Abstract
vertens immun peptider, inkludert cathelicidins, har blitt rapportert å ha kreft egenskaper. Vi har tidligere rapportert at LL-37, den eneste cathelicidin hos mennesker, undertrykker utviklingen av tykktarmskreft. I denne studien ble den potensielle anticancer virkning av FK-16, et fragment av LL-37 tilsvarende restene 17-32, på dyrkede tykktarmskreftceller ble evaluert. FK-16 induserte et unikt mønster av celledød, markert ved samtidig aktivering av kaspase-uavhengig apoptose og autophagy. Den tidligere ble formidlet av kjernefysisk translokasjon av AIF og EndoG mens sistnevnte var preget av økt uttrykk for LC3-I /II, Atg5 og Atg7 og økt dannelse av LC3-positive autophagosomes. Knockdown av Atg5 eller Atg7 svekket cytotoksisiteten til FK-16, som indikerer FK-16-indusert autofagi var pro-død i naturen. Mekanistisk, til FK-16 aktivert atom p53 oppregulere Bax og downregulate BCL-2. Knockdown av p53, genetisk ablasjon av Bax, eller overekspresjon av Bcl-2 reverseres FK-16-indusert apoptose og autofagi. Viktigere, avskaffelse av AIF /EndoG avhengig apoptose forbedret FK-16-indusert autofagi mens avskaffelse av autofagi utvidet FK-16-indusert AIF- /EndoG avhengig apoptose. Kollektivt, induserer FK-16 caspase-uavhengige apoptose og autofagi gjennom felles p53-BCL-2 /Bax kaskade i tykktarm kreft celler. Vår studie også avdekket hittil ukjent gjensidig regulering mellom disse to celledødsveier
Citation. Ren SX, Shen J, Cheng ASL, Lu L, Chan RLY, Li ZJ, et al. (2013) FK-16 Avledet fra Anticancer Peptide LL-37 induserer caspase-Uavhengig apoptose og autophagic celledød i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 8 (5): e63641. doi: 10,1371 /journal.pone.0063641
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 21 november 2012; Godkjent: 04.04.2013; Publisert: May 20, 2013
Copyright: © 2013 Ren et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Antimikrobielle peptider (ampere), også kjent som vert. forsvars peptider, eksisterer i eukaryote celler som en konservert komponent av den medfødte immunsystemet. Forsterkere utføre førstelinjeforsvar mot infeksjoner ved å opptre som «naturlige antibiotika» ved direkte drap av patogene mikrober [1], [2]. Selektiviteten av forsterkere til bakterieceller er avhengig av sine kationiske strukturer som er avgjørende for interaksjonen med negativt ladet bakteriemembraner [3], [4]. Emerging bevis tyder på at forsterkere kan også selektivt binde til cancerceller i løpet av ikke-transformerte celler som på grunn av det økede overflate eksponering av negativt ladet fosfatidylserin i kreft [5]. Økte nivåer av O-glykosylert slimstoffer, negative membranpotensialet, og økt membranfluiditet og celle-overflateareal i kreftceller kan også bidra til denne selektiviteten [6]. Tallrike ampere humant (f.eks β-definsin, LL-37) og ikke-humane (f.eks BMAP-28, lactoferricin B, magainin II, melittin, tachyplesin I) opprinnelse har vist seg å utøve cytotoksisitet på kreftceller gjennom ulike mekanismer [6 ]. For eksempel, bovin lactoferricin B indusert mitokondriell vei av apoptose i humane leukemi og carcinoma cellelinjer, men ikke ikke-transformerte celler ved generering av reaktive oksygenarter [7]. Magainin II også indusert celledød i blærecancerceller, men ikke normale fibroblaster ved poredannelse på cellemembranen og påfølgende cellelysis [8]. Human β-definsin-1, som oppviste cancer-spesifikk tap av ekspresjon i renale klar cellekarsinom, indusert caspase-3-mediert apoptose i nyrecancercellelinje SW156 [9]. I henhold til AMP database (https://aps.unmc.edu/AP/main.php), er over 130 slike peptider er kjent for å ha anticancer egenskaper [10].
