Abstract
stamceller fra fettvev (ADSCs) er en viktig kilde til celler for regenerativ medisin. Den terapeutiske effekten av kultur-ekspandert adipose avledede stamceller har vist seg; Men optimale Xeno-fri kultur forholdene fortsatt ikke bestemt. Kreftpasienter, spesielt de som gjennomgår invasiv kirurgi, utgjør en undergruppe av pasienter som kan ha nytte autolog stamcelletransplantasjon. Selv regenerativ potensialet i sine ADSCs kan bli rammet av sykdom og /eller behandling, er vi ikke klar over noen studie som har evaluert den terapeutiske potensialet i ADSCs isolert fra kreftpasienter i referanse til at av ADSCs avledet fra friske personer. Her rapporterer vi at ADSCs isolert fra subabdominal fettvev av pasienter med urologiske svulster ga lignende vekstkinetikk, presenteres tilsvar mesenchymale overflatemarkører og viste lignende differensiering potensial inn i forskjellige mesodermal celle linjene: adipocytter, kondroblaster og osteoblaster enn ADSCs isolert fra fettvev av alders- matchet ikke-onkogene deltakere, alle under Xeno-free vekst dyrkningsforhold. Molekylær karyotypering av pasient utvidet ADSCs genomer viste ingen sykdomsrelaterte endringer som indikerer deres sikkerhet. I tillegg, vesikler 100 nm, identifisert som exosomes (Exos) som kan være i det minste delvis ansvarlig for de tilskrives terapeutiske parakrine effekter av ADSCs var effektivt isolert fra ADSCs og viste tilsvarende miRNA innhold uansett de var avledet fra kreftpasienter eller ikke- onkogene deltakere tyder på at reparasjons mulighetene Xeno-free utvidede ADSCs ikke blir kompromittert av pasientens tilstand og derfor deres xeno-fri kultur utvidede ADSCs bør være egnet for autolog stamcelletransplantasjon i en klinisk setting
Citation. García -Contreras M, Vera-Donoso CD, Hernández-Andreu JM, García-Verdugo JM, Oltra E (2014) Terapeutisk Potential of human adipose-avledet stamceller (ADSCs) fra kreftpasienter: en pilotstudie. PLoS ONE 9 (11): e113288. doi: 10,1371 /journal.pone.0113288
Redaktør: Carlos Eduardo Ambrósio, Fakultet for Animal Sciences og mat Engineering, University of São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil, Brasil
mottatt: April 11, 2014; Godkjent: 21 oktober 2014; Publisert: 20.11.2014
Copyright: © 2014 García-Contreras et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Generalitat Valenciana (gir AP-014-10 og AP-222-11 til JMHA), Universidad Católica de Valencia » San Vicente Mártir «(tilskudd 2012-006-010 til JMHA) (tilskudd 2011-011-02, 2011-011-04 og 2012-011-008 til EO), og AITEX Institute of Technology (tilskudd 2011-011-015 til EO). MGC har mottatt et fellesskap fra Universidad Católica de Valencia «San Vicente Mártir». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne har erklært noen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Menneskelig fettvev er et rikt og tilgjengelig kilde til multipotente stamceller (MSC) som holder et stort potensial for terapeutiske anvendelser i regenerativ medisin og tissue engineering [1] – [3]. MSC har vist seg å være i stand til å differensiere til flere celletyper fra mesodermal avstamning (osteoblaster, kondrocytter og adipocytter), men også i ikke-mesodermal avstamning celler (neuroner, kardiomyocytter og ectodermal hud) [4] – [7], redusere betennelse i skadet vev, stimulere angiogenese og redusere apoptose [8] – [11]. MSC rolle i modulering av vev reparasjon og immunmodulering har blitt tilskrevet deres parakrin faktor sekresjon potensial, mitokondrie overføring og exosome (EXO) sekresjon kapasitet [12] – [14]. Exos skilles bilipid membranvesikler av ~50-100 nm med en kompleks last som er lett internalisert av målceller indusere varierte fysiologiske effekter [15] – [17]
Oppdaterte ulike metoder for isolering og ekspansjon. av MSC har blitt påført. Mest inkluderer animalske produkter som føtalt bovint serum, som er en kilde for kontaminerende virus, bakterier, mykoplasma, prioner og andre patogene eller toksiske midler, og av xenogene antigenene som kan tipp uønskede immunresponser [18], [19]. Xeno fritt kultur kunne øke sikkerheten og kvaliteten av transplanterte
in vitro
-Utvidet stamceller [20], [21], og gir mulighet for etablering av standard ekspansjonsmetoder, unngå batch-til-batch-forskjeller. Men deres nyhet og den store forskjellen i pris begrense antall studier som har brukt xeno fritt medium før nå.
