Abstract
Unormal mikroRNA (miRNA) uttrykk har vært knyttet til utvikling og progresjon av flere kreft hos mennesker, og en slik feilregulering kan resultere fra avvikende DNA metylering. Mens et lite antall mirnas er kjent for å bli regulert av DNA-metylering, postulerte vi at en slik epigenetisk regulering er mer utbredt. Ved å kombinere MBD-isolert Genome Sequencing (MiGs) for å evaluere genom-wide DNA metylering mønstre og microarray analyse for å fastslå miRNA uttrykk nivåer, vi systematisk søkte på kandidat mirnas regulert av DNA metylering i kolorektal kreft cellelinjer. Vi fant 64 mirnas å være robust metylert i HCT116-celler; atten av dem ble plassert i imprinting regioner eller allerede rapportert å være regulert av DNA metylering. For de resterende 46 mirnas, uttrykk nivåer av 18 var i samsvar med deres DNA metylering status. Til slutt, 8 mirnas ble oppregulert ved 5-aza-2′-deoksycytidin behandling og identifisert til å være nye mirnas regulert av DNA-metylering. Dessuten viste vi den funksjonelle relevansen av disse epigenetiske forstummet mirnas av ectopically uttrykker utvalgte kandidater, noe som resulterte i hemming av vekst og migrering av kreftceller. I tillegg til å rapportere disse funnene, vår studie gir også en pålitelig, systematisk strategi for å identifisere DNA metylering-regulert mirnas ved å kombinere DNA metylering profiler og uttrykk data
Citation. Yan H, Choi Aj, Lee BH, Ting AH (2011) Identifisering og Funksjonell analyse av epigenetiske Silenced microRNAs i tykktarmskreftceller. PLoS ONE seks (6): e20628. doi: 10,1371 /journal.pone.0020628
Redaktør: Axel Imhof, Ludwig-Maximilians-Universität München, Tyskland
mottatt: 24 januar 2011; Godkjent: 06.05.2011; Publisert: 16 juni 2011
Copyright: © 2011 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er små, ikke-koding. RNA som regulerer genekspresjon og spiller sentrale roller i normale cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og apoptose [1]. Både avvikende uttrykk og stanse all miRNAs har blitt observert i humane kreftformer, noe som tyder potensielle onkogene og tumor suppressor funksjoner for disse mirnas [2], [3]. Den biogenese av mirnas innebærer transkripsjon av en lang primære transkript (pri-miRNA) ved RNA polymerase II [4], spalting inn i et mellomprodukt (pre-miRNA) ved drosha [5], og endelig behandling i det modne miRNA ved dicer [ ,,,0],6]. Hvert trinn av fremgangsmåten er svært regulert, og feilregulering i hvilket som helst nivå kan resultere i upassende miRNA funksjoner. Av særlig interesse for vår studie er miRNA transkripsjonen regulering av DNA metylering. Generelt blir genet som promotor-DNA-metylering negativt korrelert til genekspresjon og kan gjøre rede for avvikende tumorsuppressorgen stanse i en rekke humane cancere [7]. I likhet med disse POLR2A transkriberes proteinkodende gener, kan miRNA transkripsjon også bli brakt til taushet av promoter DNA metylering.
epigenetiske forstummet mirnas har blitt oppdaget i kreft basert på differensial uttrykk mellom normalt vev og svulster eller mellom baseline og DNA demetylert kreft celler. For eksempel, Bandres
et al.
Først identifisert 23 mirnas som er nedregulert i grunnskolen kolorektal kreft sammenlignet med matchet normal kolorektal epitel og senere oppdaget at MIR-129-2, MIR-9-1, og MIR -137 er brakt til taushet av DNA metylering i kreft [8]. Toyota
et al.
Behandlede HCT116 tykktarmskreftceller med demethylating middel, 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC), og sammenlignet miRNA ekspresjonsprofiler mellom de behandlede og ubehandlede celler for å identifisere stanse av MIR-34b /c av promoter DNA hypermethylation [9]. Videre Lujambio
et al.
