Abstract
Bakgrunn
Kennedy pathway genererer fosfocholin og phosphoethanolamine gjennom sine to grener. Kolin Kinase (Chok) er det første enzym Kennedy gren av syntese av fosfokolin, hovedkomponenten av plasmamembranen. Chok familien av proteiner som er sammensatt av ChoKα og ChoKβ isoformer, den første med to forskjellige varianter av spleising. Nylig ChoKα har vært innblandet i den kreftfremkallende prosess, ettersom det er overuttrykt i mange humane krefttyper. Imidlertid har ingen bevis for en rolle ChoKβ i kreftutvikling er rapportert.
Metodikk /hovedfunnene
Her sammenligner vi
in vitro Hotell og
in vivo
egenskaper ChoKα1 og ChoKβ i lipidmetabolismen, og deres potensielle rolle i kreftutvikling. Både ChoKα1 og ChoKβ viste kolin og etanol kinase aktiviteter når analysert i celleekstrakter, men med forskjellig affinitet for sine underlag. Men de oppfører seg forskjellig når overexpressed i hele celler. Mens ChoKβ vise et etanolamin kinase rolle, ChoKα1 presentere en dual kolin /etanolamin kinase rolle, noe som tyder på involvering av hver Chok isoform i forskjellige biokjemiske mekanismer under
in vivo
forhold. I tillegg, mens overekspresjon av ChoKα1 er onkogen når overexpressed i HEK293T eller MDCK celler, er ChoKβ overekspresjon ikke tilstrekkelig til å indusere
in vitro
celle transformasjon eller
in vivo
tumorvekst. Videre ble en betydelig oppregulering av ChoKα1 mRNA nivåer i et panel av brystkreft og lungekreft cellelinjer funnet, men ble ikke observert noen endringer i ChoKβ mRNA nivåer. Endelig MN58b, en tidligere beskrevet potent hemmer av Chok med
in vivo
antitumoraktivitet, viser mer enn 20 ganger høyere effektivitet mot ChoKα1 enn ChoKβ.
Konklusjon /Betydning
Denne studien representerer den første bevis på den distinkte metabolsk rolle ChoKα og ChoKβ isoformer, noe som tyder på ulike fysiologiske roller og implikasjoner i menneskelige kreft. Disse funnene utgjør et skritt videre i utformingen av en antitumor strategi basert på Chok hemming
Citation. Gallego-Ortega D, Ramirez de Molina A, Ramos MA, Valdes-Mora F, Barderas MG, Sarmentero-Estrada J, et al. (2009) Differential Role of Human Kolin Kinase α og p Enzymer i Lipidmetabolisme: implikasjoner i Cancer Onset og behandling. PLoS ONE 4 (11): e7819. doi: 10,1371 /journal.pone.0007819
Redaktør: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA
mottatt: 22 juni 2009; Godkjent: 07.10.2009; Publisert: 12.11.2009
Copyright: © 2009 Gallego-Ortega et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har blitt støttet med tilskudd til JCL fra Comunidad de Madrid (GR-SAL-0821-2004), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, RD06 /0020/0016), Fundación Mutua Madrileña, og ved en bevilgning til ARM fra Fundación Mutua Madrileña. DGO var en kar fra Comunidad de Madrid. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Menneskelig kolin kinase alfa (ChoKα) og beta (ChoKβ) er medlemmer av kolin kinase familien. Hos pattedyr denne familien er kodet av to separate gener,
CHKA Hotell og
CHKB
, noe som resulterer i tre forskjellige proteiner med en kolin /etanolamin kinase (Chok /EtnK) domene: ChoKα1 (NP_001268), ChoKα2 (NP_997634) og ChoKβ1 (NP_005189) [1]. ChoKα1 skiller seg fra ChoKα2 i bare en ekstra strekning av 18 aminosyrer, mens ChoKβ forskjellig fra ChoKα1 og ChoKα2 i ca 40%. Nærværet av Chok /EtnK domene overfører evnen til å katalysere fosforylering av cholin (Cho) for å fosfokolin (PCho) [1]. Dette utgjør det første trinnet i reaksjonsveien for biosyntese fosfatidylcholin (PC) [2]. PC er den viktigste fosfolipid i eukaryote membraner og spiller en avgjørende rolle i membranstrukturen og også i cellesignalisering [2]. Chok enzymer kan bli innblandet også i syntesen av fosfatidyletanolamin (PE), ved å bruke som substrat etanolamin for å gjengi phosphoethanolamine (PETN) [1], [3] – [5]
Tidligere studier antyder at Chok virker som. et dimert protein [6], [7], og har blitt foreslått at andelen av de forskjellige homo- eller hetero- dimer befolkning for å være vev-spesifikk [8]. Videre kombinasjonen mellom kolin kinase isoformer resulterer i et annet nivå av Chok aktivitet
in vitro
etter cellefrie systemer forhold. Således er det α /α homodimer den mest aktive kolin kinase form, β /β homodimer de mindre aktive, og det α /β heterodimeren har en mellomliggende fenotype [8].
