en miRNA microarray. Fordi total RNA i fem par prøvene var ikke nok for en microarray eksperiment, ble bare en matchet-par av prøvene vellykket utført med en microarray eksperiment. Vi observerte en åpenbart økt uttrykk av 18 miRNAs i beinmetastaser sammenlignet med primær PCA inkludert Mirs-451, -210, -141, -19b, -29b, -16, ^ 20, -30b, -193a-3p, -15a , -181a, -26b, -200a, -106b, -20b, -486-5p, -15b, -363. Ekspresjonen av tre mirnas (Mirs-145, -143, -612) var åpenbart redusert beinmetastase, spesielt ekspresjon av MIR-145 og MIR-143 med reduksjon av 5,4 ganger og 2,7 ganger henholdsvis.
for ytterligere å avgjøre om uttrykket av miRNAs hadde statistisk forskjell i primær PCa og beinmetastatisk vev, sammenlignet vi mirnas uttrykk i 6 primær PCA prøver og syv bein metastatisk prøver ved hjelp av en miRNA microarray. Vi har funnet at ekspresjonen av 5 mirnas hadde signifikant redusert i beinmetastaser i forhold til primære PCa, inkludert Mirs-508-5p, -145, -143, -100 -33a og med reduksjon av 4,1 ganger, 8,1 ganger, 5,7 ganger, 3,2 ganger og 5,3 ganger i henholdsvis. Ingen miRNA uttrykket betydelig høyere (tabell 1).
Tatt alle data sammen, vi har reanalysert uttrykket data fra 10 mirnas, inkludert Mirs-508-5p, -143, -145, -100 , -125b, -153, -210, -363, -451 og -572, etter klyngeanalyse (Figur 1
A
).
A,
sertifisert resultatet av microarray analyse.
B, etter Real-time RT-PCR-analyser på MIR-143 (venstre panel), MIR-145 (høyre panel), og MIR-125b (nedre panel) i 16 primær prostatakreft og 13 bein metastase vev . Rekkefølgen av vevsprøver er den samme for alle tre plott.
p
-verdier av
t-test
.
Verifisering av miRNA microarray data ved real-time PCR-analyse i primær PCa og bein metastase
for å bekrefte våre microarray data, ble real-time PCR utføres for å analysere uttrykk for de mest betydelig regulert mirnas, inkludert Mirs-508-5p, -143, -145, -33a og -100. Vi undersøkte uttrykk for miRNAs over fra uavhengige prøver av 16 primær PCa og 13 skjelettmetastaser, som ikke hadde blitt brukt for microarray analyse. Etter individuell miRNA nivået i hver prøve ble kvantifisert og normalisert til U6 uttrykk, bekreftet real-time PCR data at ekspresjon av Mirs-145, -143, -100 -33a og med reduksjon av 17.3-ganger, 12,9 ganger, 1.7 gangers og 1,7 ganger i bein metastatisk vev, henholdsvis. Uttrykket nivåer av Mirs-143 og -145 ble nedregulert betydelig i metastaseprøver versus primær PCa (
p
= 0,012 og p = 0,014, henholdsvis) (figur 1
B
). Men uttrykket av Mirs-33a og -100 hadde ingen statistisk signifikans (
p
= 0,236 og
p
= 0,448, henholdsvis). MIR-508-5p uttrykte ikke i alle primære PCA prøver og bein metastaserende prøver. Selv om ekspresjonen av Mirs-125b, -153, -210, -363, -451 og -572 ble i løpet av to-gangers endring i benmetastase, sammenlignet med i primær PCA prøver i mikromatriseanalyse, var det ingen statistisk signifikant forskjell med unntak av uttrykk for MIR-125b med reduksjon av tre ganger i bein metastatisk vev ved real-time PCR-analyse. Dette var statistisk signifikant nedregulering i bein metastatisk prøver (
p
= 0,012) (figur 1
B
). Dermed er resultatene indikerte at det var en betydelig nedregulering av Mirs-145, -143, og -125b når PCA svulster spredning til bein.
For ytterligere å identifisere de viktigste uttrykk kilder i primær PCA prøver, LNA-ISH teknikken ble brukt. Resultatene viste at Mirs-143 og -145 i hovedsak uttrykt i kreftceller, og deres ekspresjon i stromale celler var lavere eller fraværende (figur 2).
seksjoner på øvre panel viste identifikasjon av tumorceller og stromal celler ved H E-stainning. Seksjoner på nedre panelet viste plasseringen av MIR-143 (til venstre) og Mir-145 (til høyre) i PCA celler ved LNA-ISH. Signaler om Mirs-143 og -145 var i lilla blå. Bildene ble tatt under mikroskop 200 ×.