Forhold miRNA uttrykket profilen til villtype HCT116-celler med at den er demetylert isogen derivat, DNA metyltransferase -1 og -3b Double Knockout (DKO) celler, og fant 18 mirnas oppregulert i DKO-celler [10]. Deretter bekreftet de at DNA metylering er ansvarlig for stanse av MIR-124a i tykktarmskreft.
En litteratur søk ved hjelp av MEDLINE avdekket at 16 mirnas er kjent for å være epigenetiske brakt til taushet av DNA metylering [8], [9 ], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. DNA-metylering henviser til den kovalente tilsetning av en metylgruppe i 5-stillingen av cytosines, vanligvis i et CpG-dinukleotid sammenheng i pattedyr differensierte celler [18]. Genomiske regioner med en høy tetthet av CPGs kalles CpG øyer og er ofte nettstedene til regulatoriske DNA metylering. Tatt i betraktning at 16% av de kommenterte menneskelige mirnas ligger innenfor 1000 bp av en CpG island [19], anta vi at epigenetisk regulering av miRNAs kan være mer vanlig enn trafikken så langt. Tidligere studier avhengig av differensial uttrykk for miRNAs å identifisere kandidater til påfølgende epigenetisk evaluering. Denne tilnærmingen introduserer skjevhet som begrenser antall epigenetiske regulerte mirnas som kan bli oppdaget. For eksempel kan vevsspesifikke mirnas som er regulert ved hjelp av DNA-metylering være ekvivalent metylert i normalt vev og svulster, noe som resulterer i en mangel på differensialuttrykk mellom normale og kreft prøver. Videre mirnas med lave nivåer kan ikke bli pålitelig identifiseres fordi forskjeller i uttrykk mellom normal og kreft eller mellom baseline og demetylerte forholdene vil trolig falle under vanlige tidsavgrensninger (mellom 2 og 1,5 ganger). Til slutt, rest metylering vedvarer i både farmakologisk og genetisk demetylerte celler [20]. Slik metylering kan være avgjørende for å opprettholde celle levedyktighet, potensielt gjennom vedvarende undertrykkelse av nøkkel miRNAs. Dette vil resultere i slike mirnas ikke blir identifisert gjennom uttrykksbaserte strategier.
For å overvinne oppdagelsen skjevhet introdusert av uttrykk basert identifikasjon strategi, vi direkte utnyttet globale DNA metylering mønstre for å identifisere mirnas regulert av DNA metylering i HCT116 og DKO tykktarmskreftceller. Vi har tidligere kartlagt genom-wide DNA metylering i disse cellelinjer med metyl CpG-bindende domene (MBD) -isolated Genome Sequencing (MiGs) [21]. Vi først identifisert mirnas med proksimale DNA metylering som kandidater. Vi deretter kryss-referert listen over kandidater med miRNA uttrykket data som underlagsmateriale. Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi får identifisert både kjente og nye DNA metylering regulerte miRNAs. Her gir vi en mer omfattende katalog av epigenetiske regulerte miRNAs i tykktarm kreft celler, noe som viser at epigenetisk regulering av miRNAs er utbredt i disse kreftcellelinjer. Videre funksjonelle studier av utvalgte mirnas gi biologisk relevans for slik epigenetisk regulering i sammenheng med tykktarmskreft.
Resultater
Kandidat mirnas regulert av DNA metylering ble identifisert ved proksimale genomisk DNA metylering og støtte uttrykk data
Vi brukte tidligere MiGs å konstruere genom DNA metylering profiler for HCT116 cellelinje og dens demetylert isogen cellelinje, DKO [21]. DKO celler er HCT116-celler slettet for DNA-metyltransferase -1 og -3b og ta vare på mindre enn 5% genom-DNA-metylering [20]. DNA metylert fraksjoner av genomet ble isolert ved inkubasjon med rekombinante proteiner, MBD sekvensert på en Illumina GAII sequencer, og kartlagt tilbake til referanse genomet til å generere individuelle methylome profiler. For å identifisere DNA metylering regulerte mirnas, vi søkte etter mirnas med bevis for DNA metylering innenfor 500 bp av sine kommenterte stillinger i HCT116 og DKO celler. Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi identifisert 64 kandidat mirnas for påfølgende analyse (figur 1).
