Abstract
Vi brukte protein uttrykk profiler for å utvikle en klassifisering regel for påvisning og prognostisk vurdering av blærekreft i annulleres urinprøver. Ved hjelp av Ciphergen PBS II ProteinChip Reader, analyserte vi proteinprofilene av 18 parene av prøver av blære tumor og tilstøtende urothelium vev, et treningssett av 85 annullert urinprøver (32 kontroller og 53 blærekreft), og en blindet testing sett med 68 annullert urinprøver (33 kontroller og 35 blærekreft). Ved hjelp av t-tester, identifiserte vi 473 topper som viser betydelig differensial uttrykk på tvers av ulike kategorier av paret blære svulsten og tilstøtende uroteliale prøvene sammenlignet med normal urothelium. Deretter intensitetene av disse 473 topper ble undersøkt i et treningssett med annulleres urinprøver. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi identifisert 41 proteintopper som ble forskjellig uttrykt i begge sett av prøver. Uttrykket mønsteret av de 41 proteintopper ble brukt til å klassifisere annulleres urinprøver som ondartet eller godartet. Denne fremgangsmåten ga en følsomhet og spesifisitet på 59% og 90%, henholdsvis, på treningssettet og 80% og 100%, henholdsvis, på testsettet. Den proteomikk klassifisering regel utført med tilsvarende nøyaktighet i lav- og høy grad av blære karsinom. I tillegg brukte vi hierarkisk clustering med alle 473 proteintopper på 65 godartede annullert urinprøver, 88 prøver fra pasienter med klinisk tydelig blærekreft, og 127 prøver fra pasienter med en historie av blærekreft å klassifisere prøvene i Cluster A eller B. svulstene i Cluster B ble preget av klinisk aggressiv atferd med betydelig kortere metastase-fri og sykdomsspesifikk overlevelse
Citation. Majewski T, Spiess PE, Bondaruk J, Black P, Clarke C, Benedict W, et al. (2012) påvisning av blærekreft ved hjelp av proteomikk Profilering av urin sedimenter. PLoS ONE 7 (8): e42452. doi: 10,1371 /journal.pone.0042452
Redaktør: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 9 april 2012; Godkjent: 06.07.2012; Publisert: 03.08.2012
Copyright: © Majewski et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grants R01 CA 151489 (BC) og GU SPORE Grant P50 CA91846 (Prosjekt 1, BC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. CC var opprinnelig ansatt i Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, California på tidspunktet for den første studien relatert til dette prosjektet. For tiden jobber hun i Office of Vice President for translasjonell forskning ved University of Texas M D Anderson Cancer Center. Hennes tilknytning Ciphergen endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Strøm patogenetiske konsepter postulere at vanlige svulster i blæren oppstår i sin epitelial slimhinnen (urothelium) via to forskjellige men noe overlappende veier: den papillær og nonpapillary veier. [1] Omtrent 80% av de tumorer som oppstår i blæren er exophytic papillære lesjoner som stammer fra hyperplastiske urothelial endringer. De vanligvis gjentas, men vanligvis ikke trenge inn i blæreveggen eller metastasere. De resterende 20% av blæren svulster er aggressive, nonpapillary karsinom med en tilbøyelighet til å invadere og metastasering. Invasive blære kreft oppstår vanligvis hos pasienter uten tidligere papillærtumorer og stammer fra
in situ
preneoplastiske lesjoner som spenner fra mild til moderat dysplasi (lavgradig intraurothelial neoplasi, LGIN) til alvorlig dysplasi og carcinoma
i situ product: (høyverdig intraurothelial neoplasi, HGIN). [2] De fleste av aggressive høyverdig ikke-papillær blære carcinoma stede på et avansert stadium og nødvendig kjemoterapi og /eller radikal cystektomi for å bedre overlevelse.