spesifikk fosfolipase D-drevet hydrolyse av PC genererer kolin og signaloverførings metabolitter som f.eks PA (fosfatidinsyre), og dets derivater LPA (lysofosfatidisk syre) og Dag (diacylglycerol), som er viktige i mitogenese og cellulær transformasjon [9] – [11]. Kolin blir ytterligere konvertert av Chok til PCho, en stabil metabolitt i stand til å indusere mitogenesis i murine fibroblaster [12]. I tillegg er flere onkogener som
RAS
eller
RHOA
økning ChoKα aktivitet resulterer i høyere intracellulære nivåer av PCho [13] – [16]. Magnetisk resonansspektroskopi (MRS) studier har vist unormal metabolisme fosfolipid i kreftceller [17], [18]. Videre har høye nivåer av PCho blitt funnet i tumorceller, så vel som i tumorprøver fra kreftpasienter sammenlignet med de normale motstykker i bryst, prostata, hjerne og eggstokk-kreft [19] – [25]. Økningen i phosphoethanolamine er også rapportert i transformerte celler eller tumorprøver ved MRS, selv om den bidrar til en mye mindre grad, sammenlignet med økningen av PCho, til den phosphomonoester toppen [26].
Implikasjonen av ChoKα i cellevekst, proliferasjon, initiering og progresjon av kreft er godt dokumentert. ChoKα er overuttrykt i noen av de mest vanlige kreftformer, som for eksempel bryst-, lunge-, kolorektal-, prostata [27] – [30] og blære (upubliserte observasjoner). Videre har det onkogene aktivitet når de overuttrykkes i humane celler [15]. Økte ChoKα mRNA nivåer har nylig blitt beskrevet som en selvstendig prognostisk markør i ikke-småcellet lungekreft pasienter [30]. Også humane brystcancercellelinjer viser oppregulering av ChoKα men ikke ChoKβ, når sammenlignet med normale mammary epitelceller [21]. I den forstand, har det nylig blitt rapportert at i prostata svulst musemodell (TRAMP), ved hjelp av IHQ immundeteksjon av ChoKβ, et lavt nivå uttrykk for ChoKβ ble funnet i tumorprøver sammenlignet med villtype vev [31].
Implikasjonen av medlemmer av Rho GTPase familie i kreft angrep og progresjon har blitt grundig beskrevet [32] – [35]. Bevis for at Chok er involvert i ondartet transformasjon sammen med Ras og RhoA er gitt [14], [15], [36]. Videre er aktiviteten av ChoKα modulert ved hjelp av kjente effektorer av både Ras og RhoA [15], [29].
Farmakologisk inhibering av ChoKα er blitt foreslått som en ny antitumor-strategi [2]. En sterk støtte for denne strategi er basert på bruk av MN58b, et godt karakterisert ChoKα inhibitor, som viser en potent antiproliferativ effekt på flere tumorcellelinjer in vitro, og en sterk reduksjon av tumorvekst i nakne mus-xenotransplantater [14], [37] – [40]
Vi har sammenliknet de biokjemiske og biologiske egenskaper ChoKα og ChoKβ, og vise at i tillegg til deres homologi, er sistnevnte ikke er i stand til å indusere celle transformasjon i HEK293T eller MDCK celler.. Videre foreslår vi differensial atferd mellom a og p isoformer i fosfolipider metabolisme. Endelig kan den anti-tumorale egenskaper til MN58b tilskrives dens spesifikke inhibering av ChoKα. Implikasjonene av disse funnene blir diskutert.