Av de 64 kandidat mirnas, 13 har blitt rapportert å være regulert av DNA metylering (tabell S1). En annen 5 tilhører en stor miRNA klynge som ligger i den menneskelige DLK1-GTL2 trykt domene ved 14q32 og dempes på fars kromosomet ved DNA-metylering [22]. Derfor fokuserte vi på de resterende 46 mirnas som ikke har blitt rapportert å være regulert av DNA metylering for detaljert validering. Først må vi tilfeldig valgt 6 mirnas for bisulfitt-sekvensanalyse for å bekrefte den DNA-metylering status detekteres ved MiGs (figur 2 og figur S1). Bisulfitt sekvense data bekreftet de MiGs data i det hele tatt seks loci.
Bisulfite sekvensering ble utført for (A) MIR-941, (B) MIR-1237, og (C) MIR-1247 i foreldre HCT116-celler , HCT116-celler behandlet med 5 uM 5-aza-dC i 48 timer, og DKO-celler. Den UCSC genom nettleser skjermbilde viser DNA metylering signalet i hver prøve. Rektanglene markere regionene validert av bisulfite sekvensering. Hver sirkel representerer en CpG dinucleotide. Svarte sirkler representerer denaturert cytosines mens hvite sirklene representerer unmethylated cytosines.
Neste, vi tenkte at tapet av DNA metylering i DKO celler sammenlignet med HCT116 cellene skal resultere i økt uttrykk av kandidat mirnas mens oppbevaring av DNA metylering bør relateres til vedvarende stanse av kandidat miRNAs. Derfor undersøkte vi uttrykket microarray data for de 46 kandidatene i HCT116 og DKO celler (tabell S2). Ved hjelp av 1,5 ganger endring som vår terskel, identifiserte vi 18 mirnas å ha konsekvente uttrykk data med deres DNA metylering status i HCT116 og DKO celler (tabell S1). Vi utførte miRNA-spesifikke kvantitativ real-time RT-PCR (MIR-QRT-PCR-analyse) for 6 utvalgte mirnas å verifisere ekspresjonsdata bestemmes av microarray (Figur S2). Mir-QRT-PCR resultater bekreftet microarray data for de 6 mirnas, som inkluderte både kjente og kandidat DNA metylering regulerte miRNAs. Derfor basert på empirisk genomisk DNA metylering og støtte microarray uttrykk data identifiserte vi 18 nye søker mirnas som kan transcriptionally regulert av DNA metylering.
Kandidat mirnas re-express etter 5-aza-2′-deoxycytidine behandling
for å validere at søker mirnas ble faktisk regulert av DNA metylering, behandlet vi HCT116, RKO, og DLD1 tykktarm kreft celler med demethylating agenten 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) til avgjøre hvorvidt disse mirnas er re-uttrykkes etter 5-aza-dC behandling. Som DNA-metylering regulerer genekspresjon på transkripsjonsnivået, vi analysert for ekspresjon av de primære mirnas (Pri-miRNA) av sanntids-RT-PCR [23]. inkludert Pri-MIR-193a, -9-3, og -375, som var kjent for å være transcriptionally regulert av DNA metylering i HCT116 cellene [8], som positive kontroller og Pri-MIR-1224, som ble demetylert men forble stille på tribunen i DKO celler i denne studien, som en negativ kontroll. Vi testet 17 av de 18 nye kandidatene fordi ingen av primere utformet for MIR-1234 ga vellykkede PCR-produkter. I HCT116-celler, fant vi 11 ut av 17 mirnas å være betydelig oppregulert etter 5-aza-dC behandling (figur 3A). Vi videre uavhengig bekreftet alle 11 kandidater i RKO celler (Figur 3B) og 10 av de 11 kandidatene i DLD1 celler (Figur 3C). For å kontrollere at oppregulering av disse miRNAs var påfølgende til DNA demetylering etter 5-aza-dC behandling, vurdert vi endringer i DNA metylering status i de proksimale regioner av MIR-941-1 /3, MIR-1237 og MIR-1247 av bisulfit genomisk sekvensering (figur 2). Demetylering ble observert ved disse loci i HCT116-celler behandlet med 5-aza-dC, som støtter at re-ekspresjon observert var grunnet DNA-demetylering.