Cathelicidins er en familie av evolusjonært konservert ampere. hCAP-18 er den eneste cathelicidin hos mennesker. Denne 18-kDa preproprotein består av en N-terminal signalsekvens, en Cathelin-lignende domene og et C-terminalt domene AMP. Proteolytisk spalting av hCAP-18 utgivelser en 37-rester, amfipatiske, spiralformede peptid kjent som LL-37. Dette peptidet blir utskilt av benmargceller, sirkulerende leukocytter, og mange typer av epiteliale vev, slik som hud og mage-tarmslimhinnen. LL-37 fremviser ikke bare et brett spektrum av antimikrobiell aktivitet (for eksempel bakterier, sopp og virus), men har også evnen til å nøytralisere bakterielle lipopolysakkarider. Viktigere, LL-37 kunne mekle medfødt immunitet gjennom regulering kjemotakse av leukocytter (f.eks nøytrofile, monocytter, T-celler, eosinofiler og mastceller) og produksjon av cytokiner på nettstedene til infeksjon og betennelse, samt å fremme re-helingen under sårtilheling [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Akkumulert bevis fra tumorbiologi studier indikerer at LL-37 spiller en fremtredende rolle i kreftutvikling [15]. For eksempel, utøver LL-37 anticancer-effekt på magekreft og T-leukemiceller [16], [17]. Det C-terminale fragment av LL-37 også viser cytotoksisitet overfor både resistent og medikamentsensitive orale epiteloid carcinom-celler [18]. Vår tidligere studie viste også at uttrykket av LL-37 ble bemerkelsesverdig nedregulert i menneskelige kolon kreft vev mens eksogene LL-37 indusert apoptotisk celledød i dyrkede tykktarmskreftceller. Viktigere, cathelicidin-mangelfull mus oppviste økt mottakelighet for azoxymethane-indusert tykktarmskreftutvikling [19]. Disse funnene tyder på at LL-37 er en endogen tumor-undertrykke peptid.
Gitt dens betydning i immunologi og kreftforskning, har det vært satt ut for å studere strukturelle og biofysiske egenskapene til LL-37. Moon
et al.
Først beskrevet bruken av glutation S-transferase fusjons system for uttrykk og rensing av isotop-merkede LL-37 i
Escherichia spole product: [20]. Strukturanalyse ved NMR-spektroskopi viste at LL-37 er karakterisert ved en lang amfipatisk helix som strekker seg rester 2-31 med hele molekylet buet et tog av hydrofobe sidekjeder [21]. Ramamoorthy
et al.
Viste at LL-37 Orients nær overflaten av fosfolipid dobbeltlag og danner oligomere strukturer [22]. For dette formål, besitter LL-37 evnen til å forstyrre cellemembranen [23], [24], [25].
kostnadene forbundet med kjemisk syntese er en av de begrensende faktorer som hindrer bruken av peptider som terapeutiske midler. Det er derfor viktig å identifisere den funksjonell region av LL-37, slik at kortere fragmenter som bibeholder den biologiske aktivitet av full-lengde-peptidet kan fremstilles med lavere kostnader. Foregående struktur-funksjonsanalyse av forskjellige LL-37 fragmentene har vist at LL7-27, et 21-resters peptid avledet fra rester 7-27 av LL-37, oppviser kraftig aktivitet mot mikrober (spesielt gram-positive bakterier) ved avbrudd i lipid bilaget struktur [26]. En annen studie viste at den N-terminale fragment LL-12 svarende til rester 1-12 av LL-37 er inaktiv mot bakterier og kreftceller, mens FK-16 svarende til rester 17-32 beholder antibakterielle og antitumorvirkninger [27]. Dette fragment har til og med en bedre aktivitet mot prokaryoter og kjerneholdige celler enn full-lengde peptidet [28], som tyder på at FK-16 kan være en lovende kandidat for ytterligere karakterisering som et nytt anticancer-peptid. I denne studien,
in vitro
anticancer effekt av FK-16 ble undersøkt.