Resultater
Karakterisering av enzymatiske egenskaper ChoKα1 og ChoKβ isoformer
Aktiviteten av begge kolin kinase isoformer, ChoKα1 og ChoKβ, har vært som er beskrevet tidligere i forskjellige pattedyrvev, men deres cholin-kinase og /eller etanolamin-kinase-aktivitet ikke er fullstendig klar [1], [4], [41] – [43]. Derfor må vi først gjennomført en komparativ analyse av
in vitro
kinase aktivitet av to menneskelige ChoKα1 og ChoKβ isoformer, om deres evne til å fosforylere kolin og etanolamin. HEK293T-celler ble transfektert med egnede ekspresjonsvektorer som bærer de humane CHKA eller CHKB gener eller en tom vektor, og testet for Chok og EtnK aktivitet. Ekspresjonsnivåer oppnådd ble undersøkt ved Western Blot (figur 1a), og den relative enzymatiske aktivitet fra celleekstrakter estimeres. Både ChoKα1 og ChoKβ vises kolin og etanolamin kinase aktivitet under disse eksperimentelle forhold, men den omregningskurs var tydeligvis annerledes (Figur 1b).
HEK293T celler ble transfektert med eukaryote ekspresjonsvektorer menneskelig ChoKα1 og ChoKβ1 genet. pCDNA3b tom vektor ble anvendt som kontroll. A) Overuttrykte ChoKα1 og ChoKβ1 i HEK293T celler oppdages av Western Blot. GAPDH påvisning ble anvendt som kontroll av ekspresjon nivå. B, C) In vitro Chok (B) og EtnK (C) Aktiviteten av kolin kinase α1 og ß1 isoformer i cellefrie ekstrakter av HEK293T transfekterte celler. Prosent av konvertering av
14C-kolin eller
14C-etanolamin til fosforylert produktet er representert. Forsøket ble utført i duplikat prøver, gjentas 4 ganger, og gjennomsnitt ± SEM verdier fra alle forsøkene estimerte.
Vi videre analysere Chok og EtnK kinetiske aktiviteter for ChoKα1 og ChoKβ isoformer ved hjelp av rekombinante enzymer. DH5a
Escherichia coli
ble transformert med genet som koder for human ChoKα1 eller ChoKβ og en enzymatisk
in vitro
analyse for enten Chok eller EtnK aktiviteter utført. Michaelis-konstantene (Km) for hver isoform til de forskjellige substrater ble erholdt (tabell 1). ChoKβ viste en Km for kolin 2,8 ganger høyere enn ChoKα1. I motsetning til Km fra ChoKβ for etanolamin var lavere enn ChoKα1. Disse resultater antyder at i cellefrie systemer kolin er et bedre substrat for ChoKα1 (2,85 ganger) enn ChoKβ, mens etanolamin er et bedre substrat for ChoKβ (5,83 ganger) enn ChoKα1.
Chok isoformene er differensielt regulert av Ras og Rho GTPases
Siden Ras og RhoA GTPases er oppstrøms regulatorer av ChoKα1 [15], [28], noen av de mest studerte proteiner av den lille GTPase familien inkludert H-Ras, og Rho Familiemedlemmer medlemmer~~POS=HEADCOMP RhoA og Cdc42 ble testet som potensielle oppstrøms modulatorer av ChoKβ. For dette formål, ble en
in vitro
Chok og EtnK aktivitetsanalysen utføres i HEK293T celler transfektert med de konstitutive aktive mutanter av hver GTPase (Fig. 2a) og enten ChoKα1 og ChoKβ. Som vist i figur 2, er ingen av de GTPases ble testet, var i stand til å øke kolin eller etanolamin-kinase-aktivitet av ChoKβ betydelig. I motsetning til dette, under lignende betingelser, Ras og RhoA var i stand til å indusere en signifikant endring i aktivering av både Chok og EtnK aktiviteter ChoKα1 (fig. 2b og 2c).