Selv om allogen infusjon av
in vitro
utvidet MSC virker som en lovende alternativ for visse formål [22] – [25] de fleste av de pågående eller fullførte kliniske studier på opp til dags dato er basert på autologe behandlinger [26]. I denne forstand kan høy alder og sykdomstilstand begrense individers valg, spesielt siden antallet og regenerativ potensialet i MSC synes å negativt korrelert med alder [27], [28] og aldringen av befolkningen er i økning.
Urologisk kreftpasienter er gode kandidater for stamcellebaserte behandlingsformer. Stamcelle terapi rettet for å fremme helbredelse etter invasiv kirurgi prosedyrer de ofte gjennomgår eller utformet for å redusere urininkontinens, kan en vanlig sekundær problem forbundet til prostatektomi føre til nytte for dem. Også,
in vitro
utvidede autologe MSC kunne brukes til programmerte organ ombygging operasjoner eller til og med komplett organ engineering for transplantasjon. Men vi er ikke kjent med studien fokusert på evaluering av terapeutiske potensialet og sikkerhet for urologiske kreft MSC for autolog transplantasjon.
Her utførte vi en komparativ analyse av MSC hentet fra magefett av urologiske kreftpasienter og ikke-onkogene deltakerne utvidet
in vitro
henhold Xeno frie forhold i et forsøk på å fastslå deres egnethet for autologe cellebasert terapi bruker optimale forhold for klinikken. Karakterisering inkludert klynge av differensiering (CD) uttrykk mønstre og morfologi, vekstkinetikk, plastisitet, Exos utgivelsen som et mål på MSC parakrint terapeutisk potensial og sikkerhet.
Materialer og metoder
Prøvetaking og etikk uttalelse
Denne studien ble igangsatt ved godkjenning av den lokale etikkomiteen Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valencia, Spania). Fersk skåret abdominal fettvevet ble samlet inn fra pasienter som gjennomgår neoplasic urologisk kirurgi eller fra ikke-onkogene deltakerne etter den tilsvarende informert samtykke ble signert.
Fag
Alle prøver ble avfall som samles inn som en side -produkt for kirurgi, fra kreftpasienter (n = 5) som gjennomgår elektiv kirurgi mageplastikk prosedyrer ved Institutt for Urologi, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, (Valencia, Spania) eller ikke-onkogene alderstilpassede (± 5 y) deltakere ( n = 2) med en tilsvarende etnisk bakgrunn (tabell 1). Non-onkogene deltakerne samsvarer med multiorgandonorer. For alle de beskrevne prosedyrer ADSCs fra både onkologiske og ikke-onkologiske pasienter, som henholdsvis test- og kontrollprøver ble innhentet og analysert, med mindre annet er angitt.
Isolering av ADSCs
Isolering av ADSCs ble utført ved anvendelse av en mekanisk og enzymatisk metode. Fettvev ble transportert og vasket med saltløsning NaCl 0,9% (B. Braun, kat. 12606097), fragmentert med en kirurgisk kniv og spaltet med 1 mg /ml type I-kollagenase (Life Technologies, kat. 17100-017), i 2 timer ved 37 ° C med risting. Det fordøyde vevet ble filtrert gjennom gasbind for å skille det fra ufordøyd vev og sentrifugert ved 500 g i 7 minutter ved romtemperatur (RT). Supernatanten (flytende adipocytter) ble kastet. Pelleten (ADSC fraksjon) ble resuspendert i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS + Ca + Mg) (Gibco, kat. 14025092) + 1% BSA (Sigma, kat. A2153), filtrert gjennom en 140 pm nylonnett og sentrifugert ved 500 g i 7 min ved RT. Cellene ble deretter resuspendert i erytrocytt-lyseringsbuffer på is i løpet av 10 min og sentrifugert igjen ved 500 g i 7 min ved 4 ° C. De isolerte celler ble deretter sådd ut og ekspandert i dyrkingsmedium. Kulturmediet var MesenCult-xf Medium (Stemcell teknologier, Cat. 05420) supplert med 1% (volum /volum) penicillin /streptomycin (10 000 U /ml penicillin, 10 000 pg /ml streptomycin, Gibco cat.15140-122), og 2 mM L-glutamin (Gibco, katt. 25030-081).