Resultater
FK-16 versus LL-37 i induksjon av celledød i Colon kreft celler
Cytotoksisiteten for FK-16 og full-lengde LL-37 ble først undersøkt i to human tykktarm kreft cellelinjer (LoVo og HCT116) ved MTT-analyse. Som vist på fig. 1A, både FK-16 og LL-37 betydelig redusert levedyktighet av LoVo og HCT116-celler på en doseavhengig måte. Merkbart, vises FK-16 en bedre aktivitet mot tykktarmskreftceller enn LL-37. Videre FK-16 hadde en minimal effekt på levedyktigheten av menneskelige normal tykktarm slimhinnene epitel NCM460 celler. En kontroll peptid med egge sekvens av FK-16 hadde også ubetydelige virkninger på LoVo og HCT116, indikerer FK-16 mediert selektiv avliving av kreftceller. Som HCT116 var mer følsomme enn LoVo til FK-16, ble valgt for påfølgende HCT116 mekanistisk studie og behandlet med enten 20 uM eller 40 uM FK-16, ved hvilken -20% og -50% av cytotoksisitet forekom.
(A) Effekter av LL-37, FK-16, og egge FK-16 (48 t) på levedyktigheten til tykktarmskreftceller (HCT116, LoVo) ble bestemt ved MTT-analyse. Den cytotoksiske effekten av FK-16 ble også analysert i menneskelige normal tykktarm slimhinnene epitel NCM460 celler. (B) phosphotidylserine eksternalisering i HCT116-celler behandlet med eller uten FK-16 ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri av PI /Annexin V-fargede celler. (C) Effekter av FK-16 på PARP-spaltning og caspaseaktivering i HCT116-celler ble bestemt ved Western blot. Cisplatin ble anvendt som en positiv kontroll for caspaseaktivering. (D) å forhåndsbehandle HCT116-celler med pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK i 1 time og ikke hindre FK-16-indusert tap av cellelevedyktighet som bestemt ved MTT-analyse (24 timer). (E) Kjerne ekspresjon av AIF og EndoG i HCT116-celler ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse av fraksjonerte proteiner. GAPDH og Lamin A /C ble brukt som intern kontroll for cytosolic (Cy) og kjernefysiske (NU) proteiner, henholdsvis. (F) Effekter av FK-16 (6 timer) på subcellulære lokalisering av AIF (grønn) og EndoG (rød) i HCT116 ble bestemt ved konfokal immunofluorescens (400 x). (G) knockdown av AIF og EndoG delvis reversert phosphotidylserine eksternalise indusert av FK-16 (40 mikrometer; 24 h) i HCT116. Celler ble utfordret med FK-16 på 48 timer etter transfeksjon av AIF- og EndoG-siRNAs. Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD fra tre separate eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
. 0,01, signifikant forskjellig fra de respektive kontrollgruppen
Induksjon av AIF /EndoG avhengig Apoptose av FK-16
har tidligere vist at LL-37 kan indusere caspase-uavhengig apoptose i tykktarmskreftceller [19]. For å avgjøre om apoptose mediert cytotoksisitet av FK-16, ble tapet av fosfatidylserin asymmetri, som er et kjennetegn på apoptose, kvantifisert ved cytometri av propidiumjodid- /Annexin v Dobbelt farget celler. Som vist på fig. 1B, FK-16 induserte fosfatidylserin eksternalisering uten å øke andelen av propidiumjodid
+ celler, noe som indikerer at FK-16-indusert apoptose, men ikke nekrotisk celledød. På begge 24 h og 48 h tidspunkter, gjorde FK-16 behandling ikke øke PARP spalting eller aktivere caspases-3 og 7 (Fig. 1C). Concordantly, pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK mislyktes i å reversere tapet av cellelevedyktighet forårsaket av FK-16 (Fig. 1D). Disse funnene antydet at FK-16 indusert apoptose i en caspase-uavhengig måte. AIF og EndoG, som opprinnelig var lokalisert i mitokondriene og translokert til kjernen ved aktivering, er kjente mediatorer av kaspase-uavhengig apoptose [29]. Immunoblotting hjelp fraksjonerte proteinlysatene viste at FK-16 økte kjernefysiske nivåer av AIF og EndoG (Fig. 1E). Immunfluorescens bekreftet at AIF og EndoG redistribuert fra cytosol til kjernen i FK-16-behandlede HCT116-celler (fig. 1F). Den funksjonell involvering av AIF og EndoG i FK-16-indusert apoptose ble ytterligere bekreftet ved RNA interferens eksperimenter, hvori knockdown av AIF eller EndoG attenuert fosfatidylserin eksternalisering indusert av FK-16 (fig. 1G). Disse funnene indikerer at, i likhet med LL-37, FK-16 indusert AIF /EndoG avhengig men caspase-uavhengige apoptose i tykktarmskreftceller.