Choline kinase-isoformene ble uttrykt alene eller i kombinasjon med de indikerte Ras og Rho GTPases og
in vitro
Chok aktivitet bestemt. A) Analyse av ektopisk uttrykk ved Western Blot i HEK293T transfekterte celleekstrakter av ChoKα1 (52 kDa), ChoKβ1 (45 kDa), RhoA-QL (22 kDa), Cdc42-QL (25 kd) og H-rasV12 (23 kd) . Tomme vektorer ble brukt som kontroller for de endogene nivåer, og GAPDH som lasting kontroll. B) og C)
In vitro
cholin-kinaseaktiviteten ChoKα1 eller ChoKβ1 i nærvær av økt ekspresjon av konstitutive aktive former av RhoA, Cdc42 eller H-Ras. D) og E)
In vitro
etanolamin kinaseaktiviteten ChoKα eller ChoKβ i nærvær av hver enkelt indikert konstitutiv aktiv form av GTPase. Resultatene er representert som fold induksjon av konvertering til den tilsvarende fosforylert metabolitten bestemt som totalt cpm /mikrogram av hele mobilnettet ekstrakt, og normalisert til tom vektor transfekterte celler som kontroll. Data som er vist representerer gjennomsnittsverdier ± SEM fra 3 uavhengige forsøk, hvert utført med duplikate prøver. Statistisk signifikans (p≤0.05) er markert med en stjerne sammenligne med aktiviteten oppnås når ChoKα1 eller ChoKβ1 eventuelt blir tilført alene.
Differensial rolle mellom Chok isoformene i celle transformasjon og tumorigenesis
Implikasjonen av ChoKα1 i celletransformasjon og human karsinogenese er blitt grundig undersøkt, og det har vist seg å vise onkogene aktivitet [15], [36]. På grunn av sin omfattende homologi, undersøkte vi om ChoKβ kan indusere cellulær transformasjon når overexpressed i ikke-tumorigene celler. Først ble evnen til ChoKβ-transfekterte celler for å fremme forankringsuavhengig cellevekst bestemt ved anvendelse av cellelinjen HEK293T. Som tidligere rapportert, ChoKα1 induserte en signifikant økning i antall av myke agar kolonier [15]. I motsetning til dette, under tilsvarende betingelser, ChoKβ overekspresjon hadde ingen signifikant effekt på antallet eller størrelsen av koloniene sammenlignet med de som er generert av styre, tom vektor transfektert HEK293T-celler (Fig. 3). Disse resultatene ble bekreftet ved bruk av en annen ikke-tumorigen cellelinje fra en annen art som MDCK, å oppnå tilsvarende resultater på tross av det lavere nivå av overekspresjon av både Chok isoformene i forhold til de HEK293T cellene. Differensial nivået av ekspresjon oppnådd var på grunn av den heller forskjellig effektivitet i transfeksjon for hver cellelinjer (data ikke vist).
A) og B)
In vitro
Chok aktivitet av celle-fri ekstrakter fra transfekterte celler i det øyeblikket plating bestemt som konvertering av
14C-merket kolin til PCho. C) Fotografier av et representativt eksperiment av den myke agar-analysen. Totalt 10
5-celler ble sådd ut pr 60 mm skål, og antallet kolonier kvantifisert etter 5-8 ukers inkubering. D) og E) PC-basert automatisk kvantifisering av antall kolonier, middelverdier ± SEM er representert. Analysen ble utført 3 ganger med uavhengige triplikate prøver å skaffe lignende resultater. Statistisk signifikans (p≤0.05) er markert med en stjerne.
evne ChoKβ å indusere tumorvekst ble også undersøkt. Både ChoKα1- og ChoKβ-transfekterte HEK293T eller MDCK celler ble subkutant inokulert i atymiske mus. Som vist på fig. 4, overekspresjon av ChoKα1 var tilstrekkelig til å indusere tumorvekst i immunsvekkede mus i begge cellesystemer analysert. I motsetning til celler som overuttrykker ChoKβ var ikke i stand til å indusere svulstvekst under lignende betingelser. Som angitt ovenfor, er sammenlignet i tumorveksttakt mellom begge cellelinjer relatert til variert effektiviteten av transfeksjon, mye høyere i HEK293T (aproxm. 80-90%) enn MDCK (aproxm. 15-20%). Disse resultatene er i overensstemmelse med de som ble oppnådd i de myke agar-eksperimenter, og indikerer sterkt at overekspresjon av ChoKβ er ikke tilstrekkelig til å indusere svulstvekst under betingelser hvor ChoKα1 gjør.