in vitro
utvidelse og prøvetaking av ADSCs
ADSCs ble dyrket ved 37 ° C i en 5 % CO
2 luft atmosfære med medium endres hver 3 dager. Når cellene nådde omtrent 80% konfluens, subkultur (passasje) ble utført ved dekomponering hjelp av MesenCult-ACF Dissosiasjon Kit (Stemcell teknologier, Cat. 05426) (6 ml /kolbe) i 5 minutter, etter en vask i fosfatbuffer saltvann (PBS ). Cellene ble tellet og re-belagt i en kultur T-75 kolbe ved en tetthet på 250.000 celler. Den dissosiasjon Oppløsningen ble nøytralisert ved bruk av det samme volum av MesenCult-ACF Enzyme Inhibition Solution (Stemcell teknologier, Cat. 05428). Cellesuspensjonene ble sentrifugert (500 g, 7 min), og supernatantene kastes. Pelletene ble resuspendert i fullstendig medium ved den angitte tetthet. Regnet ble gjort i en Neubauer kammer ved hjelp av trypanblått eksklusjon test for levende celler (Sigma Aldrich, katt. T8154). Før hver passering, kulturer var foto-dokumentert. Populasjonsdoblinger (PD) ble beregnet ved hjelp av formelen
x
= [log
10 (NH) – log
10 (NI)] /log
10 (2), hvor NH er celle høsting nummer og NI inokulert nummer som tidligere beskrevet [29]. For å oppnå den kumulative populasjonen dobling, ble populasjonen dobles for hver passasje beregnet og deretter tilsatt til den foregående passasje populasjonen dobling nummer. Celler ble deretter utsatt for ytterligere analyser, inkludert ultra morfologi, differensiering potensial, alderdom og epitop analyse. Noen prøver ble pelletert og lagret i -80 ° C for RNA isolering.
Flowcytometri
Om 0,5-1 x 10
6 celler ble merket med følgende fluorescensmerket anti human antistoffer: CD73, CD90, CD105, CD34, CD11b, HLA ABC og HLA-DR (Tabell 2) og analysert i ulike kombinasjoner. Oppsummert cellene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur og beskyttes mot lys, vasket (3X) med PBS sentrifugering ved 500 g ved 4 ° C i 7 min. Vaskede celler ble resuspendert i 1 ml PBS. Merkede prøver ble analysert ved flow fluorescens aktivert celle sortering analyse (FACS) (Beckman Coulter Cytomics, FC 500) på de spesifikke fluorescens kanaler for hver fluorochrome. Tomter ble generert ved hjelp av CXP analyseprogramvare (Beckman Coulter).
Adipogenic differensiering
For adipogenic differensiering, celler ble dyrket i 6-brønners plater som inneholder 2 ml Mesencult-XF basal medium supplert med adipogenic stimulerende kosttilskudd (MesenCult Adipogenic stimulerende kosttilskudd (human), katt. 05403) for 15 dager, under standard vekstforhold (37 ° C, 5% CO
2). Kulturmediene ble ikke endret med mindre medium ble gul /orange farge, i hvilket tilfelle en halv-medium endringen ble utført. Etter at den 15-dagers inkuberingsperiode, ble mediet fjernet og cellene ble vasket i PBS. Fiksering med 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 min ble etterfulgt av to vaskinger i destillert vann og en 60% isopropanol, hver i 5 min ved RT. Adipogenic differensiering ble bekreftet av Oil Red O farging (Sigma, katt. O0625) etter produsentens anvisninger. I korte trekk ble celler inkubert med Oil Red O fargestoff ved RT i 10 min i 2 ml. Fargestoff ble forsiktig fjernet og platen ble vasket fire ganger med destillert vann. Deretter ble cellene observert ved anvendelse av et optisk mikroskop (Nikon Eclipse TE2000-U lys invertert mikroskop, Nikon Inc., Melville, NY, USA) og fotografert. Adipocytter ble identifisert som celler med rød-farget lipidvesikler [4], [20], [30].