Sanntids RT-PCR-analyse ble utført for å vurdere kandidat primære mirnas (Pri-mirnas) nivåer i (A) HCT116, (B) RKO, og (C) DLD1 celler før og etter behandling med 5 mikrometer 5-aza-dC i 48 timer. MIR-1224 ble inkludert som en negativ kontroll. MIR-193a, MIR-375, og MIR-9-3 ble inkludert som positive kontroller. * Indikerer signifikant økning i Pri-miRNA uttrykk etter 5-aza-dC behandling (p 0,05). Uttrykk for mirnas var internt normalisert til uttrykket nivåer av
GAPDH
og normalisert uttrykk for hver miRNA før 5-aza-DC behandlinger ble satt til 1.
Til slutt, intronic mirnas kan være co-transkribert fra verts genet arrangører og derfor er ikke uavhengig regulert på transkripsjonsnivå [24], [25]. Derfor, for å forstå betydningen av DNA metylering vi observerte for våre 10 kandidat mirnas, undersøkte vi de genomiske sammenhenger av de 10 kandidatene nærmere (tabell 1). MIR-1247, MIR-1826, og MIR-219-2 er lokalisert i intergeniske regioner og derfor er usannsynlig å være co-regulert av en rekke genet promoter. De resterende 7 kandidater er lokalisert i introner av RefSeq eller EST transkripsjoner og ble undersøkt videre. Basert på genom DNA-metylering profiler har ingen av de antatte verten gener, med unntak av den ikke-kodende RNA
ANKRD30BL
, har betydelig DNA-metylering ved deres aktivatorer (tabell 1 og fig S3), noe som tyder på at disse antatte verts gener er ikke regulert av promoter DNA metylering.
Likevel, postulerte vi at dersom den antatte verten gentranskripsjon dikterer uttrykk for de innebygde kandidat mirnas, dersom vi avdekker økt vert genekspresjon etter 5- aza-dC behandling i HCT116, RKO, og DLD1 celler. Slike økninger i verts genekspresjon kan passe til økningen observert for den innebygde mirnas i disse samme celler etter 5-aza-dC behandling. Motsatt, hvis de antatte verten genene ikke reagerer på 5-aza-dC behandling på samme måte som de innebygde mirnas, er mirnas er sannsynlig transkribert uavhengig av de antatte verten gener. I dette siste tilfellet, DNA metylering vi oppdaget nær mirnas ville være mest meningsfulle i deres transkripsjonsregulering. Basert på QRT-PCR-resultater, fant vi ut at MIR-1237, MIR-602, MIR-941-1, MIR-941-3, og MIR-663b er transcriptionally uavhengig fra sine respektive mulige vertsgener (figur 4). Uttrykket av
ANKRD30BL
, den antatte verten genet for MIR-663b, var ikke oppdages før eller etter 5-aza-DC eksperimenter og derfor ikke plottet i figur 4. For MIR-24-1 og speil 27b, er dataene mindre avgjørende, og vi kunne ikke utelukke at disse to mi-RNA kan være co-syntetisert med verts genet,
C9orf3 product: [26]. Alt i alt har vi identifisert og bekreftet minst 8 nye mirnas som er transkripsjonelt regulert av DNA-metylering.
Sanntids RT-PCR-analyse ble utført for å vurdere antatte verten genekspresjon som respons på 5-aza-dC behandlinger i HCT116 (blå), RKO (mørk rosa), og DLD1 (gul). Endringene i innebygd miRNA uttrykket ble også plottet for side-by-side-sammenligninger. Alle uttrykk ble internt normalisert til uttrykket nivåer av
GAPDH
og normalisert uttrykk for hver vert gen og miRNA før 5-aza-DC behandlinger ble satt til 1.
speil 941 og MIR-1247 undertrykke cellevekst og migrasjon i tykktarm kreft celler
Vi fortsatte å teste de biologiske funksjonene til disse epigenetiske regulerte mirnas å få innsikt i relevansen av deres DNA metylering i tykktarm kreft celler. For å avgjøre om uttrykket av disse epigenetiske forstummet mirnas vil påvirke kreftcellevekst og migrasjon, transfektert vi HCT116-celler med miRNA etterligner av MIR-941 (den modne form av MIR-941-1 og -3), MIR-1237, MIR-1247 og en ikke-kodende negativ kontroll (AllStars Neg.).