For studier av biomarkører, blære carcinoma er en ideell sykdomsmodell , fordi dens utvikling og progresjon kan overvåkes ved hjelp av ikke-invasiv eller minimalt invasive teknikker. [3] blæreslimhinnen kan undersøkes og biopsier kan fås via et endoskopisk inngrep. I tillegg, kan morfologien av ekspandert urotelialceller og deres bestanddeler så vel som utskilte produkter gjennomgås i urinen uten risiko for pasienten.
proteomic teknologier som involverer massespektrometri kombinert med ProteinChip systemer har vist seg å lette protein profilering av biologiske prøver. [4] – [6] De første resultatene dokumenterer identifisering av serum og urin protein fingeravtrykk for diagnostisering av flere kreftformer [7] – [9] har blitt fulgt av rapporter heve bekymringer om problemer med studiedesign, reproduserbarhet, kalibrering og analytiske prosedyrer [10] – [13]
proteomikk profilen til blærekreft utvikling fra
in situ
neoplasi ble utviklet på en samling av proteomikk spektra fra parede prøver av urothelial karsinom (UC) og tilstøtende. urothelium sammenlignet med normal urothelium. Ved bruk av denne tilnærmingen, ble 473 proteintopper uttrykt i normal urothelium identifisert. Det samme 473 ble senere identifisert i opplæringen sett annullert urinprøver fra kontrollpersoner og pasienter med UC. De proteintopper først identifisert som unormalt uttrykt i vevsprøver (filtrering trinn 1) og deretter i treningssettet med annulleres urinprøver (filtreringstrinn 2) ble anvendt til å utforme en klassifiseringsregel. Ytelsen til klassifisering regelen ble vurdert først i treningssettet og deretter i en blind test sett. Til slutt ble en klyngeanalyse utført ved hjelp av 473 proteintopper på all kontroll og UC prøver å identifisere proteomikk signaturen til aggressiv blærekreft.
Denne rapporten skisserer en strategi for protein profilering ved hjelp av overflate forbedret laser desorpsjon og ionisering time-of-flight (SELDI-TOF) massespektroskopi for å formulere en klassifisering regel for å oppdage blærekreft i annulleres urinprøver og klassifisering av klinisk forskjellige klasser av sykdommen.
(A) digitalisert proteomikk profilen til blæren kreftutvikling fra
in situ
neoplasi. Ekspresjonsnivåene av proteintopper ble analysert på parede prøver fra tilstøtende urothelium (AU) og UCS i forhold til normal urothelium (NU). Hver kolonne representerer UC eller AU prøver og hver rad tilsvarer en digitalisert proteintopper ordnet etter
M /Z
forholdstall. Prosenter av enkelte
M /Z
topp i forhold til NU er vist som en fargemetning skala under diagrammet. Prøvene som tilsvarer AU og UC er gruppert etter deres patogenetiske undergrupper som representerer lav grad (grad 1-2) overfladisk papillær UC (LGPUC) og høy grad (grad 3) invasiv UC (HGNPUC). Baren diagrammet til høyre viser individuelle proteintopper med høyere (rød) og lavere (blå) uttrykk nivåer sammenlignet med NU. Kolonne 1: sammenligning mellom NU og AU LGPUC, 2: sammenligning mellom NU og LGPUC, 3: sammenligning mellom NU og AU HGNPUC, 4: sammenligning mellom NU og HGNPUC. (B) proteomikk profil annullert urinprøver fra kontrollpersoner (normal kontroll, NC) og pasienter med UC dikotomert inn LGPUC og HGNPUC kategorier. Baren diagrammet til høyre viser individuelle proteintopper med høyere (rød) og lavere (blå) uttrykk nivåer sammenlignet med NU. Kolonne 1: sammenligning mellom NC og LGPUC; Kolonne 2: sammenligning mellom NC og HGNPUC. (C) Antall proteintopper med høyere (rødbrun) og nedre (lilla) uttrykk nivåer sammenlignet med NU identifisert i sammenkoblede vevsprøver av AU og i annulleres urinprøver av pasienter med UC i forhold til NC. (D) Andel av proteiner topper med lignende og ulikt uttrykk mønster.