Induksjon av autophagic celledød ved FK-16, men ikke LL-37
for å bestemme virkningen av FK-16 på en annen caspase-uavhengig celledød vei, nemlig autophagic celledød [30], analyserte vi ekspresjonen av LC3 protein (spesielt LC3-II, som er kjent for å korrelere med omfanget av autophagy) og to andre autophagy-relaterte proteiner, det vil si Atg5 og Atg7. Resultatene viste at FK-16 økte LC3-I og LC3-II, så vel som Atg5 og Atg7 protein ekspresjon (Fig 2A og amp;. 2B). FK-16 også indusert dannelse av LC3
+ autophagic vakuoler i HCT116 (Fig. 2C). Både induksjon av LC3-I /II-ekspresjon og dannelse av LC3
+ autophagic vakuoler av FK-16 kan bli blokkert av 3-metyladenin, en klasse III fosfoinositid 3-kinase inhibitor. I motsetning til den full-lengde LL-37 peptid hadde minimal effekt på LC3-I /II-ekspresjon (data ikke vist). Ultrastructural analyse ved elektronmikroskopi viste at en 48 h-eksponering for FK-16 indusert massive vacuolization i HCT116 cellene, der lamellær og myelin-lignende strukturer som ligner sene autophagic vakuoler ble observert (Fig. 2D). Dannelsen av sure vesikulær organeller, som er et viktig kjennetegn på autophagy, ble også forbedret med FK-16 som bestemt ved vital farging av HCT116-celler med akridinorange, et fargestoff som avgir lys rød fluorescens i sure vesikler men fluorescerer grønn i cytoplasma og cellekjernen (fig. 2E). Dannelsen av autolysosomes ble også øket i FK-16-behandlede celler som visualisert ved monodansylcadaverine farving (data ikke vist). Økningen i autophagic fluksen forårsaket av FK-16 ble bekreftet ved å behandle HCT116-celler med FK-16 og bafilomycin A
1 (a lysosomotropic middel), alene eller i kombinasjon. Inhibering av lysosomal funksjon av bafilomycin A
1 økte nivåene av både LC3-I og -II indusert av FK-16 (fig. 2F), som tyder på at FK-16 økte autophagic fluks. Avhengig av mobilnettet sammenheng kan autofagi tjene som en pro-død eller pro-overlevelse mekanisme. For å bestemme den funksjonelle rollen til autophagy indusert av FK-16, ble et RNA-interferens fremgangsmåte som kan benyttes for å avskaffe autofagi ved å målrette Atg5 og Atg7, som begge er nødvendig for dannelsen av autophagosomes på et tidlig stadium. Knockdown av Atg5 eller Atg7 betydelig redusert cytotoksiske effekten av FK-16 (Fig. 2G), noe som tyder på at FK-16 indusert autophagic celledød i tykktarm kreft celler.