Relativ uttrykk for Mirs-143 og -145 i samme prøve
For ytterligere å undersøke om uttrykket tendens MIR-145 og speil 143 var identisk i samme prøve, den relative ekspresjon av MIR-145 og MIR-143 i den samme prøven ble plottet fra sanntids-PCR i alle 22 prøver av primær PCa (inkludert 6 microarray prøver) (figur 3
A
) og 20 prøver av skjelettmetastaser (inkludert 7 microarray prøver) (figur 3
B
), henholdsvis. De betydelige korrelasjoner av MIR-145 og MIR-143 ble funnet i primær PCa (Kendall korrelasjon = 0,850,
p
0,001) og skjelettmetastaser (Kendall korrelasjon = 0,765,
p
.. 0.001)
A-B, etter uttrykk for Mirs-143 og -145 og deres relasjoner i primær prostatakreft prøver (A) og bein metastaseprøver (B)
nedregulering av Mirs-143 og -145 er negativt korrelert til beinmetastaser, serum PSA nivå og Gleason score i primær PCa
Siden vi fant ut at Mirs-143 og -145 ble nedregulert i benmetastase, postulerte vi at nedregulering av Mirs-143 og -145 kan også være forbundet med clinicopathological trekk ved PCA pasienter. For det første, utførte vi en retrospektiv undersøkelse av 22 pasienter med primær PCa. Resultatene viste 12 pasienter uten benmetastase og 10 pasienter med benmetastase. Fordelingen av alder på 22 pasienter med og uten benmetastaser var ingen signifikant forskjell. Uttrykket av Mirs-143 og -145 av 10 pasienter med benmetastaser var betydelig lavere enn i 12 pasienter uten skjelettmetastaser (
p
= 0,039 og
p
= 0,041, figur 4,
A Hotell og
D
). Dernest vurderes vi om uttrykket av Mirs-143 og -145 ble knyttet til total serum prostata-spesifikt antigen (PSA) nivå og fri PSA-nivå i grunnskolen PCa. Resultatene viste signifikant invers korrelasjon mellom uttrykket av Mirs-143 og -145 og fri PSA-nivå (Spearman korrelasjon = -0,501,
p
= 0,018; Spearman korrelasjon = -0,536,
p
= 0,010. Figur 4,
B Hotell og
E
), og en signifikant invers korrelasjon mellom uttrykket av MIR-145 og total PSA-nivå (Spearman korrelasjon = -0,456,
p
= 0,033, Figur 4
F
); mens ingen sammenheng mellom uttrykket av MIR-143 og total PSA-nivå (Spearman korrelasjon = -0,403,
p
= 0,063). Til slutt undersøkte vi om uttrykket av Mirs-143 og -145 var relatert til Gleason score i primær PCa. Det er også en statistisk signifikant invers korrelasjon mellom uttrykket av Mirs-143 og -145 og Gleason score (Spearman korrelasjon = -0,574,
p
= 0,005; Spearman korrelasjon = -0,546,
p
= 0,009, figur 4,
C Hotell og
G
). Resultatene indikerte at downregulations av Mirs-143 og -145 ble assosiert med tumorprogresjon og bein metastasering. Nedregulering av mir-125b ble ikke korrelert til beinmetastaser, PSA nivå og Gleason score i primær PCA (data ikke vist).
A og D,
uttrykk for Mirs-143 eller -145 hos pasienter med skjelettmetastaser var betydelig lavere enn uten metastaser (
t-test
,
p
= 0,039,
p
= 0,041, henholdsvis).
B og E,
tumorprøver ble delt inn i fire grupper med tilnærmet samme utvalgsstørrelser basert på nivå av fritt PSA. Nivået av fritt PSA hos pasienter med primærtumor er presentert på x-aksen. Y-aksen er gjennomsnittet av Mirs-143 eller -145 innenfor hver gruppe. Stolpene representerer standardfeil. Det var en statistisk signifikant Spearman korrelasjon som preget en invers sammenheng mellom Mirs-143 eller -145 uttrykk og fri PSA (Spearman korrelasjon = -0,501,
p
= 0,018; Spearman korrelasjon = -0,536,
p
= 0,010).
F, etter Nivået av total PSA er også korrelert med MIR-145 (Spearman korrelasjon = -0,456,
p
= 0,033).
C og G, etter Gleason score av primærtumor gruppe presenteres på x-aksen. Y-aksen er gjennomsnittet av Mirs-143 eller -145 innenfor hver gruppe. Stolpene representerer standardfeil.