xenografter ble etablert ved s.c. injeksjon av transfekterte HEK293T eller MDCK-celler i atymiske nu /nu nakne mus. A) og B) Western Blot-analyse av ektopisk ekspresjon av kolin kinase-isoformer i transfekterte HEK293T eller MDCK-celler, henholdsvis, før museinokulering. C) og D) Analyse av kolin kinase-aktivitet i ChoKα1 eller β1 transfekterte HEK293T eller MDCK-celler-frie ekstrakter før museinokulering. E) og F) Volum av svulster som genereres ved subkutan injeksjon av 10
6 transfekterte celler. Tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen:
Vol = [D * d
2] /2
, hvor D og d er større og mindre tumor diametere respektivt. Dataene fra HEK293T representerer middelverdier ± SEM fra to uavhengige eksperimenter (n
1 = 12; n
2 = 16), den MDCK forsøket samsvarer med et tilsvarende eksperiment med n = 12.
ChoKβ isoform viser fortrinnsrett EtnK aktivitet
in vivo
Vi neste undersøkt om det var noen forskjell i den enzymatiske aktiviteten til både Chok isoformer under
in vivo
forhold som kunne forklare deres differensial biologisk aktivitet. Således ble aktiviteten av ChoKα1 og ChoKβ som Chok og /eller EtnK i et hel-cellesystem testet. Intracellulære lipider av menneskelig HEK293T overekspresjon ChoKα1, ChoKβ eller transfektert med en tom vektor, ble hentet en analysert. Begge, ble den uløselige lipidfraksjonen inneholdende de hydrofobe lipider og totalt proteininnhold som brukes som laste kontroll oppnå lignende resultater. Som vist i figur 5A, ble de intracellulære phosphoethanolamine nivåene økt til en tilsvarende grad i ChoKα1- eller ChoKβ-transfekterte celler. Men de intracellulære nivåene av fosfokolin ChoKβ-transfekterte celler var ikke signifikant forskjellig fra kontrollceller, mens ChoKα1-transfekterte celler viste en økning i intracellulære nivåer PCho (figur 5B). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av epitelceller av forskjellig opprinnelse: human bryst adenokarsinomceller SK-BR-3 (Figur 5C, D.) Eller det humane, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje H1299 (figur 5E, F.). I tillegg, i alle cellelinjer analysert, protein-ekspresjon ble også bestemt ved Western blot-analyse (fig. 5G).
HEK293T, SK-BR-3 eller H1299-celler ble transfektert med eukaryote ekspresjonsvektorer for menneskelig ChoKα1 og ChoKβ1 gen eller pCDNA3b tom vektor anvendt som kontroll. A), C) og E) Intracellulær EtnK aktivitet av kolin kinase a1 og ß1 isoformer i hele celler i HEK293T, henholdsvis H1299 og SK-BR-3-celler. B), D) og F) Intracellulær Chok aktivitet ChoKα og ChoKβ isoformer i hele celler i HEK293T henholdsvis H1299 og SK-BR-3-celler. Mengden av
14C-PCho og
14C-PETN ble hentet ut og kvantifisert som beskrevet i materialer og metoder. Eksperimentet ble utført på triplikate prøver, gjentatt 3 ganger, og middelverdier ± SEM fra alle forsøkene estimeres. Statistisk signifikans (p≤0.05) er markert med en stjerne. En typisk radiomerking eksperimentresultatene i omtrent 70% av den radioaktive forbindelsen inkorporering i cellene. G) Representant Western Blot for ektopisk ChoKα1 eller ChoKβ1 uttrykk i hver cellelinje. Utgangsverdier valgt som ett-fold i grafene for hver cellelinje representerer: HEK293T celler (PCho: 1153 kpm; PETN: 1231 kpm); H1299 celler (PCho: 22821 kpm; PETN: 13339 kpm)., Og SK-BR-3-celler (PCho: 18620 cpm, PETN: 3151 kpm)
Dermed differensial enzymatisk aktivitet av ChoKα1 og ChoKβ funnet i HEK293T er ikke cellelinje bestemt. Disse resultater indikerer at ChoKα1 men ikke ChoKβ, er i stand til å indusere økte intracellulære nivåer av PCho under
in vivo
forhold. Imidlertid, under de samme betingelser begge enzymene er i stand til å generere phophorylethanolamine. Derfor, selv om ChoKβ viser både Chok og EtnK aktivitet under
in vitro
forhold, viser det fortrinnsrett EtnK aktivitet
in vivo
.