osteogene differensiering
Cellene ble dyrket i seks brønners plater som inneholder 2 ml MesenCult MSC basal Medium (human) (Stemcell teknologier, katt. 05401) supplert med osteogene stimulerende Supplement (Stemcell teknologier, katt. 05405), p-Glycerophosphate 1M (Stemcell teknologier, katt. 05406), deksametason (Stemcell teknologier, katt. 05407) og askorbinsyre (Stemcell teknologier, cat. 07157) i 15 dager (osteogene medium). Platene ble oppbevart i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 og dyrkningsmediet ble skiftet hver tredje dag. Etter at den 15-dagers perioden, ble mediet fjernet og cellene ble vasket med PBS. Etter fiksering av cellene med PFA 4%, i 30 minutter ble cellene vasket tre ganger med destillert vann. Alizarin-rødt S farging (Sigma, kat. A5533) ble anvendt for å bekrefte osteogen differensiering ved bruk av produsentens protokoll. Kort fortalt ble cellene inkubert i 2 ml oppløsning av natrium-alizarin ved RT i 30 min. Fargestoffet ble forsiktig fjernet og grundig vasking med destillert vann fulgt. De faste og farget celler ble observert ved hjelp av optisk mikroskop (Nikon Eclipse TE2000-U invertert mikroskop, Nikon Inc, Melville, NY, USA) og fotograferte [20], [30].
Chondrogenic differensiering
chondrogenic differensiering, ble cellene dyrket i seks-brønners plater inneholdende 2 ml fullstendig medium supplementert med StemPro Chondrogenesis differensiering Kit (Gibco, kat. A10071-01) i 15 dager. Platene ble oppbevart i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 og dyrkningsmediet ble skiftet hver tredje dag. Etter at den 15-dagers perioden, ble differensiering mediet fjernet og cellene ble vasket med PBS. Deretter, fiksert med 2% glutaraldehyd i 20 minutter og vasket tre ganger med PBS. Cellene ble deretter inkubert i Alcian blått 8GX oppløsning (Acros organiske stoffer, kat. 400,460,100) over natten ved RT. Fargestoffet ble forsiktig fjernet og platen ble vasket tre ganger med 0,1 M HCl og to ganger med PBS. Etter fiksering og farging ble cellene observert ved anvendelse av et optisk mikroskop (Nikon Eclipse TE2000-U invertert mikroskop, Nikon Inc., Melville, NY, USA) og fotografert [4], [20], [30].
senescens forbindelse β-galaktosidase-farging
pH-avhengig senescens forbindelse med β-galaktosidase-aktivitet ble analysert ved hjelp av SA-β-gal-farging sett (Cell Signaling Technology, kat. 9860) i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble celler inkubert i nyfremstilt senescens-assosiert β-galaktosidase blå flekk oppløsning (X-gal) over natten ved 37 ° C. På de neste morgen celler ble observert og bilder tatt under en invertert lysmikroskop Nikon Eclipse TE2000-U (Nikon Inc, Melville, NY, USA).
RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler med Mirvana miRNA isolasjon Kit (Ambion, katt. AM1560) i henhold til produsentens protokoll. RNA utbytter og renhet ble bestemt av 260/280 og 260/230 nm forhold med en Thermo Scientific Nanodrop ND-2000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA). cDNA ble fremstilt ved anvendelse av 100-200 ng av total RNA og M-MuLV revers transkriptase (New England Biolabs, kat. EP0352) ved oligo-dT-priming. CDNA ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av ABI GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Eimer, Applied Biosystems, Boston, MA) og de følgende sykkel betingelser: 94 ° C i 30 sek, 54-60 ° C (avhengig av primer Tm) 30 s og 72 ° C i 30 sekunder (35 sykluser), etter en enkelt innledende denaturering syklus ved 94 ° C i 5 min. PCR primersett er vist i tabell 3. PCR-produktene ble separert på en 2% agarosegel og visualisert med realsafe flekk.
