Abstract
Histologisk underklassifikasjon av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har økende terapeutisk effekt. I avanserte kreft stadier vevsprøver er vanligvis bioptically samlet. Disse små prøvene er av ekstraordinær verdi siden molekylære analyser er stadig viktigere for målrettet terapi. Vi studerte derfor gjennomførbarhet, diagnostisk nøyaktighet, økonomiske og prognostiske effekten av en vev sparsom samtidig multi-antistoff test for underklassifikasjon av NSCLC. Av 265 NSCLC pasienter vev multi arrays (TMA) ble konstruert for å simulere biopsiprøver. TMA ble farget av en simultan bi-farge multi-antistoffanalyse består av TTF1, vimentin, P63 og nevroendokrine markører (CD56, kromogranin A, synaptophysin). Klassifisering var i hovedsak basert på dagens forslag fra IASLC med en hierarkisk beslutningstre for underklassifikasjon inn adenokarsinom (LAC), plateepitelkarsinom (SCC), stor celle nevroendokrin carcinom (LCNEC) og NSCLC ikke annet er spesifisert. Undersøkelse av svulst heterogenitet viste en eksplisitt lavere variant for immunhistokjemisk analyser i forhold til konvensjonelle klassifisering. Videre overlevelse analyse av vår samlede immunhistokjemisk klassifisering avslørte tydelig separasjon av hvert foretaks overlevelse kurve. Dette var statistisk signifikant for terapeutisk viktige undergrupper (p = 0,045). Som morfologiske og molekylære kreft testing dukker opp, vår multi-antistoffanalyse i kombinasjon med standardisert klassifisering leverer nøyaktig og pålitelig separasjon av histomorphological diagnoser. I tillegg tillater det klinisk relevant inndeling i undergrupper av NSCLC inkludert LCNEC. Vårt multi-antistoffanalyse kan derfor være av spesiell verdi, spesielt i diagnostisering små biopsier. Det gir videre betydelig prognostisk informasjon med terapeutiske konsekvenser. Integrering av immunhistokjemiske subtyping inkludert undersøkelse av nevroendokrin differensiering i standard histopatologisk klassifisering av NSCLC må derfor anses
Citation. Kayser G, Csanadi A, Otto C, Plönes T, Bitter N, Rawluk J et al . (2013) Samtidig Multi-antistoff farging i ikke-småcellet lungekreft Styrker diagnostisk nøyaktighet særlig i små vevsprøver. PLoS ONE 8 (2): e56333. doi: 10,1371 /journal.pone.0056333
Redaktør: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, USA
mottatt: 18. august 2012; Godkjent: 08.01.2013; Publisert: 13. februar 2013
Copyright: © 2013 Kayser et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien har blitt økonomisk støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 850. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Lungekreft viser den høyeste totale dødeligheten av ondartet sykdom hos mennesker over hele verden [1], [2]. Til tross for enorm fremgang i moderne medisin, dødelighet i lungekreft er fortsatt i en stabil tilstand gjenspeiler det presserende behovet for kraftige målrettede kjemoterapeutika i behandling av dette utbredt sykdom. Blant separasjon av småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), kan sistnevnte bli ytterligere underklassifiseres i henhold til sine morfologiske utseende inn i tre hovedgrupper: adenokarsinomer (Lac), squamous cell carcinoma (SCC) og store cellekreft (LCC). Foruten forskjellig morfologi nyere studier har avdekket biologiske forskjeller mellom de histologiske NSCLC subtyper. Disse omfatter forskjellige uttrykk mønstre av m-RNA og immunhistokjemisk påviselige proteiner slik som thymidylat-syntetase (TS). TS, involvert i DNA-reparasjonsmekanismer, er en av de viktigste målene for pemetrexed og betydelig høyere uttrykt i SCC forhold til LAC og LCC. Scagliotti et al. kunne vise at pasienter som lider av LAC og LCC nytte av platin-basert kjemoterapi i kombinasjon med pemetrexed. I motsetning til dette, SCC pasienter ha nytte av en kombinasjon av platin med gemcitabin [3]. Hovedsak basert på denne studien, ble anbefalinger for eksakt inndeling i undergrupper av NSCLC innført i nasjonale lungekreft retningslinjer [4] – [6]. Dilemmaet for patologer i denne innstillingen er, på den ene siden, den nåværende WHO klassifisering innført i 2004. I følge WHO, har underklassifikasjon av