Økte nivåer av ChoKα mRNA men ikke ChoKβ i tumorcellelinjer utvunnet
for ytterligere å undersøke relevansen av hver Chok isoenzymet i tumorogenesis, vi fast bestemt på nivåene av både ChoKα og ChoKβ mRNA i et panel av humane tumorcellelinjer utvunnet av kvantitativ PCR-teknologi . Et panel av bryst og lunge cancercellelinjer ble sammenlignet med den primære, senescent, ikke-tumorcellelinje HMEC (human bryst Epitelceller) eller udødeliggjort, ikke-tumorogene MCF10A celler som kontroll brystcellelinjer og primære Bronchial Epitelceller ( BEC) som kontroll lunge cellelinje. Alle tumorcellelinjer testet betydelig overuttrykker ChoKα mRNA sammenlignet med normale cellelinjer, mens ingen endringer ble funnet for ChoKβ mRNA nivåer (Fig. 6). Disse resultater indikerer at ChoKβ ikke er spesielt oppregulert i bryst eller lungekreftceller, noe som tyder på at høye nivåer av ChoKβ ikke er nødvendig for å fremme kreft.
Q-PCR ble utført for å bestemme nivået av ekspresjon av mRNA i ikke-tumorogene brystcellelinjer (HMEC, MCF10A), brystkreftcellelinjer (MDA-MB435, MDA-MB468, T47D, MCF7), ikke-tumorogene lungeceller (BEC) og lungecancer cellelinjer (H510, H82). Dataene ble normalisert med den endogene 18S ribosomalt RNA. For sammenligningen mellom tumor og ikke-tumorcellelinjer ble to
-ΔΔCt metoden anvendt og logge
10 RQ er representert. Merk at data henvises til den human bryst Epitelceller (HMEC) mRNA-nivåer i brystcellelinjer, og ingen signifikant forskjell i nivået av både Chok isoformene mRNA ble funnet med den normale MCF10A cellelinje. Referansen for lungekreft celler var de primære Bronkial Epitelceller (BEC).
MN58b er en spesifikk hemmer av ChoKα isoform
Implikasjonen av ChoKα i menneskets kreft har blitt brukt til utforming av spesifikke inhibitorer for dette enzymet som et nytt anticancer-strategi [2], [14], [37]. MN58b er den ledende sammensatt for å støtte denne romanen strategi siden det har vist en potent antitumor aktivitet under
in vivo
forhold versus menneskelige kolon, lunge, bryst og blære tumormodeller [15], [37].
Den primære strukturen til pattedyr-ChoKβ viser et samlet 60% homologi med den til ChoKα1 [1]. Jo høyere grad av homologi ligger innenfor cholin /etanolamin kinase domene. Denne homologi kan gjøre det utsatt for en tilsvarende inhibering av både ChoKα1 og ChoKβ med de samme inhibitorer. Dermed har vi undersøkt spesifisiteten av MN58b mot disse to Chok isoenzymer for å verifisere om dens antitumor virkning er spesielt relatert til hemming av a-isoformen, som er den ene involvert i tumorprogresjon, eller medikamentet på lignende måte påvirker begge isoformer. Ved hjelp av den menneskelige ChoKα1 og ChoKβ rekombinante proteiner, utførte vi en
in vitro
Chok aktivitet hemming analyse ved bruk av økende MN58b konsentrasjoner, bestemme IC
50 for hvert enzym. Som forventet, til tross for den høye likheten vises mellom Chok isoformer, MN58b viste en mye høyere spesifisitet mot ChoKα1 (IC
50 = 5 uM) enn mot ChoKβ (IC
50 = 107,5 uM). Dermed er 21,5 ganger mer potent mot ChoKα1 enn ChoKβ isoform MN58b.
Diskusjoner
Familien av menneskelige choline /etanol kinaser består av to gener,
CHKA Hotell og
CHKB Hotell som kodifisere for tre enzymer, ChoKα1 (52 kDa), ChoKα2 (50 kDa) og ChoKβ1 (45 kDa). ChoKα1 og ChoKα2 er nesten identiske, bortsett fra en strekning av 18 ekstra aminosyrer i ChoKα1, da de er et resultat av forskjellig spleising av det samme gen,
CHKA
. Selv om innblanding av ChoKα1 i regulering av cellevekst og kreft har blitt grundig demonstrert [13], [15], [27], [28], [37], [38], [44], foreløpige bevis tyder på at ChoKβ kan ikke være involvert i kreftutvikling, siden det ikke er overuttrykt i brystkreft cellelinjer [21] eller i TRAMP mus prostatakreft modell [31].