Først, utførte vi vekstkurve analyse (figur 5A) og MTT-analysen (figur 5B) for å vurdere cellevekst og metabolsk kondisjon. Vi fant at ektopisk ekspresjon av MIR-1247 resulterte i en signifikant reduksjon i HCT116-cellevekst og metabolsk aktivitet som målt ved hjelp av de to analyser respektivt. BrdU-inkorporering assay uavhengig bekreftet at redusert vekst og metabolisme er sannsynligvis en konsekvens av redusert proliferasjon i disse cellene (figur 5C). Vi observerte en tilsvarende reduksjon i celleformering og metabolsk funksjon i DLD1 tykktarmskreftceller transfektert med MIR-1247 etterligne (fig S4A og B). Omvendt, i DKO celler, der MIR-1247 er allerede demetylerte og re-uttrykt, transfeksjon med ekstra MIR-1247 ligner ikke har noen virkning på cellevekst og metabolisme (figur s5a og B). Disse observasjonene antydet at Mir-1247 kan være tumor-undertrykkende i tykktarmskreft og dens epigenetisk lyddemping er derfor gunstig for kreft vekst.
(A) Vekstkurver og (B) MTT analyser av mock transfekterte HCT116-celler og HCT116 celler transfektert med ikke-kodende negativ kontroll miRNA (AllStars Neg.), MIR-941, MIR-1237, eller MIR-1247 etterligner. (C) BrdU inkorporering analyse av mock transfekterte HCT116-celler og HCT116-celler transfektert med ikke-kodende negativ kontroll miRNA (AllStars Neg.), MIR-941, eller MIR-1247. En representativ felt for hver eksperimentell tilstand er vist. Den søylediagram som representerer den gjennomsnittlige prosent (%) av BrdU positive celler. (D) sårhelende analyse for mock transfekterte HCT116-celler og celler transfektert med negativ kontroll (AllStars Neg.), MIR-941, MIR-1237, eller MIR-1247 etterligner. Bildene ble tatt umiddelbart etter såret og 16 timer senere. Resultatene ble kvantifisert og normalisert til den mock-transfekterte celler. (E) Transwell migrasjon analyser for mock transfekterte HCT116-celler og celler transfektert med negativ kontroll (AllStars Neg.), MIR-941, eller MIR-1247 etterligner. Representative felt av invaderende celler på membranen er vist. Søylediagrammet representerer gjennomsnittlig antall celler på undersiden av membraner i hver behandlings normalisert å spotte transfekterte celler.
Videre beregnings spådd mål av MIR-941 og MIR-1247 inkluderte flere gener involvert i celle migrasjon og invasjon. For eksempel, ADAM metallopeptidase domene 15 (
ADAM15
) er en anslått mål av MIR-1247 og koder for et trans glykoprotein viktig for celle adhesjon [27]. Vi postulerte at nedregulering av disse spådd mål ved ektopisk uttrykk for MIR-941 og MIR-1247 vil negativt påvirke celle migrasjon. Derfor testet vi effekten av ektopisk uttrykk for MIR-941, MIR-1237, og MIR-1247 på celle mobilitet i HCT116 cellene. I sårhelende analyser, ble HCT116-celler transfektert med MIR-941 og MIR-1247 ligner betydelig svekket i sin evne til å repopulate sårede områder sammenlignet med mock, negativ kontroll, eller Mir-1237 transfektert celler (Figur 5D). Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av transwell migrasjon analysen (figur 5E). Endelig lignende undertrykkende virkning på cellemigrasjon ble uavhengig observert i DLD1 celler (Figur S4C) og DKO celler (Figur S5C) transfektert med MIR-941 og MIR-1247 etterligner. Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at epigenetisk stanse av MIR-941 og MIR-1247 kan lette tykktarmskreft celle migrasjon og invasjon.