NSCLC gjøres hovedsakelig av hematoksylin-eosin (H E) flekker. På grunn av ofte omfattende tumor heterogenitet, er reseksjon prøver krevde for en endelig diagnose, også [2]. På den annen side er disse behandlingsretningslinjer gjelde for pasienter i avanserte stadier UICC-IIIB og IV [3]. Av disse pasientene vanligvis er det bare små tumorprøver samlet, vanligvis ved biopsi, mediastinoskopi eller tynn nål aspirasjon. Dermed må patologen å basere hans /hennes diagnose beslutning om tilleggs immunhistokjemiske spesielle flekker. Blant annet er spesielt thyroid transkripsjonsfaktor 1 (TTF1) og squamous stamcelle markør p63 anbefalt i første linje [7] – [9]. Siden svulst materiale fra små biopsier er svært knappe, vev sparsom teknikker må utvikles til å takle mindre diagnostisk materiale for et større antall diagnostiske undersøkelser. I tillegg, som mengden av nødvendige molekylære undersøkelser for målrettet terapi er raskt voksende, økonomiske hensyn må også tas hensyn til ved innføring av nye teknikker. Hovedsakelig basert på publiserte markørsett, Sterlacci [10] og Yamagita [11] nylig publiserte doble fargingsprotokoller og et kommersielt tilgjengelig antistoff-cocktail, henholdsvis. Likevel, ved siden av LAC og SCC, stor celle nevroendokrin carcinom (LCNEC) representerer en annen subentity av NSCLC med terapeutiske konsekvenser. I senere studier har det blitt mer og mer åpenbart at LCNEC er biologisk nært beslektet med SCLC [12], [13]. Det foreslås derfor å administrere LCNEC pasienter kjemoterapeutiske kombinasjoner i analogi til SCLC [14]. I strategien for NSCLC diagnose og inndeling i undergrupper, bør LCNEC på denne måten være med. Ved denne bakgrunn undersøkte vi fordelen av en nyutviklet samtidig multi-antistoff farging analyse i et stort og godt karakterisert kohort av NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studien er godkjent av Universitetssykehuset Freiburg (EK 10/12). I samsvar med denne avgjørelsen av denne etiske komité alle pasient relatert data ble brukt bare i en pseudonyme måte. Resultatene oppnådd ved denne studien resultatene ikke påvirke pasientens behandling. Parafin materialet hadde blitt arkivert i minst 3 år etter første diagnosen. På grunn av disse forutsetningene, ved avgjørelsen av etisk komité, ingen skriftlig samtykke fra hver enkelt pasient måtte hentes.
Pasienter og TMA bygging
265 pasienter, operert mellom 1. januar
st 1990 og 31. desember
st 2007 ved Institutt for Thoracic Surgery, Universitetssykehuset Freiburg, ble valgt fra databasen ved Institutt for patologi, Universitetssykehuset Freiburg. Foruten hoved NSCLC, inklusjonskriteriene var tilgang til nok svulst og ikke-neoplastiske lungevev. Valg av pasientene ble utført blindet for å unngå skjevheter som følge av tumorstadium og /eller histologisk subtype. Operasjon prøver ble fiksert i 4% bufret formalin i 24 til 48 timer. Innbringende prosedyre og parafin embedding fulgt rutineprotokoller. Alle svulst bærende parafinblokker ble hentet fra arkivet. Ved nye H E seksjoner alle svulster ble reklassifisert uavhengig av tre erfarne patologen (GK, AC, MW) i henhold til gjeldende klassifiseringssystem [2]. Ingen immunhistokjemiske fargings resultatene hadde blitt tatt i betraktning for denne omklassifiseringen. 5 uharmoniske og vanskelige saker ble, igjen, gjennomgått og diskutert felles. Ved tilstedeværelse av WHO-kriterier, ble konsensus definert for videre analyser. TNM-etapper var jevnt revurdert etter gjeldende UICC klassifisering (7
th edition) [15]. For å eliminere skjevheter, histologisk omklassifisering og UICC restaging av alle tilfeller ble utført før immunhistokjemiske prosedyrer og deres evaluering. Fra alle pasienter, klinisk-patologiske data inkludert røykevaner og total overlevelse var tilgjengelige (tabell 1).
Tissue multi-arrays (TMA) ble konstruert ved å ta tre kjerner av hver svulst tilfeldig fra tre forskjellige fjerntliggende områder. Kjernediameteren var 2 mm. I H DAKO for seg FLEX +, kode 8012). Til slutt, lysbilder ble kontra med hematoksylin. Fargingsprosedyren ble utført på en DAKO Autostainer for alle lysbilder (detaljert steg-for-steg-protokollen Document S1).