En distinkt menneskelig gen familien har blitt beskrevet som codifies for EtnK aktivitet [45], som tyder på at EtnK1 er den viktigste enzym involvert i PE homeostase. Den Chok /EtnK domene overfører til ChoKα og ChoKβ evnen til å fungere som både Chok og EtnK aktivitet etter cellefrie forhold [1], [3] – [5], men det er fortsatt ukjent om disse tidligere karakteriserte enzymer viste noen selektivitet til hver gren av Kennedy veien i
de novo
syntese av PC eller PE. Det har nylig blitt beskrevet forskjellig spesifisitet mot Cho og ETN av de to isoformer av Cho /EtnK av
Tripanosoma brucei
. Mens
Tb
Cho /Etn1 viser bare EtnK aktivitet,
Tb
Cho /Etn2 viser både Chok og EtnK aktiviteter
in vitro product: [46]. Disse resultatene er i tråd med det som er beskrevet for muse EtnK1 som er ETN spesifikke og EtnK2 som viser et dobbelt Chok /EtnK funksjon [45], [47]. På den annen side, mens murine Pcyt1α og Pcyt1β er involvert i PC biosyntese, er Pcyt2 fokusert til PE bare [48].
Men det er ennå ikke fullt ut forstått hvilke Chok isoform, om noen, bidrar
in vivo
i hver vei for å opprettholde normal homeostase av både PC og PE i biologiske membraner. Resultatene som er vist her bekreftet at begge enzymer har evne til å fosforylere cholin og etanolamin i henhold til cellefrie betingelser, enten som rekombinante proteiner produsert i
E. coli
, eller i celleekstrakter fra pattedyrceller. Men vi fant at under hele celle forhold ChoKα1 har evnen til å fungere som både Chok og EtnK, men ChoKβ påvirker bare produksjon av PETN. Disse funnene av ulike roller for a og p isoformer er i tråd med informasjonen fra den nylig genererte Knock Out (KO) mus for ChoKα og ChoKβ gener [49], [50]. Dermed ChoKβ KO mus (
RMD
mus) er levedyktig, men utvikle en rostrocaudal muskeldystrofi, mens normale PC lipid nivåer er funnet i de fleste vev analysert unntatt i bakben skjelettmuskulatur [49]. Derfor er ChoKα tilstrekkelig til å opprettholde normale PC-nivåene i de fleste vev. I motsetning til mangelen på ChoKα resulterer i embryonale dødelighet, og ChoKα
+/- heterozygot mus viser en opphopning av Cho og en reduksjon i PCho i leveren og testis, noe som tyder på at det ikke er noen ChoKβ kompensasjon for PC-biosyntese
in vivo
. Disse resultatene tyder ulike roller
in vivo
for både ChoKα og ChoKβ isoformer. Videre er de svekkede nivåer i PE som finnes i ChoKα
+/- heterozygot mus tyder på involvering av ChoKα ikke bare i biosyntesen av PC, men også i den PE-reaksjonsveien. Dette er også i tråd med det faktum at i ChoKβ KO mus, PE nivåer er upåvirket, noe som indikerer at PE homeostase er fullt opprettholdes med EtnK1 og ChoKα proteiner intakte.
Gruppen av Ishidate har gitt verdifull informasjon om
in vitro
aktivitet av Chok fra forskjellige musevev, og de har postulert at den mest aktive form for kolin kinase-aktivitet er den α /α homodimer fulgt av α /p-heterodimerer, blir den β /β homodimer den minst aktive formen [8].
in vivo
resultatene som vises her er delvis i tråd med denne hypotesen.
in vivo
aktivitet ChoKβ er fokusert i PE biosyntese og viser høyere Km for kolin enn ChoKα, kan dette være grunnen til at beta /β dimers viser lav Chok aktivitet. Når ChoKβ ble overuttrykt det observert en økning i de intracellulære nivåene av PETN, men ikke av PCho. Men ingen forskjeller ble funnet mellom de to isoformene for generering av PETN, siden begge vise lignende EtnK aktivitet.