(A) HCT116 cellene utstilt økt protein uttrykk for LC3-i /II etter behandling med FK-16 i 24 timer og 48 timer. LC3 ekspresjon indusert av FK-16 ble opphevet av den autophagy inhibitoren 3-MA (5 mM, 1 time før behandling). (B) FK-16 også indusert Atg5 og Atg7 protein uttrykk. (C) å behandle HCT116 med FK-16 i 24 timer eller 48 timer tydelig forbedret dannelse av autophagic vakuoler som bestemt ved immunfluorescens-fargingen for LC3 (400 x). Dannelsen av LC3
+ autophagosomes indusert av FK-16 ble blokkert av 3-MA. (D) ultra analyse ved elektronmikroskopi viste dannelse av autophagosome eller sekundære lysosomer med det gjenværende materiale fordøyd i FK-16-behandlede HCT116-celler (40 pM; 48 timer). (E) Ved ansamling av sure vesikulær organeller, som emitteres lys rød fluorescens, indusert av FK-16 (40 pM) ble visualisert ved akridin orange farging (400 x). (F) Økt autophagic fluks ble bekreftet av co-behandling HCT116-celler med FK-16 og bafilomycin A
1. Behandling med bafilomycin A
1 (10 nmol /L) ikke hindre oppregulering av LC3-I /II i celler inkubert med FK-16 (40 pM). (G) knockdown av Atg5 eller Atg7 attenuert den cytotoksiske effekt av 48-timers behandling av FK-16 (40 pM) i HCT116. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre separate forsøk. *,
p
0,05; **,
p
0,01 signifikant forskjellig fra de respektive kontrollgruppen.
†
p
0,05;
††,
p
. 0,01 signifikant forskjellig fra kontroll siRNA-transfektert celler behandlet med FK-16
Krav til p53 for FK-16-indusert apoptose og autophagic celledød
tumor suppressor protein p53 er kjent for å ta del i både caspase-avhengig og-uavhengig celledød, inkludert AIF /Endo-avhengig apoptose og autofagi [31], [32]. Her viste vi at FK-16 aktivert p53 å formidle både celledødsveier direkte. Som vist på fig. 3A, FK-16 økte atomnivå p53 og oppregulert uttrykk for PUMA og Bax. Konsekvent, FK-16 redusert uttrykk av Bcl-2. Å belyse funksjonelle involvering av p53 i AIF /Endo-avhengig apoptose og autophagic celledød utløst av FK-16, p53 ble slått ned av siRNA. Knockdown av p53 ikke bare restaurert uttrykk for Bax og BCL-2, men også bemerkelsesverdig redusert FK-16-indusert LC3-I /II, Atg5 og Atg7 uttrykk samt atom uttrykk for AIF og EndoG, noe som tyder på at p53 var en vanlig aktivator av begge celledødsveier (fig. 3B). Følgelig knockdown av p53 redusert fosfatidylserin eksternalisering (fig. 3C), dannelse av LC3
+ autophagic vacuole (fig. 3D) og tap av celle-levedyktighet (fig. 3E) indusert av FK-16.
(A) HCT116-celler ble inkubert med FK-16 i 24 timer eller 48 timer. Cytosoliske og kjernekraft p53 og total uttrykk for BCL-2 medlemmer (PUMA, BCL-2, Bax og Bak) ble bestemt ved Western blot. GAPDH og Lamin A /C ble brukt som interne kontroller for cytosoliske og kjerneproteiner, henholdsvis. (B) knockdown av p53 reversert oppregulering av pro-autophagic faktorer (Atg5 og Atg7) og pro-apoptotiske faktorer (Bax, Bak, kjernekraft AIF og kjernekraft EndoG) samt nedregulering av Bcl-2 av FK-16. (C) FK-16 klarte å indusert phosphotidylserine eksternalisering i p53-utarmet HCT116-celler. Etter transfeksjon med kontroll- eller p53-siRNA i 48 timer, ble cellene behandlet med eller uten FK-16 (40 pM) i ytterligere 24 timer fulgt av propidiumjodid /annexin V-dobbeltfarging. (D) knockdown av 53 vesentlig redusert antall LC3
+ autophagic vakuoler i FK-16-behandlede celler (40 pM; 48 h) som bestemt ved konfokal immunofluorescens (400 x). Kjerner (blå) ble farget med DAPI. (E) knockdown av p53 delvis reversert den hemmende effekten av FK-16 på cellelevedyktighet i HCT116 som bestemt ved MTT-analyse. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre separate forsøk. *,
p
0,05; **,
p
0,01 signifikant forskjellig fra de respektive kontrollgruppen.