Metoder
svulsten og urinprøver
Alle menneskelige vev ble samlet wpith etter skriftlig informert samtykke protokoller godkjent av MD Anderson Institutional Review Board og prøvene ble analysert anonymt. Vi analyserte protein uttrykk profiler av 18 par prøver av blæretumor og tilstøtende urothelium vev, 88 annullert urinprøver fra pasienter med klinisk tydelig blærekreft, og 127 annullert urinprøver fra pasienter med en historie av blærekreft (HiUC) og ingen cystoskopisk eller patologisk tegn (negativ blære biopsi og /eller annulleres urincytologi) av blærekreft på tidspunktet for urinoppsamling. For sammenkoblede prøver av tilstøtende urothelium og blære svulstvev, fikk vi baseline proteinprofiler fra uroteliale cellesuspensjoner av 13 urinlederne med ingen bevis for uroteliale neoplasi fjernet under nefrektomi for nyrecellekreft. For urinprøver, fikk vi baseline proteinprofiler fra 65 friske individer. Profilene ble først analysert i parvise prøver av tilstøtende urothelium og blære svulstvev. De ble deretter sammenlignet med de profiler som er identifisert i de første 85 prøver av urin (32 kontroller og 53 blærekreft) referert til som treningssettet. Deretter proteinene som var betydelig opp- eller ned-reguleres i begge sett ble anvendt i en diagnostisk algoritme første på treningssettet (n = 85) av urinprøver og deretter på en blindet testsett (n = 68; 33 kontroller og 35 blærekreft). Til slutt ble proteomikk profiler av alle prøvene (65 normale kontroller, 88 blærekreft, og 127 HiUCs) analysert ved bruk uten tilsyn clustering.
(A) Up regulert (rød) og nedregulert (blå) proteintopper identifisert i AU og UC (øverste rad) og annullert urinprøver (midten rad) og proteintopper konsekvent funnet i begge sett av prøver (nedre rad). (B) Termisk kart for 41 proteintopper som er identifisert ved å filtrere trinn 2. (Se figur 1) (C) Klassifikasjon av enkeltprøver (venstre panel) og ROC-kurve (høyre panel) i treningssettet. (D) Klassifisering av enkeltprøver (venstre panel) og ROC kurven (høyre panel) i testsettet.
intraurothelial forløper forholdene ble klassifisert på parallelle seksjoner fra områder med tilstøtende slimhinnen som LGIN eller HGIN . [2] Tilstedeværelsen av normal, dysplastisk, eller maligne celler i avskraping fra tilstøtende urothelium vev ble bekreftet ved hjelp av mikroskopisk evaluering av Cytospin preparater. Svulstene ble klassifisert i henhold til tre-lags World Health Organization histologisk gradering systemet og deres vekstmønster (papillær versus nonpapillary). [14] Dybden av invasjonen ble registrert i henhold til TNM (tumor-node-metastase) iscenesettelse system. [15] Stage T
1 (lamina propria invasjon) har blitt delt inn i T
1a (ingen muskularis slimhinner invasjon) og T
1b (muskularis slimhinner invasjon), som har en betydelig høyere risiko for progresjon. [16] Tumorene ble dikotomisert til overfladisk (T
a-T
1a) og invasiv (T
1b og høyere) grupper, som tidligere beskrevet. [17]
(A) Klassifisering av enkeltprøver (venstre panel) og ROC kurven (høyre panel) basert på 65 godartede kontrollprøver og 53 prøver fra pasienter med LGPUC. (B) Classificatin av enkeltprøver (venstre panel) og ROC kurven (høyre panel) basert 65 godartede kontrollprøver 35 prøver fra pasienter med HGNPUC. (C) Klassifisering av enkeltprøver (venstre panel) og ROC kurven (høyre panel) basert på 65 godartede kontrollprøver og 88 prøver fra pasienter med UC. (Kombinert trening og testing sett) (D) Sammenligning av diagnostisk nøyaktighet av proteomikk og cytologi på 39 prøver fra pasienter med UC. (E) Klassifisering av individuelle prøver av proteomforskning basert på den kombinerte testing og treningssett, samt for LGPUC og HGNPUC separat.