Evaluering av multi-antistoffanalyse
I sammendraget med histologiske vekstmønster en kombinert histologisk-IHC diagnose for hver kjerne ble gjort i samsvar med de foreslåtte IASLC retningslinjene [9]: herved klare kjertel vekst mønstre definert LAC uavhengig av uttrykk for IHC markører. Det samme ble definert for SCC, hvis ceratinization og /eller inter broer var til stede. I svulster uten klart morfologiske H E-diagnose, evaluering av IHC-markør uttrykk fulgt denne hierarkiske algoritme: 1) TTF1 uttrykk: positiv LAC, negativ: 2) p63 uttrykk: positiv SCC, negative: 3) uttrykk for nevroendokrine markører: LCNEC negativ: NSCLC NOS (figur 1). Vimentin tjente som en surrogatmarkør for å evaluere stromal arkitektur samt fiksering tilstand av vevet siden dens robusthet i fargingskvalitet. Hver markør ble bedømt uavhengig av hverandre, mens kun tydelig spesifikk nukleær (TTF1 og p63) eller cytoplasmatisk (vimentin, Kromogranin A og synaptophysin) og membran (CD56) med i det minste moderat til sterk intensitet i den overskytende flertall av tumorcellene ble betraktet som positive for diagnostisk formål.
for sluttvurdering av svulsten, en konsensus diagnose som kombinerer alle tre TMA kjerner ble gjort. I samsvar med gjeldende WHO-klassifiseringen [15], ble hvis TMA kjernene ikke ble enstemmig diagnostisert kreft klassifisert som LAC for kombinasjonen av LAC og NSCLC NOS, og som SCC for kombinasjonen av SCC og NSCLC NOS. Kombinasjonen av LAC eller SCC med LCNEC ble gruppert i LCNEC. Hvis begge deler, LAC og SCC, ble diagnostisert i forskjellige TMA kjerner av en pasient disse ble klassifisert som blandet LAC /SCC. Som tolkning av denne IHC uttrykk profilen ikke er klart definert i IASLC forslaget og bare fem pasienter gruppert i den, ble disse tilfellene ekskludert fra overlevelsesanalyser.
statistikker
Sammenheng mellom de ulike antistoffene var evaluert ved beregning av Kendall-tau-b korrelasjonskoeffisient. Diagnostisk påliteligheten av de forskjellige antistoffer til IHC klassifiseringsalgoritme for NSCLC ble bedømt av mottaker-drift karakteristiske (ROC) kurver og arealet under kurven (AUC) beregninger. Inter-kjerne forskjeller, så vel som diagnostiske avtale mellom H 0,001; korrelasjonskoeffisient -0,300; Kendall-tau-b). Betydelig negativ korrelasjon kan også påvises for TTF1 og p63 (p 0,001; korrelasjonskoeffisient -0,262; Kendal-tau-b). Ingen andre positive eller negative inter-antistoff korrelasjoner ble oppdaget. Disse funnene støtter videre at fargemønstre og evaluering av hvert antistoff er ikke kompromittert av potensielle bakgrunnsfarging eller kromogen kryssreaksjoner. Likevel, kjernekraft og /eller cytoplasma dobbel positivitet gjenspeiler spesifikk farging for begge antigener, jeg. e. TTF1 kombinert med p63 og vimentin kombinert med nevroendokrine markører, henholdsvis, er fortsatt klart kan skilles (figur S2).
Normal lungevev (A), LAC (B), SCC (C) og LCNEC (D) farget med den kombinerte flerantistoffanalyse (øverst) og hver enkelt er inkludert antistoff. Røde kjerner – TTF1; rød cytoplasma – vimentin; brune kjerner – P63; brun cytoplasma – nevroendokrine markører. Under bi-farge IHC analyse tilsvarende enkeltantistoffanalyser vises i samme tumorområdet. Sammenligning av hver enkelt antistoff farging og bi-farge multi antistoffanalyse viser analog bestemt positivitet i de samme cellene og ikke avslører uspesifikk bakgrunnsfarging eller kromogen kryssreaktivitet.