†
p
0,05;
††,
p
0,01 signifikant forskjellig fra kontroll siRNA-transfektert celler behandlet med FK-16
Endret Uttrykk av Bcl-2 og Bax under FK-. 16-indusert apoptose og autophagic celledød
Siden familien BCL-2 har blitt rapportert å regulere både caspase-uavhengige apoptose og autofagi i andre biologiske sammenhenger [30], [32], vi neste spurte om FK- 16-indusert koloncancer celledød ble mediert gjennom Bcl-2 og Bax, som begge var nedstrøms av p53 (fig. 3B). Resultatene viste at restaurering av BCL-2 uttrykk ved transfeksjon med BCL-2-koding plasmid eller genetisk ablasjon av Bax hjelp Bax
– /- HCT116 cellene avskaffet FK-16-indusert uttrykk for LC3-I /II, Atg5 og Atg7 så vel som kjerne ekspresjon av AIF og EndoG (figur 4A 48 h) i HCT116. (B) Genetisk ablasjon av Bax (Bax KO) i HCT116 snudd FK-16-indusert apoptotiske og autophagic signaler. Bax
+/- HCT116 behandlet med eller uten FK-16 ble anvendt som kontroll. (C) Restaurering av BCL-2 uttrykk eller genetisk ablasjon av Bax i HCT116 avskaffet dannelsen av LC3
+ autophagic vakuoler indusert av FK-16 (40 mikrometer; 48 h) som bestemmes av confocal immunfluorescens (400 ×). (D) Gjenopprettelse av Bcl-2-ekspresjon eller genetisk ablasjon av Bax delvis reversert den hemmende effekten av FK-16 på cellelevedyktighet i HCT116 som bestemt ved MTT-analyse. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre separate forsøk. *,
p
0,05; **,
p
0,01 signifikant forskjellig fra de respektive kontrollgruppen.
††,
p
0,01 signifikant forskjellig fra tom vektor-transfektert eller Bax
+/- celler behandlet med FK-16
Gjensidig forordning mellom. caspase-uavhengige apoptose og autophagic celledød
for å belyse potensialet crosstalk mellom autophagic celledød og AIF /EndoG avhengig apoptose i handlingen av FK-16, disse to cellulære prosessene ble avskaffet av RNA-interferens. Knockdown efficacies av Atg5-, Atg7-, AIF- og EndoG-sirnas ble bekreftet ved Western blot (Fig. 5A). Hemming av autofagi av Atg5- eller Atg7-siRNA vesentlig utvidet atom uttrykk for AIF og EndoG indusert av FK-16 (Fig. 5B). Concordantly, knockdown av Atg5 eller Atg7 også forbedret FK-16-indusert fosfatidylserin eksternalisering (Fig. 5C), noe som tyder på at hemming av autofagi intensivert FK-16-indusert AIF /EndoG avhengig apoptose. Gjensidig, avskaffelse av AIF /EndoG avhengig apoptose ved AIF- eller EndoG-siRNA forbedret Atg5 og Atg7 uttrykk indusert av FK-16 (Fig. 5D), noe som indikerer at hemming av AIF /EndoG avhengig apoptose forstørret autophagic signal i FK- 16-behandlede tykktarmskreftceller. Concordantly, AIF- og EndoG-siRNAs forbedret uttrykk for LC3-I /II. Disse funnene indikerte at det eksisterer en urapportert gjensidig regulering mellom autophagic celledød og AIF /EndoG avhengige apoptose.