Diskusjoner
microRNAs er viktige regulatoriske molekyler som modulerer genuttrykk i både utviklings- og sykdomsprosesser. Deres regulering er derfor en kritisk komponent i å forstå hver biologisk sammenheng. Genomisk DNA-metylering har vist seg å regulere transkripsjonen av en håndfull av mirnas i kreft. Disse tidligere studier som tar sikte på å identifisere DNA metylering regulerte mirnas avhengig av screening for forskjellig uttrykt mirnas fra kreft og normale sammenligninger eller re-uttrykk av miRNAs i DNA demetylert forhold. Et uttrykk basert tilnærming introduserer et funn bias mot ekvivalent denaturert, derfor ekvivalent til taushet, mirnas i sammenligningsgruppene. Denne typen epigenetiske regulerte miRNA kan fortsatt være viktig for kreftutvikling. For eksempel kan ekvivalente dempede mirnas i normale og kreft ha betydning for kreft i en vev-spesifikk måte. Videre kan rest DNA metylering i indusert demetylering forhold opprett stanse kritiske miRNAs, noe som resulterer i manglende påvisbar differensial uttrykk og unnlatelse av å identifisere slike epigenetiske regulerte miRNAs. Endelig mirnas med marginal differensial uttrykk under typiske terskler vil også bli savnet når screening er basert utelukkende på differensial uttrykk.
For å overvinne de oven skjevheter og mer omfattende identifisere DNA metylering regulerte mirnas i tykktarmskreft, vi skjermet for kandidat mirnas basert på empiriske bevis for genomisk DNA metylering i HCT116 og DKO tykktarmskreftceller. Vi søkte systematisk DNA methylome kartene genereres av MiGs i disse cellene for mirnas ligger innenfor 500bp DNA metylering signaler. Vi fant 64 kandidater, inkludert 5 kjente trykt mirnas, 13 kjente DNA metylering-regulert mirnas, og 46 nye kandidater. Deretter fikk vi bekreftet at 8 nye kandidater ble faktisk regulert av DNA metylering i HCT116, DKO, RKO, og DLD1 tykktarmskreftceller. Sammen med påvisning av kjente DNA-metylering regulert mirnas, vår studie identifisert totalt 26 epigenetiske regulerte mirnas, viser at vår tilnærming er effektiv.
Det er viktig å merke seg at vi fortsatt kan være mangler DNA metylering-regulert mirnas avledet fra lange primære transkripsjoner. Tidligere studier fokusert på mirnas med sine stilk-løkke sekvenser innebygd i eller i nærheten av CpG øyer, og vår nåværende Studien fokuserte på mirnas med DNA metylering proksimale til stammeløkke sekvenser. Selv om disse lignende strategier for systematisk tillate screening, de sannsynligvis undervurderer antal mirnas regulert av DNA-metylering, fordi transkripsjonsinitiering for de primære mirnas kan være langt oppstrøms fra stammesløyfesekvens. For eksempel, er den primære transkripsjon av MIR-21 3433 nukleotid lange, mens den modne MIR-21 kodes av rester +2445 til 2516 i HeLa-celler [28]. . Nylig, Chim
et al
rapportert at Mir-34a ble regulert av arrangøren CpG island DNA metylering plassert 30 kb oppstrøms fra den modne MIR-34a [29]. Derfor kan flere mirnas være regulert av promoter DNA metylering, men vil ikke bli lett identifiseres ved hjelp av en systematisk tilnærming som bygger på gjeldende genomet merknader.
Vi videre undersøkt den biologiske relevansen av epigenetisk stanse av den nylig identifiserte DNA metylering regulerte miRNAs. Vi har fokusert på to viktige aspekter ved kreftutvikling, vekst og migrasjon, og valgte MIR-941, MIR-1237, og MIR-1247 for funksjonelle studier. Ektopisk uttrykk for MIR-1247 betydelig redusert kreftcelle spredning og migrasjon i HCT116 og DLD1 celler, noe som tyder på at MIR-1247 kan fungere som en tumor suppressor. Disse observasjonene er i overensstemmelse med funksjoner av flere spådd mål av MIR-1247 (https://www.microrna.org). For eksempel, Citron (CIT), en serin /treonin kinase, er til stede ved spalting fure og midbody under cytokinese og er viktig for cellulær abscission [30], [31]. CIT regulerer også G2 /M overgang i rotte hepatocytter [32], og slå ned CIT hemmet spredning av leverkreft celler [33]. Et annet potensielt mål for MIR-1247 er FosB, som dimerizes med juni protein for å aktivere transkripsjon av proteaser som er involvert i tumor migrasjon og invasjon [34]. Til slutt kan det transmembrane glykoprotein, ADAM15, også bli målrettet av MIR-1247, for å lette prostata kreft metastase [35]. Disse beregningsmessig anslåtte målene må være empirisk validert i fremtiden.