TTF1 og p63 er nyttige markører for vurdering av avstamning differensiering
den gjeldende klassifiseringssystem foreslår H E klassifisering av reseksjon prøvene som gullstandarden for lungekreft [2]. Når det gjelder dette, kunne vi observere en sensitivitet og spesifisitet på TTF1 for anerkjennelse av LAC i et område i mellom de tre TMA kjerner av 80,4% til 84,6% og 70,6% til 76,9%, henholdsvis. Evaluering av p63 som en markør for skvamøst differensiering, ble sensitiviteten beregnet fra 62,1% til 66,7%, mens spesifisiteten varierte mellom 84,0% og 90,8%. Disse tallene er sammenlignbare med den aktuelle litteratur der disse to markører anbefales å brukes på små biopsier for undersøkelse av avstamning differensiering [8], [9]. Dette gjenspeiles også i entydige Odds forhold (figur S3) og ROC-AUC analyser (figur S4, tabell S1). Både TTF1 og p63 viste signifikante resultater for klassifisering av LAC og SCC, henholdsvis (p 0,001; tabell S1). Som forventet, AUC-verdier var høyere i IHC klassifisering algoritme i forhold til H E klassifisering av reseksjon prøvene (tabell S1). I denne sammenheng har vi også observert en signifikant negativ sammenheng mellom uttrykk for TTF1 og p63 (totalt: p 0,001; korrelasjonskoeffisient -0,262; Kendall-tau-b)
intratumorale heterogenitet er mindre fremtredende i IHC markører. sammenlignet morfologisk vekstmønstre
Som heterogeniteten for tumor morfologi er kjent for å være høye i NSCLC vi inngår tre TMA kjerner av hver tumor. Disse kjerner ble tilfeldig tatt hensyn tumorområdet for å utelukke morfologisk skjevhet. Som publisert og internasjonalt akseptert, kan antas analyse av hver TMA kjerne sammenlignbar analyse av tumor biopsier i rutine diagnostisk patologi [20], [21]. Når det gjelder diagnostiske baner i histopatologi, vi først klassifisert hver TMA kjerne i en rutine H E morfologi. Innenfor disse tilfellene, kappa-verdiene for H E klassifisering viste bare dårlig korrelasjon mens IHC klassifisering nådde verdier av god inter-kjerne korrelasjon (tabell 2). Analyse av immunhistokjemiske fargemønstre i kombinasjon med histologiske vekst mønstre for klassifisering av NSCLC viser derfor mindre intratumoral variabilitet enn klassifisering av NSCLC basert på H . E morfologi, alene
Tilleggs IHC analyserer øke diagnostisk nøyaktighet sammenlignet med konvensjonelle H E klassifisering, ved hjelp av den kombinerte IHC algoritmen bare 13 tumorer (4,9%) uttrykte hverken TTF1 eller p63 eller nevroendokrine markører og ble derfor klassifisert som NSCLC NOS (tabell 3). For å definere diagnostisk samstemmighet av hver TMA kjerne med histologisk omklassifisering av reseksjon prøven Cramers V ble beregnet for hver kjerne klassifisert av H E og flerantistoffanalyse. Selv om vi kunne bekrefte en høy statistisk signifikans for korrelasjonen av konvensjonell diagnostisering av reseksjon prøven med H figur S5). På morfologisk evaluering, alle disse LCNEC tilfellene viste i tillegg nevroendokrine vekst mønstre. Ved bruk av kombinert IHC klassifisering LCNEC kan derfor bli diagnostisert i en sofistikert og standardisert måte.
Kombinert morfologiske og multi-antistoff klassifisering forbedrer kliniske betydningen av NSCLC subtyping
ulike biologiske oppførsel av ondartede sykdommer er vanligvis gjenspeiles i ulike utfall i langsiktig oppfølging. For å vurdere om det er en bedre stratifisering ved hjelp av en kombinert histologiske og IHC klassifisering, gjennomførte vi overlevelse analyser fra begge klassifikasjoner, jeg. e. konvensjonell H E morfologi reseksjon prøver og kombinert morfologi-IHC klassifisering algoritme. Konvensjonell, H figur 3). På den annen side gir morfologi-IHC klassifisering en tydeligere adskillelse av overlevelseskurver for hver enhet med en statistisk tendens (p = 0,088, figur 3). Kombinere LAC og NSCLC NOS henhold til terapeutisk konsekvens inn i «ikke-plateepitel karsinom» og sammenligner disse med SCC og LCNEC total overlevelse var signifikant forskjellig mellom disse pasientgruppene (p = 0,045, figur 3).
NSCLC subtyper var diagnostisert ved H D) .