Cellesuspensjoner fra tilstøtende urothelium og blæretumorvevet ble fremstilt som beskrevet tidligere. [16] I korte trekk, cystektomi prøver av tidligere ubehandlede uroteliale karsinom ble brukt etter å ha innhentet informert samtykke fra pasientene. Hver cystektomi prøve ble åpnet i lengderetningen langs den fremre veggen av blæren og festet ned til en parafinblokk. En representant avsnitt fra det sentrale området av grovt identifisert svulst ble innhentet for proteomikk profilering. Tilstedeværelsen av tumor i vevet ble bekreftet via analyse av frosne seksjoner. For å minimere forurensning med nontumor vev, dissekert vi et område av tumorvev fra den frosne blokken. Vi har fremstilt urothelial Cellesuspensjoner fra tilstøtende urothelium vev ved å skrape slim-overflata. Renheten av prøvene ble bestemt ved hjelp cytologiske undersøkelse av Cytospin preparater. Kun prøvene som ga mer enn 90% mikroskopisk intakt normal, dysplastisk, eller maligne urotelialceller ble anvendt for proteinanalyse. For behandling ble cellene overført til koniske rør som inneholdt fosfatbufret saltvann (PBS). Den frosne tumorvevet ble overført til en tilsvarende konisk rør inneholdende PBS, som ble mekanisk omrørt for å frigjøre tumorceller. Før forbereder cellelysater, precleaned vi cellesuspensjoner via Ficoll Histopague-1077j (Sigma Diagnostics, Inc. St. Louis, Missouri, USA) gradient sentrifugering. For lagring ble cellepelletene resuspendert i PBS inneholdende 20% dimetylsulfoksyd og frosset i flytende nitrogen. Annulleres urinprøver ble behandlet på samme måte. [3]
kohorten inkluderte 65 friske kontrollpersoner (NC), 88 pasienter med klinisk tydelig blærekreft (UC) og 127 pasienter med en historie av blærekreft (HiUC). Clustering ble utført ved anvendelse av euklidsk avstand og matrisen av uttrykk intensiteter for 473 proteintopper. Hver kolonne representerer en annullert urinprøve og hver rad tilsvarer de digitaliserte proteintopper ordnet etter
M /Z
forholdstall.
Behandling av urinprøver ble gjennomført i løpet av 1-4 timer etter mottak. Volumet av urin varierte fra 10 til 50 ml. Urinprøver ble sentrifugert ved 2500 rpm i 10 minutter ved romtemperatur. Cellepelleten ble resuspendert i 2 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). Den nye konisk rør (50 ml) ble fylt med 20 ml DMEM, og 5 ml Ficoll ble plassert i bunnen. Urin Cellene ble deretter overført til toppen av oppløsningen. Etter sentrifugering ved 2500 rpm i 20 minutter ved romtemperatur, ble 10 ml øvre sjiktet fjernet, og grensesnittet (~8 ml) med urin-celler ble overført til en ny konisk rør (25 ml). Prøven ble sentrifugert igjen ved 2500 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Til slutt ble cellene samlet opp, resuspendert i 2 ml DMEM med 10% dimetylsulfoksyd, og lagret ved -80 ° C for senere bruk.
(A) Fordeling av annulleres urinprøver i klynge A og B i normal kontroller (NC), pasienter med klinisk tydelig blærekreft (UC) og pasienter med historie av blærekreft (HiUC). (B) Fordeling av annullert urinprøver i klynger A og B i henhold til histologisk grad og stadium dikotomisert til lav karakter invasiv overfladisk papillær UC (LGPUC, PT
a – PT
1a) og høy grad av ikke-papillær UC ( HGNPUC, T
1b og høyere). (C) Kaplan – Mayer plott av metastasering og sykdom spesifikk overlevelse av pasienter med blærekreft i klynger A og B.