(A) knockdown efficacies av AIF-, EndoG-, Atg5- og Atg7-sirnas ble bekreftet av nedregulering av protein nivåer av respektive mål i HCT116. (B) knockdown av Atg5 eller Atg7 forbedret basal og FK-16-indusert (40 mikrometer, 6 h) atom uttrykk for AIF og EndoG. (C) knockdown av Atg5 eller Atg7 øket FK-16-induserte (40 mM; 48 h) phosphotidylserine eksternalisering som bestemt ved annexin V-farging og flowcytometri. (D) knockdown av AIF eller EndoG forbedret basal og FK-16-indusert (40 mikrometer; 48 h) Atg5 og Atg7 protein uttrykk. (E) knockdown av Atg5 eller Atg7 avskaffet mens knockdown av AIF eller EndoG forbedret FK-16-indusert (40 mikrometer; 48 h) LC3-I /II uttrykk i HCT116. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Induksjon av apoptose i tumorceller har lenge vært anerkjent som en viktig metode for kreftbehandling [33]. Men den iboende motstanden av noen kreftceller til apoptose og rask gjenvekst av tumor etter første respons på kjemoterapi forbli store kliniske conundrums. Derfor er det en økende interesse i det vitenskapelige samfunn i å studere hele registeret av caspase-uavhengig celledød og å identifisere midler som virker primært gjennom den caspase-uavhengig mekanisme. I den foreliggende undersøkelse, viser vi at behandling med anticancer peptid FK-16 sterkt redusert levedyktighet av tykktarmskreftceller i fravær av kaspase-aktivering eller membran permeabilization, noe som tyder på at hverken den klassiske caspase-avhengig apoptose eller nekrose var ansvarlig for dets cytotoksisitet . For dette formål, FK-16-behandlede celler viste biokjemiske og morfologiske egenskaper som samsvarer med AIF /EndoG-avhengig apoptose og autophagic celledød. Fremfor alt, knockdown av gener som er sentrale for disse to cellulære prosesser svekket cytotoksisiteten til FK-16. Disse funnene antyder at FK-16 er en dual-mode aktivator av caspase-uavhengig celledød. Men det er også verdt å legge merke til at i noen eksperimentelle innstillinger (Fig 1G . 3C), FK-16 beskjedent økt propidiumjodidfarging. Denne observasjon kan forklares ved den forhøyede cellulært stress forbundet med siRNA transfeksjon, noe som kan gjøre cellene mer følsomme for den membran-forstyrre virkningen av FK-16.
En rekke cellulære påkjenninger, blant annet DNA-skade og onkogen aktivering, har blitt vist å aktivere p53. Avhengig av den innledende stimulus og den cellulære sammenheng kan p53-aktivering utløse et repertoar av responser, inkludert cellesyklus-stans, apoptose, cellulær begynnende alderdom, differensiering og autophagy [34]. Siden tapet av p53-ekspresjon er vanlig i humane kreftformer, gjenopprette p53-aktivitet er en attraktiv metode for kreftbehandling. I denne forbindelse har en rekke p53-gjenopprette eksperimentelle kreftlegemidler (f.eks CP-31398 og Nutlin) blitt identifisert [35]. Her viser vi at FK-16 er en roman aktivator av p53 signalering. FK-16 ikke bare økt atom p53 akkumulering, men også induserte ekspresjon av Puma og Bax, som begge er kjente transkripsjonelle mål av p53 [36], [37]. Knockdown av p53 også reverseres FK-16-indusert AIF /EndoG avhengig apoptose og autophagic celledød. Dessuten, den pro-apoptotiske og pro-autophagic virkning av FK-16 nødvendig for p53-avhengig oppregulering av Bax og nedregulering av Bcl-2. I linjer med disse funnene, har de sentrale rollene i p53-Bax /BCL-2 kaskade i AIF /EndoG avhengig apoptose og autofagi blitt rapportert. For eksempel, er en analog av DNA-ødeleggende medikament cyklofosfamid og en stor grønn te polyfenol blitt vist å aktivere p53 og Bax å utløse kjerne flytting av AIF og EndoG til å mediere apoptose i tumorceller [32], [38]. p53 som en transkripsjonsfaktor stimulerer også autofagi gjennom å fremkalle flere pro-autophagic gener, inkludert
DRAM
,
SKP2
,
SESN2
, og
ULK1 /2
, i tillegg til
PUMA Hotell og
BAX product: [30]. Videre kan p53-aktivering fremme dissosiasjon av BCL-2-Beclin-en kompleks og dermed noenlunde Beclin-en-avhengige autofagi [39].