QRT-PCR
Total RNA ble isolert fra ADSCs og Exosomes med Mirvana miRNA isolasjon Kit (Ambion, katt. AM1560) ved hjelp av produsentens protokoll. Reverse-transkripsjon ble utført ved hjelp miScript II RT Kit (Qiagen, katt. 218 161) i henhold til produsentens retningslinjer. cDNA ble brukt for Real time PCR ved hjelp miScript SYBR Grønn PCR kit (Qiagen, katt. 218073). Sekvensene av termin primere som brukes er vist i tabell 4.
Exosome isolasjon
Exos ble renset fra Xeno-free cellekultursupernatanter av adipose avledet stamceller av ultrasentrifugering. Liggende fraksjoner samlet opp fra ADSC kulturer ble sentrifugert ved 300 g i 10 min, 2000 g i 20 min og 10 000 g i 20 minutter for å fjerne store døde celler og rester. Etter, filtrering gjennom 0,22-mikrometer filter for å fjerne urenheter, ble den endelige supernatant ultrasentrifugert på 110 000 g for 70 min til pellet Exos. Gjenvunne Exos ble vasket med PBS og igjen sentrifugert ved 110.000 g i 70 min. Pelleten ble resuspendert i 50 ul PBS for å oppnå en konsentrert fraksjon EXO.
Western blot-analyse
ADSCs og Exos ble lysert i Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) (Thermo Scientific, katt. 78510) etter produsentens anbefalinger. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved Bradford-metoden (Thermo Scientific Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay, kat. PI-23200). Prøvene ble blandet med ikke-reduserende Tris-glycin-SDS-prøvebuffer, deretter oppvarmet 95 ° C i 5 minutter og applisert på en 10% SDS-polyakrylamidgel. Gelen ble kjørt under denaturerende betingelser ved 80 V i 2 timer og deretter overført til en PVDF-membran (GE Healthcare Life Sciences, kat. 0.485.288). Etter overføringen ble membranene blokkert i 3% ikke-fettholdig melk PBS i 2 timer og inkubert ved romtemperatur i 2 timer med kanin-anti CD63 (Abgent, kat. AP5333b). Etter vasking i PBS-T, ble membranene inkubert i 1 time med geit-anti-kanin HRP-koblet sekundært antistoff (Santacruz, kat. Sc-2004) og utviklet med Luminata Forte Western HRP-substrat (Millipore, cat. WBLUF0500) under anvendelse av en Imagequant LAS 4000 kjemiluminescering detektorsystemet.
elektron~~POS=TRUNC mikros~~POS=TRUNC
for ultra analyse,-celler ble dyrket på dekkglass (8 permanox vel kammer lysbilder) ved en tetthet på 3,5 x 10
3-celler /kammer. Chambers ble oppbevart i en fuktet inkubator (37 ° C, 5% CO
2) ble, og kulturmediet skiftet hver tredje dag inntil sub konfluens. Cellene ble deretter vasket tre ganger med nyfremstilt medium, en gang med PBS og deretter fiksert med 3,5% glutaraldehyd i 30 minutter ved 37 ° C. Fiksativ oppløsning ble fjernet og cellene ble vasket to ganger med PBS. Celler ble postfiksert i 2% OsO
4 i 30 minutter ved romtemperatur og farget i 2% uranylacetat i mørke i 1 time ved 4 ° C. Til slutt ble cellene dehydrert i etanol, renset med propylenoksyd (Lab Baker, Deventry, Holland) og innleiret over natten i Araldite (Durcupan, Fluka, Buchs SG, Sveits). Ved polymerisering, ble innebygde kulturer løsrevet fra kammeret lysbildet og limt (Superlim, Loctite) til Araldite blokker. Semi-tynne snitt (1,5 mikrometer) ble kuttet med en ultramicrotome (ULTRACUT UC-6, Leica, Heidelberg, Tyskland) montert på lysbilder og farget med 1% toloudine blå. Ultratynne seksjoner (70 nm) ble utarbeidet med ultramicrotome og farget med bly citrate. Bilder ble oppnådd med en transmisjonselektronmikroskop (FEI Tecnai Spirit G2, Eindhoven, Nederland), ved hjelp av et digitalt kamera (Morada, Soft Imaging System, Olympus).