Utarbeidelse av cellelysater og proteomikk analyse
Cellelysater var forberedt som det refereres til i Bio-Rad nettsted. [18] I korthet prøvene ble tauet, sentrifugert ved 5000 g i 10 minutter, vasket i PBS og resuspendert i en lyseringsbuffer (10 mM Tris [pH = 9], 10 mM NaCl, 0,1% dodecyl mattoside). Protein lysater ble fremstilt via sonikering ved anvendelse av en probe-sonikator (Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, IL, USA) satt til 5 watt 10 ganger i 15 sekunder med 45 sekunders intervaller for avkjøling på is. Totale proteininnholdet ble målt i hver prøve ved hjelp av en Micro BCA proteinanalyse reagenssettet (Pierce, Rockford, IL, USA). Immobilisert metall affinitet IMAC3 fange chips (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA) ble brukt for proteomikk analyse. Chips aktiveres av kobbersulfat ble kort vasket i avionisert vann og inkubert med 100 mM natrium-acetat (pH 4,5) i 5 minutter for å fjerne eventuelt overskudd av Cu
2 og igjen vasket med deionisert vann. Flisen ble raskt bragt til likevekt med cellelyseringsbuffer og inkubert i 1 time med protein-lysater inneholdende 1 mikrogram av totalt protein i et volum på 3-8 pl av lyseringsbuffer. Før lesing ble flisen vasket tre ganger med lyseringsbuffer, to ganger med deionisert vann, lufttørket, og krystallisert med 0,3 ul sinapinic syre i 50% acetonitril /1% trifluoreddiksyre. Alle forberedende trinn ble utført ved romtemperatur. Protein profilene ble analysert ved hjelp av en Ciphergen PBS II ProteinChip Reader (Ciphergen Biosystems Fremont, CA, USA). Før hver måleserie, ble systemet kalibreres ved bruk av en «alt-i-ett» standard fra Ciphergen Biosystems, og den proteomikk profil av en normal referanse vev, det vil si, fra normal urothelium vev eller av urinsediment fra normale individer, ble testet.
(A) protein profiler mellom 3300 og 3600 m /z av representative prøver som tilsvarer NC, LGPUC og HGNPUC viser den uttrykksmønster av tre proteintopper med 3370, 3440 og 3490 ± 10 m /z referert som topper 1-3 (pk 1-3) representerer klyngen av a-defensins. (B) Zoomet varme kart som viser uttrykket mønster av α-defensin klyngen i treningssettet. (C) Uttrykket intensiteter av α-defensin klynge som tilsvarer pk 1-3 i trakk prøver av testing og opplæring sett med NC, LGPUC og HGNPUC. Crossed røde linjer og vertikale linjene representerer gjennomsnitt og standardavvik. To sample T-test ble brukt for å sammenligne log2-transformert peak intensiteter i kreftprøver og kontroller for hver respektive peak (p 0,001).
For å vurdere nøyaktigheten av målingene, utførte vi flere studier. [19] Vi evaluerte intensitetene til toppene 26 i 24 replikat-spektra av den samme prøven fra normalt vev urothelium å kontrollere reproduserbarheten (figur S1). Peak variasjonskoeffisient (CV) varierte fra 13,7% til 63,1% av gjennomsnittet. Median CV var 22,7%, og det interkvartile området var fra 19,4% til 27,7%. Vi testet også følsomheten av masse-til-ladning-forhold (M /Z) verdier til en mengde av totalt protein ved varierende belastninger fra 0,5 til 2 ug, og M /Z-avlesninger varierte med mindre enn 1% (data ikke vist).
Analytiske kontrollhandlinger
Alle spektra ble eksportert som * XML-filer ved hjelp av Ciphergen programvare. Den rå spektra ble behandlet ved hjelp av Matlab skript utviklet in-house til (a) fjerne tilfeldig støy, (b) trekke lavfrekvente baseline, og (c) å oppdage og kvantifisere individuelle prøve topper. Denoising og baseline subtraksjon ble utført ved bruk av wavelet terskel tilnærming. [20] Etter denoising ble spektra normalisert. Topp-påvisning gjort bruk av det midlere spektrum etter denoising. [21] Dataene fra alle spektrene ble sammenfattet i en matriks av toppintensitetene, med hver rad svarende til en spesifikk
M /Z
verdi (en topp), og hver kolonne tilsvarer en bestemt prøve.