Interessant, i DKO celler, der MIR-1247 er demetylerte og uttrykkes på et høyere nivå enn HCT116-celler, ytterligere eksponering i Mir-1247 ligner gjorde ikke resultere i reduksjon av cellevekst, men forårsaket nedsatt migrasjon. Avvikene mellom fenotyper av ektopisk MIR-1247 uttrykk i HCT116, kan DLD1, og DKO celler reflektere de ulike konsentrasjoner hvor forskjellige cellulære funksjoner moduleres ved MIR-1247. Alternativt kan det være på grunn av tilstedeværelsen av ulike mål for Mir-1247 i HCT116 og DKO celler. Disse to mulighetene vil kreve ytterligere studier for å avklare.
Mens forskjellig denaturert og uttrykt mirnas er viktig for kreftutvikling, vi foreslått at rest DNA metylering i demetylerte forhold, for eksempel i DKO celler, kan også være avgjørende. Vår funksjonell studie av MIR-941 begrunnet denne hypotesen. Vi fant at overuttrykk av MIR-941 var i stand til å hemme cellemigrasjon både HCT116 og DKO celler og i tillegg i DLD1 celler. Dette resultatet er rimelig vurderer flere høyt prioriterte spådd mål av MIR-941 er knyttet til celle migrasjon. For eksempel, matrix metallopeptidase 24 (MMP24) er en anslått mål for MIR-941, og det letter vev remodeling og cellemigrasjon i livmorslimhinnen fra endometriose pasienter [36]. Lignende type DNA metylering regulert mirnas vil bli savnet av tidligere uttrykk basert tilnærming, men kan lett bli fanget av vår studie design. Seks av de åtte romanen epigenetiske regulerte mirnas identifisert i vår studie beholdt proksimale DNA metylering i DKO celler, der. 5% genomisk DNA metylering er igjen i forhold til sine foreldre HCT116 cellene
I sammendraget, vår tilnærming til Oppdag DNA metylering regulerte mirnas ga en rekke tidligere uoppdagede kandidater. Vi har vist gjennom ektopisk ekspresjon og funksjonelle analyser at minst to av disse mirnas kan være særlig viktig i tumorprogresjon. Vår metode er et nyttig supplement til den tradisjonelle tilnærmingen for å bruke et uttrykk basert ordning for å identifisere nye mirnas forstummet av DNA metylering.
Materialer og metoder
Cell kultur og medikamentell behandling
Kolorektalkreft cellelinjer HCT116, DLD1, RKO og DKO celler [25] ble dyrket i McCoys 5A media (Invitrogen, San Diego, California) inneholder 10% føtalt bovint serum (Gibco, Grand Island, NY) ved 37 ° C i 5% CO
2 atmosfære. Cellene ble høstet ved skraping, og celle-pelletene ble renset to ganger med PBS (Gibco, Grand Island, NY). Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol (Invitrogen, San Diego, California) utvinning i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt RNA ble også behandlet med DNase I (Roche, Indianapolis, IN) for å fjerne spormengder av gjenværende genomisk DNA. Genomisk DNA ble ekstrahert fra cellepelletene ved inkubering av pellets i oppløsninger inneholdende 0,5 mg /ml Proteinase K, 2% SDS, og 20 mM Tris-HCl over natten ved
oC med risting, etterfulgt av fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling 55. For 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) behandlinger ble cellene sådd ut i 5 x 10
5 celler pr 100 mm skål 24 timer før tilsetningen av 5-aza-dC (Sigma, St Louis, MO). Cellene ble behandlet med 5 mikrometer 5-aza-DC i 48 timer før høsting.