Purified Exos ble fiksert med 1% glutaraldehyd i PBS . Etter skylling, ble en 20 ul dråpe av suspensjonen fylt på en formvar /karbon-belagt gitter, negativt farget med 3% (w /v) vandig fosfowolframsyre i 1 minutt, og observert ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) på en Tecnai Spirit G-2 apparat; (FEI, Eindhoven, Nederland).
Molecular karyotype
Affymetrix CytoScan750 matriser ble brukt for å evaluere kopitall gevinster og tap av heterozygositet (LOH) i ADSCs prøver av pasienter og ikke-onkogene deltakere . Disse arrays inneholder mer enn 2,6 millioner kopier antall markører som 750.000 er «genotype-stand» SNPs og 1,9 millioner er ikke-polymorfe prober. DNA ble ekstrahert fra ADSCs for hver av de to onkologiske pasientprøver ble analysert ved anvendelse av en DNA-QIAamp Mini Kit (Qiagen, kat. 51 306), å følge produsentens instruksjoner. DNA kvantitet og kvalitet ble målt med spektrofotometer Nanodrop ND-2000 (Thermo Scientific) ved absorbans forholdstall på 260/280 nm. Integriteten av total DNA ble målt ved hjelp av 0,8% agarosegelelektroforese. Kopier nummer og genotyping analysene ble utført ved hjelp av Affymetrix kromosomanalyse Suite (Chas) programvare på Array Service, Genomisk Unit IIS La Fe.
Statistisk analyse
Data ble analysert av uparet 2-tailed elevens
t
test eller Multiple t test, som angitt. Den Holm-Sidak metode korreksjon ble anvendt for å bestemme signifikans av forskjeller i multiple sammenligninger. Data tilsvarte middelverdier ± SD av minst tre uavhengige replikater. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA); verdier med
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Befolkning og celleutbytte
Pasientens gjennomsnittsalderen var 60, varierer mellom 38 og 72 år, (n = 5), og ikke-onkogene deltakere gjennomsnittsalder var 59, range 41-77, (n = 2) (tabell 1). Pasienter led av nyre, blære eller prostata kreft og friskt vev kom fra donorer som led utilsiktet traumatisk død.
Gjennomsnittlig adipose-avledet stamcelle utbyttet etter innledende ekspansjon var (2,28 ± 4,62) × 10
5 og (3,10 ± 5,4) × 10
5 celler per gram vev fra enten pasienten eller ikke-onkogene deltakere, henholdsvis. Rentene var svært variabel med en tendens til å få lavere avkastning fra større biter av vev (tabell 1).
Vekstpotensial og senescence
For å undersøke cellevekstpotensial av celler fra enten gruppe deltakere, populasjonsdoblinger (PD) av hver prøve ble bestemt ved hver passasje opp til passasjen 6, tilsvarende til dag 58 i kultur i gjennomsnitt (figur 1). Forskjellen mellom pasienter (6,292 ± 1.394) og donor (4,869 ± 1,801) PD var ikke signifikant (p 0,5), som bestemmes av uparet t-test analyse av data. Semi-samløpet ved passering en variert om 3,6 ± 1,2 PD for pasienter og 2,02 ± 1,7 PD for ikke-onkogene deltakere (figur 1), som sammenfaller med tidligere rapporter [31] -. [33]
Resultatene er presentert som kumulative fylle doblinger av ADSCs avledet fra fem forskjellige kreftpasienter og to ikke-tumorigene deltakere (donorer) i henhold Xeno fritt dyrkningsforhold. Celle tall ble bestemt ved slutten av hver passasje og kumulative populasjonsdoblinger ble beregnet som beskrevet i materialer og metoder.