Klassifisering nøyaktighet ble vurdert gjennom sensitivitet og spesifisitet og med positive og negative prediktive verdier. Klassifiseringen regelen ble også vurdert ved hjelp av mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver. Den varierende parameter i ROC-kurven var vinkelen mellom beslutningsgrense linje og den normale X-akse: en vinkel på 0 ° førte til at alle prøvene som blir klassifisert som normal, og en vinkel på 90 ° ført til at alle prøvene som blir klassifisert som kreft. I tillegg annullert urin spektra ble undersøkt ved hjelp unsupervised clustering å vurdere graden av assosiasjoner mellom de to klynger og ulike clinicopathologic kovariater, inkludert oppfølging.
Resultater
Den analytiske strategien brukes i vår studie for å formulere et protein profil for å oppdage blærekreft er oppsummert i figur 1. for å identifisere den optimale kombinasjonen av proteintopper diagnostiske av blærekreft, vi først analysert en proteomikk profilen sin utvikling fra
in situ
neoplasi og sammenlignet det med proteomikk profil annullert urinsediment fra blærekreftpasienter. For å identifisere de proteinene som ble unormalt uttrykk under blærekreft utvikling tidlig, analyserte vi mønstre av deres uttrykk i 18 parvise prøver av blæretumor og tilstøtende urothelium vev og sammenlignet dem med deres uttrykk mønster i 13 prøver av normal urothelium. Vi valgte først topper som var klart identifiserbare i vevsprøver og brukt t-tester for å identifisere topper som hadde betydelig differensial uttrykk på tvers av ulike kategorier av paret blære svulsten og tilstøtende uroteliale prøver. Ved hjelp av denne metode, som kalles filtreringstrinn 1, identifiserte vi 473 proteintopper uttrykt i normalt vev og urothelium sett av opp- og ned-regulerte proteiner, som var noe overlappende, men forskjellige, og derved betegner utvikling av blærekreft fra
in situ
neoplasi via papillær og nonpapillary veier. Siden annullert urin sedimenter kan inneholde en blanding av svulsten og nontumor celler, inkludert inflammatorisk, stromal og perifere blodceller samt nekrotiske celler med degenererte proteiner, fokuserte vi på de samme 473 toppene identifisert i vevsprøver og undersøkt deres intensitet i en treningssett av annulleres urinprøver fra 53 pasienter med klinisk tydelig blærekreft og 32 friske individer. I denne fase, betegnet som filtreringstrinn 2, søkte vi, igjen ved hjelp av t-tester, for topper med sterk differensialuttrykk mellom kreft og kontroller.
Eksempler på SELDI-TOF spektra fra prøver av normalt vev og urothelium parede prøver av tilstøtende urothelium og tumorvev, så vel som resultatene av filtreringstrinn 1 er vist i figur 2A. Spektrene fra annulleres urinsedimenter blærecancerpasienter og normale kontroller og resultatene av filtreringstrinn 2 er vist i figur 2B. Forskjellene i protein expression profiler av svulster som er identifisert i vev og annullert urinprøver er oppsummert i figur 2C og D. Det er åpenbart at HGINs eller høyverdig nonpapillary uroteliale karsinom (HGNPUC) har noe overlappende, men distinkte protein uttrykk mønstre som kan være også identifisert i tilstøtende urothelium vev. Denne oppdagelse medfører at unormale protein ekspresjonsprofiler kan identifiseres på overflaten urothelium vev før utviklingen av klinisk tydelig kreft. Ved å sammenligne mønstre av unormalt uttrykte proteiner i blæren svulster, deres tilstøtende urothelia, og annulleres urinprøver fra treningssettet, identifiserte vi et sett av distinkte opp- og ned-regulerte proteiner som var til stede i begge blære tumorvev og annulleres urinsediment prøver av pasienter med blærekreft som ble beholdt etter at begge filtreringstrinn. (Figur 3A og B).