PCho har vært foreslått for å fremme mitogenese i pattedyrceller [12]. I tråd med dette har magnetisk resonans spektroskopiteknikker viste høyere nivåer av phosphomonoesthers i tumorprøver i forhold til deres normale motstykker [19] – [24]. Videre overekspresjon av ChoKα1 er onkogent [15], og forbedret ChoKα aktivitet er en hyppig funksjon i tumorprøvene sammenlignet med normalt vev [27], [28]. Til sammen alle disse resultatene indikerer sterkt at ChoKα1 aktivitet og PCho nivåer har en sterk innblanding i kreft. Videre er overekspresjon av ChoKα1 resulterer i en økning i EtnK aktivitet og PETN nivåer. Men den sistnevnte effekt i seg selv ikke er tilstrekkelig til å indusere celletransformasjon, siden overekspresjon av ChoKβ induserer ikke forbedret kolonidannelse i myk agar eller tumorvekst i nakne mus. Disse resultatene er i overensstemmelse med hypotesen om at det er produksjonen av PCho det som er knyttet til celle-proliferasjon og transformasjon mediert av Chok, og at produksjonen av PETN ikke være tilstrekkelig, eller relevante i denne prosessen.
Ovennevnte resultatene tyder på at de to Chok isoformer undersøkt, i tillegg til deres likhet i deres primære sekvenser, er implisert i forskjellige metabolske veier. Dermed mens ChoKα1 støter inn i både PC og PE-syntese, påvirker ChoKβ bare PE syntese. Videre synes transformasjon kapasitet til å være eksklusivt til ChoKα isoform. Men siden i menneske HEK293T, Sk-Br-3 og H1299 cellelinjer, ChoKα1 overekspresjon produserer høye nivåer av både PCho og PETN, mens tilsvar ChoKβ overekspresjon resultater bare i høyere nivåer av PETN men normale nivåer av PCho, kan vi ikke utelukke muligheten for at cellen transformasjon krever både Chok og EtnK aktiviteter.
i tråd med ideen som linker onkogene aktiviteten til funksjonen av ChoKα, men ikke ChoKβ, den antiproliferative og antitumoraktivitet av MN58b ble bare knyttet til aktiviteten av ChoKα. Videre, som tidligere rapportert,
in vivo
behandling med MN58b resulterer i en bestemt reduksjon av PCho nivåer i svulstene, men ingen signifikant effekt på nivåene av PETN [51]. Tidligere resultater fra vår gruppe har vist at MN58b hemmer også kolin transport [38]. Men denne virkning har en liten innflytelse på den antiproliferative og antitumoraktivitet av legemiddel siden HC-3, et mye mer potent inhibitor av kolin transportører, er langt mindre potent som et antiproliferativt middel enn MN58b [2]. Videre har MN58b en differensiell effekt på enten normale eller tumorceller, en demonstrasjon av en differensiell aktivitet på grunn av Chok hemming [38] – [40]. Disse resultatene er også i overensstemmelse med den observasjon at ChoKα men ikke ChoKβ er en nedstrøms mål for onkogene molekyler slik som Ras og RhoA. Således, mens Ras aktiverer ChoKα gjennom Ral-GDS og PI3K [29], og RhoA aktiverer ChoKα gjennom ROCK [15], ingen av disse onkogene GTPases påvirke ChoKβ aktivitet under lignende betingelser. Igjen, disse resultatene indikerer at selv om begge Chok enzymene er i stand til å fosforylere både cholin og etanolamin i henhold til cellefrie systemer betingelser, vise de forskjellige affiniteter for slike substrater, og i hel-celleanalyser betingelser de styres av forskjellige regulatoriske reaksjonsveier.
til slutt, involvering av ChoKβ i bryst- og lungekreft har blitt studert, ChoKα og p mRNA nivåer ble bestemt av Q-PCR. Alle kreftcellelinjer utvunnet analysert betydelig overuttrykker ChoKα mRNA, mens ingen endringer ble funnet i uttrykket av ChoKβ. Lignende resultater har nylig blitt rapportert, ved hjelp av semi-kvantitativ PCR i brystkreftcellelinjer [21].