Selv om det ikke er observert unormal vekst oppførselen til kreftpasient ADSCs, var det viktig å finne ut om disse cellene kunne presentere vekst fordeler på lengre kultur perioder. For å evaluere ekspansjons-tids-relaterte cellealdring, to av de analyserte prøvene, svarende til pasientene 1 og 2 ble ytterligere dyrket til sen passasjer, spesielt opp til henholdsvis passasjen 10 og 8. Vekst etter passasje 10 i kulturen ikke lenger var eksponensiell (figur 1) som indikerer en begrenset utvidelse potensial under de vekstbetingelser som benyttes. Senescens ble bestemt ved forandringer i β-galaktosidase aktivitet av tidlige
vs
sene passasjer. Som vist i fig S1, økt β-galaktosidase-aktivitet med passasjen. De fleste av cellene i tidlige passasjer ikke til stede bevis for behandling av det kromogene substratet X-gal som celler fra senere passasjer gjorde. Denne økningen i β-gal farging mellom tidlige og sene passasjer (0,0390 ± 0,0046 vs 0,1717 ± 0.0181) var signifikant (p 0,005). Dette tyder på at den replikative senescens av MSC er en kontinuerlig tidsavhengig prosess som tidligere er foreslått [31], også for ADSCs oppnådd fra cancerpasienter.
I tillegg, vurderte vi senescens-assosierte fremgangs autophagy ved RT -PCR analyse av autofagi relaterte gener. På slutten av passasjer (passasjer 8-10) mRNA uttrykk nivåer av Atg5 dukket oppregulert (1,61 ± 0,04 ganger) mens Atg7 ble litt hemmet (-1,10 ± 0,03 ganger) og Beclin1 nivåer viste en markert downregulation (-10,80 ± 0,03) (Figur S1 C). Den observerte stor opphopning av autophagosomes, på disse sene passasjer, dokumentert av ultraestructural analyse av sine cytoplasms (figur S1 D, E) falt sammen med en reduksjon i vekstraten som tyder på at økningen i autofagi på sen passasjer forbinder med replicative senescence, som tidligere rapportert [34] – [36]. Det faktum at ADSCs fra pasienter senesce på kultur indikerer at de er ikke tumorigen.
morfologi
For å undersøke mulige morfologiske endringer mellom ikke-onkogene deltakere og neoplasic pasient ADSCs på ulike passasjer, vi evaluert deres morfologiske og ultra strukturelle trekk ved fasekontrastmikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ved hver passasje opp til passasjen 4, som er den anbefalte passasje for terapi [37]. Bilder avslørte alle celler hadde spindel og multipolar form morfologi. Det ble ikke observert morfologisk forskjell mellom cellene i enten gruppe deltakere (figur 2 A, B).
Representative fase kontrast av
in vitro
utvidede ADSCs fra kreftpasienter (A) og ikke -tumorigenic deltakere (donorer) (B) ved passering 4 og toluidinblått farging av semithin deler av de samme cellene (C og D, henholdsvis) (forstørrelse 20X).
Semi-tynne snitt gjorde ikke viser noen nevneverdig morfologiske forskjeller, enten, med de fleste celler som presenterer en enkelt kjerne (figur 2 C, D). Kjernene inneholdt ett eller to nucleoli og rikelig nukleoplasma. Celler som hadde intakte membraner med pseudopodia strukturer på overflaten og intakte organelle strukturer. Grov endoplasmatiske retikulum (RE) og mitokondrier ble påvist i både den indre og den ytre endoplasmatiske soner. Randsonene utstilt fravær av organeller, men inneholdt vakuoler og blemmer.
For å øke oppløsningen vi fått transmisjons- elektron mikroskopiske bilder av noen av gruppene av ADSCs. Cellene ved passasje 2 viste rikelig og forstørret grov RE, tallrike Golgi cisternae og et stort antall dictyosomes fordelt langs cytoplasma som også inneholdt mitokondrier, lipid-dråper og rikelig bunter av filamenter (figur 3 A, B). Electrodense lik ble også funnet ved siden av dictyosomes.