Et interessant funn dukker opp fra dette arbeidet er oppdagelsen av en gjensidig reguleringsmekanisme mellom de to caspase-uavhengig celle dødsveier. Våre data indikerer at opphevelse av AIF /EndoG-avhengig apoptose forbedrer autophagic celledød og vice versa, noe som indikerer at disse to reaksjonsveier mediere cytotoksisiteten til FK-16 på en samarbeidende måte. Selv om FK-16-indusert autofagi er funnet å være pro-død i naturen, blokade av autophagy paradoksalt induserer caspase-uavhengig apoptose i FK-16-behandlede celler. En forklaring på denne gåten er at blokaden av FK-16-indusert autofagi forhindrer celledød men fortsatt aktiverer caspase-uavhengige apoptose i en kompenserende måte og netto resultat er bevaring av cellen levedyktighet sammenlignet med celler der begge celledødsveier er aktivert. For å oppnå dette, har det direkte bidrag autophagy til celledød blitt mye rapportert tross for de siste konflikter over selve eksistensen av «autophagic celledød» [40], [41], [42], [43]. Selv om ko-aktivering av autophagy og caspase-uavhengig apoptose er blitt dokumentert i forskjellige biologiske sammenhenger [44], [45], [46], er det bare sporadiske studier i litteraturen som har forsøkt å belyse forholdet mellom disse to prosesser. I samsvar med våre funn, Zheng
et al.
Og Eimer
et al.
Fant at autofagi kan beskytte mot caspase-uavhengige apoptose i Hoechst 33342 behandlet HeLa celler og erlotinib behandlet glioblastom celler, henholdsvis [47], [48]. Inhibering av autophagy av 3-metyladenin akselererer også rottlerin-indusert caspase-uavhengig apoptose i HT1080 human fibrosarkom celler [49].
Identifikasjon av anticancer peptider fra den eksisterende databasen AMP er en effektiv metode for utvikling av nye kreft therapeutics. I denne studien, FK-16, et fragment av LL-37, oppviser en bedre anticancer aktivitet enn full-lengde peptid. FK-16 driver også en ekstra celledød vei, nemlig autophagic celledød. Den forkortede lengde av FK-16 kan også redusere produksjonskostnadene forbundet med peptidsyntese. Tatt sammen, kreft peptid FK-16 induserer AIF /EndoG avhengig apoptose og autophagic celledød via felles p53-Bax /BCL-2 cascade i tykktarm kreft celler (Fig. 6). Våre data avslører også en roman gjensidig regulering mellom disse to caspase-uavhengig celle dødsveier.
Materialer og metoder
peptider
Den syntetiske LL-37 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES ), FK-16 (FKRIVQRIKDFLRNLV) og egge FK-16 (DQVLRFRNFRIKLVKI) peptider med renhet . 95% ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)
Cell Kultur og celleviabilitet Assay
humane koloncancer cellelinjer HCT116 og LoVo ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bax
– /- og Bax
+/- HCT116-celler ble generert av genet targeting [50] og gitt av professor Bert Vogel (Ludwig Center ved Johns Hopkins). Den menneskelige hormal kolon mucosal epitel cellelinje NCM460 ble kjøpt fra Incell Corporation. Celler ble opprettholdt i deres respektive anbefalte kulturmedium, supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft . Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid] assay. I korte trekk, ble 5000 celler per brønn sådd ut i 96-brønners plater. Etter behandling, ble MTT-oppløsning oppløst i kulturmediet i sluttkonsentrasjon på 0,5 mmol /l tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert i ytterligere 4 timer. Dimetylsulfoksyd ble deretter tilsatt for å oppløse MTT tetrazolium krystall. Til slutt ble den optiske tetthet bestemmes ved 570 nm ved hjelp av en Benchmark Plus mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, USA).
Kvantifisering av phosphatidylserine eksternalise
For måling av fosfatidylserin eksternalisering, behandlede celler ble resuspendert i buffer inneholdende flekker propidiumjodid og annexin V-fluorescein-isotiocyanat (Invitrogen, USA). Etter inkubasjon i 15 min i mørke, dobbel-merkede celler ble analysert av FACSCalibur System og Cellquest program.
Nuclear Protein Extraction og Western Blot
isolering av kjernefysiske og cytosoliske proteiner ble utført ved hjelp NucBuster Protein Extraction Kit (EMD Biosciences, Darmstadt, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. For isolering av hel-celle-protein, ble cellene høstet i radioimmunopresipitasjon buffer inneholdende proteinase og fosfatase-inhibitorer.