Bruk bare toppene som passerte både filtrering skritt, brukte vi matrise av 41 protein peak intensiteter å konstruere en klassifisering regel for individuelle prøver i trening og testing sett. (Figur 3C) Posisjonene til de enkelte prøver i forhold til X (normal) og Y (kreft) akse ble definert ved hjelp av et tallpar som angir deres forbindelser med både normale og kreftproteinprofiler. I denne klassifiseringen regelen ble prøver med høye assosiasjoner med normale proteinprofiler og lave assosiasjoner med kreft profiler samlet i region 1 og ble klassifisert som godartet. I motsetning til dette, ble prøver med lave assosiasjoner med normale profiler og høye assosiasjoner med kreft profiler gruppert i region 2, og ble klassifisert som kreft. Prøver med like svake eller sterke assosiasjoner med normale og kreft profiler dannet ble gruppert i region 3 og ble utpekt som tvetydig. Grensene for disse klyngene ble definert ved hjelp leave-one-out kryssvalidering.
Klassifisering nøyaktighet ble først vurderes på trening satt i form av sensitivitet på 0,59, spesifisitet på 0,90, positiv prediktiv verdi i treningssettet på 0,92, negativ prediktiv verdi innenfor det treningssett på 0,53, og ROC-kurve område på 0,84. (Figur 3D) Etter å ha definert klassifisering regel på treningssettet, vi deretter validert nøyaktigheten på blindet testing sett av 33 normale kontrollprøver og 35 urinblæren kreft prøver, noe som ga en sensitivitet på 0,80, spesifisitet på 1,0, positiv prediktiv verdi på testingen sett av 1,0, negativ prediktiv verdi på testing sett av 0,83, og ROC-kurve område på 0,91. (Figur 3D) Saker som ble ansett som tvetydig ble ekskludert ved beregning sensitivitet, spesifisitet, positiv prediktiv verdi og negativ prediktiv verdi. Alle saker ble beholdt for montering ROC kurver.
For å vurdere hvordan klassifiseringen regel basert på matrise av 41 protein peak intensiteter som utføres i ulike undergrupper av blærekreft, vi kombinert trening og testing sett og vurdert sin diagnostisk nøyaktighet for lav grad av papillær urothelial karsinom (LGPUC) og HGNPUC separat. Analyse av 65 godartede kontrollprøver og 53 LGPUC prøvene ga en sensitivitet på 0,74, spesifisitet på 0,95, positiv prediktiv verdi på 0,91, negativ prediktiv verdi på 0,84, og ROC kurve område på 0,88. (Figur 4A) tilsvarende analyse av 65 godartede kontrollprøver og 35 HGNPUC prøvene ga en sensitivitet på 0,77, spesifisitet på 0,95, positiv prediktiv verdi på 0,90, negativ prediktiv verdi på 0,88, og ROC kurve område på 0,88. (Figur 4B) Analyse av den samlede klassifiseringen nøyaktighet for den kombinerte trening og testing sett ga en sensitivitet på 0,75, spesifisitet på 0,95, positiv prediktiv verdi på 0,95, negativ prediktiv verdi på 0,75, og ROC kurve område på 0,88. (Tall 4C og D) Analyse av 39 prøver fra pasienter med blærekreft som de parallelle data på resultatene av annullert urin cytologi var tilgjengelige indikerte at klassifikasjon basert på proteomikk data diagnostisert korrekt 28 (72%) prøver, mens annullert urin cytologi diagnostisert korrekt 19 (49%) prøver. (Figur 4E) Testing forskjellen mellom positive prøvene identifisert av proteomikk og cytologi ved hjelp av en z-test for proporsjoner ga en tosidig p-verdi på 0,032.