ADSCs fra kreftpasienter ved passering 2 (A) og passage 4 (C) viser cytoplasms beriket med organeller og stor kjerne (N) med løst pakket kromatin. En detalj av den ADSC fra passasjen 2 (B) viser organelle berikelse, grove endoplasmatiske retikulum (piler) og stor Golgi cisternae (asterisk) med noen dråper lipid (Li). ADSCs på passering 4 (C) viser fremtredende atom invaginations (piler) og forstørret nucleoli (Nu). Ved lav forstørrelse viser også rikelig elektro tett organeller. På et høyere forstørrelse rikelig grov endoplasmatiske retikulum cisternae, er lipid dråper (Li) og rikelig membran strukturer eller autophagosomes verdsatt (D). Målestokken 10 um (A-C); 1 mikrometer (B-D).
kjerner inneholdt én eller to nucleoli og presenteres løst pakket kromatin, noen ganger viser dype invaginations og rikelig nukleoplasma. Ved passasje 4, viste celler noen små forskjeller med hensyn til passasje 2 inkludert en høyere tendens til invaginated kjerner, større kjerne og en økning i antallet av bunter av filamenter og i antall electrodense membran kroppslignende strukturer eller autofagosomes (figur 3 C, D). Imidlertid kan ingen kvalitative forskjeller bli verdsatt mellom grupper, slik at vi kan konkludere med at ADSCs fra kreftpasienter er identiske med de ikke-onkogene deltakere på morfologisk nivå.
Immunfenotype
For å bekrefte at vårt utvidede ADSCs holdt minimale mesenchymale kriterier fastsatt av International Society for Cellular Therapy [38] vi utført flowcytometrisk analyse av ADSCs fra pasienter og ikke-onkogene deltakere på passering 4 (figur 4 A-G og figur S4 A- F).
Representative strømnings fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og RT-PCR-analyse av
in vitro
utvidede ADSCs fra kreftpasienter ved passasje 4. Celler som var positive for CD105 (A), CD73 (B), CD90 (C), CD29 (H-6), CD44 (H-7) og HLA-ABC (F), men uttrykker ikke CD11b (D), NODAL (H-3), UTF1 (H-4 ), ABCG2 (H-5), eller HLA DR (G); mens CD34 var delvis positive (E), som tidligere beskrevet. Lanes H-1 og H-2 viser RT-PCR forsterkning av huset holde gener GAPDH og β-aktin, henholdsvis.
Som forventet, celler var positive for mesenchymale CD73, CD90 og CD105 markører og negative for blodkreft markør CD11b. I tillegg var de positive for histocompability antigen klasse I HLA-ABC men ikke uttrykte HLA-DR-overflatemolekyler under en ikke-stimulert tilstand, slik som tidligere beskrevet [38]. Uventet, CD34, en markør for hematopoetiske progenitorceller og endoteliale [39], var positiv i 3-12% av cellene.
Vi utførte også RT-PCR-analyse for ytterligere mesenchymale og pluripotency markører. De mesenchymale CD44 og CD29 markører var klart positive, mens ingen forsterkning av pluripotency NODAL og UTF 1 markører ble oppnådd. Vi kunne også for å forsterke den multimedikamentresistens transportprotein ABCG2 som er en markør pluripotency tidligere forbundet med en subpopulasjon av MSCer med nevrogen potensial [40], som tyder på en mulig begrensning av disse cellene for behandling av nervevev. De antigen overflateprofiler beskrevet var lik for MSC fra pasienter og ikke-onkogene deltakere (data ikke vist).
Cell plastisitet
plastisitet av de utvidede ADSCs ble bestemt av deres differensiering potensial. Cellene ved passasje 4 enten fra pasienter eller kontrollene ble dyrket i spesifikk differensiering media, som beskrevet i Materialer og Metoder. Celler i adipogenic media inneholdt tallrike hulrom, fordelt langs deres cytoplasms som vist med Oil Red O farging (figur 5 A, D), som indikerer at differensiering til adipocytter hadde funnet sted. Osteogenesis ble vist ved nærværet av aggregater med nodule-lignende strukturer som ble farget med Alizarin Red detektering av mineralavsetning (figur 5 C, F). Chondrogenic differensiering ble vurdert ved hjelp av Alcian blå flekker som avslørte høyt innhold av brusk-spesifikke proteoglykaner i kulturer (figur 5 B, E). ADSCs fra både pasienter (figur 5 A-C), og ikke-onkogene deltakere (figur 5 D-F), var like i stand til effektivt å differensiere til adipogenic, chondrogenic og osteogene linjene indikerer at ADSCs avledet fra våre kreftpasienter som besitter lignende celle plastisitet