MBD-isolert Genome Sequencing dataanalyse
Genome-wide DNA metylering data for HCT116 og DKO celler ble tidligere innhentet ved å utføre MBD-isolert Genome Sequencing (MiGs) [21]. Den rå sekvense leser kan lastes ned fra NCBI Short Les Archive (SRA # SRP001414). Minimum antall sekvense leser indikerer signifikant DNA-metylering signalene ble bestemt som tidligere beskrevet. Kommenterte mirnas (Hg18, NCBI Bygg 36,1) ligger innenfor 500 bp av vesentlig DNA metylering ble identifisert som kandidater for senere analyser.
miRNA microarray analyse
Mikromatrise-basert miRNA uttrykket profilering ble utført ved hjelp av Illumina menneskelig mikroRNA uttrykk profilering V2 panel i henhold til produsentens instruksjoner. Den menneskelige v2 miRNA panel inneholder 1,146 analyser, for påvisning av ~97% av miRNAs beskrevet i miRBase database (Sanger miRBase, v9.1, februar 2007 utgivelsen). Databehandling ble utført i GenomeStudio v2009.1 (Illumina, San Diego, California). Triplikate eksperimenter ble utført for hver cellelinje. Data fra hvert eksperiment ble normalisert ved anvendelse av metoden som er beskrevet tidligere [37]. For HCT116 versus DKO sammenligning ble Welch er
t
test utført med en
p
-verdi cutoff på 0,05 og multippel testing korrigering av falske funnrate (FDR). De mikroRNA array-data (GEO # GSE26819) kan nås fra Gene Expression Omnibus nettside.
Bisulfite sekvense
1 ug av genomisk DNA fra hver prøve ble bisulfite omregnet til EpiTect kit (Qiagen , GmbH, Hilden) etter produsentens protokoll. PCR-betingelser og primersekvenser er gitt i Tabell S3. PCR-amplikoner ble gel-renset og subklonet inn i pCRII-TOPO vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). Minst åtte kloner ble tilfeldig valgt og sekvensert på en ABI3730xl DNA analyser for å fastslå metylering mønstre av hvert locus.
Påvisning av modne og primær mirnas uttrykk ved kvantitativ RT-PCR
Expression of moden mirnas ble fastsatt ved hjelp QuantiTect SYBR Grønn RT-PCR kit (Qiagen, GmbH, Hilden) og var normalisert til endogen U6 snoRNA uttrykk ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [38]. I korte trekk ble 100 ng DNase-behandlede RNA fra hver prøve tilsatt til 10 pl av 2 x SYBR grønn PCR masterblanding, 0,2 pl RT-mix, 200 nM av hver primer, og RNase-fritt vann til en total på 20 ul. For primær miRNA uttrykket, ble GAPDH brukt som normalisering kontroll. Uttrykket av hver primær miRNA i forhold til GAPDH ble også bestemt å bruke to
-ΔΔCt metode. Primersekvensene for detektering modne og primære mirnas ble utført som tidligere beskrevet [23], [39] og er oppført i Tabell S3. Gjennomsnittet av tredoble eksperimenter ble fremstilt grafisk med standardavvik representert som feilfelt.
Påvisning av antatte verten genuttrykk av kvantitativ RT-PCR
Uttrykk av mulige vertsgener ble fastsatt ved hjelp QuantiTect SYBR Grønn RT -PCR kit (Qiagen, GmbH, Hilden) og ble normalisert til GAPDH internt. Den relative uttrykk etter 5-aza-dC behandling ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. RNA ble ekstrahert på samme måte som nevnt ovenfor. Primersekvensene er oppført i tabell S3. Gjennomsnittet av tredoble eksperimenter ble fremstilt grafisk med standardavvik representert som feilfelt.
Ektopisk uttrykk for miRNAs
Over-uttrykk for MIR-941, MIR-1237, og MIR-1247 i HCT116, DKO, og DLD1 celler ble oppnådd ved trans cellene med 20 nM miRNA tomannsboliger som etterlignet den modne MIR-941 (MSY0004984, Qiagen), MIR-1237 (MSY0005592, Qiagen), og MIR-1247 (MSY0005899, Qiagen). Den AllStars negativ kontroll siRNA (1027281, Qiagen) ble inkludert som en negativ kontroll.