Unsupervised clustering ble utført med Euklidsk avstand og fullstendig kobling på alle 65 normale kontrollprøver, 88 prøver fra pasienter med klinisk tydelig blærekreft, og 127 prøver fra pasienter med en HiUC. (Figur 5) Ved hjelp av matrisen av uttrykk intensitet for alle 473 proteintopper, klassifisert vi prøvene i to store grupper. Den første gruppen (cluster A) besto av et flertall (97%) av godartet kontrollprøver. (Figur 6A) Den andre gruppen (cluster B) besto av 56% av prøver fra pasienter med klinisk tydelig blærekreft. Interessant, bare 24% av prøver fra pasienter med en HiUC ko-segregert med prøver fra pasienter med klinisk tydelig blærekreft i klynge B. De resterende 76% av prøvene fra pasientene med en HiUC og 44% av prøvene fra pasientene med klinisk tydelig blærekreft co-segregert med godartede kontrollprøver i cluster A. Vi antok at dette samarbeidet segregering kan bety forskjellige klasser av blærekreft og analysert patologiske og kliniske parametre av prøvene i klynger A og B. (figur 6B) Cluster A besto overveiende normale kontrollprøver (62%) i tillegg til 27% LGPUC og 11% HGNPUC. I motsetning til dette, cluster B omfattet bare 4% normale kontrollprøver, 49% LGPUC, og 47% HGNPUC. Tumorene i klynge B ble kjennetegnet ved betydelig kortere metastase-fri og sykdomsspesifikk overlevelse enn svulster fra klynge A. (figurene 6C og D) samlet, er sannsynligheten for å dø av blærekreft for pasienter i klynge B var ca. 12%, mens sannsynligheten for å dø for dem i klynge A var mindre enn 5%.
Selv om vi ikke utfører identifisering av toppene som brukes i en klassifisering regel tar vi deres potensial naturen ved å fokusere på de tre mest fremtredende topper anvendt i analysen av våre protein ekspresjonsprofiler. Klyngen av tre proteintopper med m /z-verdier som mest sannsynlig svarende til a-defensiner ble inkludert i klassifiseringsregelen. [22] – [24] Eksemplene på SELDI-TOF spektrene profiler mellom 3300 og 3600 m /z i representative urinprøver av negativ kontroll, LGPUC og HGNPUC skildrer uttrykk mønster av tre topper tilsvarende a-defensins og det zoomede varmen kartet i treningssettet er vist i figur 7A og B. ekspresjon mønster av de samme proteiner i kombinert trening og testing av settene viser deres overekspresjon i LGPUC og HGNPUC. (Figur 7C) Den overekspresjon mønster av a-defensins har stor betydning både LGPUC og HGNPUC sammenlignet med normale kontroller og selv om tatt ut av sammenheng av de 41 anonyme proteintopper som brukes i klassifiseringen regel disse proteinene utfører rimelig godt som diagnostisk markører (sensitivitet 0,77 og spesifisitet 0,84). (Figur 7C).
Diskusjoner
Studiet design for proteomikk profilering består vanligvis av en sammenligning av proteomikk mønstre av prøver fra pasienter med kreft og godartede kontrollprøver ved hjelp av kunstig intelligens algoritmer som genetiske algoritmer eller treet analyse. [25] – [29] En slik tilnærming identifiserer et begrenset antall anonyme proteintopper for kresne kreft fra godartet vev. Når slike topper ble identifisert ved peptid-sekvensering, representerte de, generelt, de såkalte akuttfaseproteiner i stedet for tumorspesifikke produkter [28].
Flere studier ved bruk av proteomikk profilering av latt urin for påvisning av blærekreft med SELDI plattformen ble nylig publisert. [30], [31] Disse studiene benyttet ulike metoder for protein-spektra-analyse som varierer fra bruken av kunstig intelligens algoritmer kombinert med overvåket clustering til individuell topp og topp klynge identifikasjon som diagnostiske diskriminerende parametre. [30], [31] Som forventet, automatisk gruppering algoritmen segregerte kontroller fra kreft prøver med høy følsomhet (80%) og spesifisitet (mer enn 90%) ble i treningssettet, men forbundet med et dramatisk fall av både sensitivitet og spesifisitet i testing satt til et område på ca. 50% og 60% henholdsvis. [30] Den kombinatorisk tilnærming av individuelle biomarkører og biomarkør klynger gitt sensitivitet på 87% og spesifisitet på 66%, men denne studien inkluderte ikke egen trening og testing sett av prøver. [31] Det er interessant de individuelle markører som er identifisert på denne måte inkluderte topper tilsvarende a-defensin familien.