Bi-farge multi-antistoffanalyse sparer vev og økonomiske ressurser
Den protokollen som brukes her til immunohistochemically klassifisere NSCLC består av en samtidig flekken med 6 forskjellige antistoffer. Således vil mengden av vev som er nødvendig for å karakterisere NSCLC-biopsier utgjør bare 16,7% i forhold til det som er nødvendig for 6 enkle antistoffanalyser. Dermed kan bare 1/6
th av glass sildes og Dekk er nødvendig. Ettersom protokollen bruker antistoff blandinger av TTF1 og vimentin, samt p63 i kombinasjon med det nevroendokrine cocktail, blir 1/3
rd av flekker og blokkerende reagenser nødvendig. Det samme gjelder for kromogene påvisnings ampuller. Ved vår institusjon, er utgifter til reagenser beregnet til 3,30 € pluss ytterligere 0,20 € for glass-slide per IHC flekken. I tall per tilfelle, dette resulterer i et samlet beløp på 6,80 € for vår multi-antistoff-analysen sammenlignet med 21.80 € for 6 enkle antistoff protokoller. Dermed bruk av vår multi-antistoffanalyse sparer opptil 68,8% av utgifter til laboratoriereagenser.
På grunn av den doublestaining prosedyren imidlertid samlede tiden som trengs for å fullføre protokollen tar ca 4 timer sammenlignet med 1,5 til 2 timer for enkeltantistoff flekker. Men, som protokollen kan lett bli etablert på automatiserte immunhistokjemisk farging maskiner, skjer det ingen negativ effekt på arbeidsmengden laboratorieteknikere. Tvert imot, er flekker automatisering langvarig og teknikere kan oppnå mer komplekse og tidkrevende oppgaver under denne prosedyren. I tillegg er tid for lysbildesortering helt utelatt.
For å diagnostisere patologen bare ett lysbilde må evalueres. Herved kan alle IHC fargemønstre bli vurdert i parallell og enda viktigere i de samme cellene. Mikroskopiske lysbilder trenger ikke å endres og diagnostiske områder som ikke skal flyttes. Som diagnostisk evaluering ganger i diagnostisk patologi er svært variabel, kan mengden av spart tid ved å bruke vår multi-antistoff analysen bare estimeres. Ifølge våre erfaringer multi-antistoffanalyse sparer omtrent to tredjedeler av den tiden som er nødvendig for evalueringen av de tilsvarende 6 enkle antistoff flekker.
Diskusjoner
På verdensbasis er den viktigste dødsårsaken lungekreft blant alle ondartede sykdommer, [1], [22]. Selv om det har vært fremskritt i moderne kreftbehandling, har dødeligheten av NSCLC pasienter ikke endret seg vesentlig i løpet av de siste tiårene [1], [2], [22]. Med utvikling av forskning på personlig kreft ledelse, har flere biomarkører blitt tilskrevet en prediktiv verdi for spesifikke kjemoterapeutika [23] – [27]. Scagliotti et al. beskrev en fordel med gemcitabin i en platin-baserte kjemoterapeutiske regime for pasienter som lider av avansert NSCLC hvis histologi viste en dominerende squamous differensiering. I tillegg pasienter med histologi viste en dominerende LAC differensiering hadde en større fordel hvis gitt pemetrexed [3]. Følgelig er anbefalinger for kjemoterapeutiske regimer nå basert på histologisk differensiering av NSCLC og har blitt implementert i flere nasjonale retningslinjer NSCLC behandling [4] – [6]. I den nåværende WHO klassifisering, histologisk typing av lungekreft er en) i stor grad basert på standard H E farging og 2) krever histopatologisk undersøkelse av reseksjon prøver, spesielt å ha i tankene at nesten 50% av lungekrefttilfellene har mer enn én stor histologisk subtype [2]. På den annen side er arbeidet med Scagliotti basert på en kohort av pasienter diagnostisert NSCLC i avansert UICC stadier IIIB og IV. Her har histologisk typing gjøres på små vevsprøver, som stort sett reseksjon prøvene er ikke tilgjengelig for disse pasientene. Derfor har IHC markører og paneler blitt foreslått av flere forfattere for inndeling i undergrupper av NSCLC [8], [28], [29]. Blant disse, TTF1 for deteksjon av kjertler og p63 for plateepitel differensiering ser ut til å være de mest pålitelige markører for underklassifikasjon av NSCLC [8], [9]. Av disse grunner, valgte vi TTF1 og p63 som markører for avstamning differensiering i NSCLC, og etablert et diagnostisk bane som kombinerer tradisjonelle morfologi og IHC uttrykk mønstre i analogi til forslag fra IASLC [9]. I det siste har den avkortede p63 protein DeltaNp63 (p40) er beskrevet å ha en høyere spesifisitet for plateepitel differensiering i forhold til full lengde protein [XPATH FEIL:. Ukjente variabelen «Start2»], [31]. Men begge antigener, full lengde p63 og DeltaNp63, har samme følsomhet for plateepitelkarsinom [30], [31]. Siden uttrykket av p63 er diagnostisk vurdert etter TTF1 (figur 2), kan det antas at begge antistoffene ville gi de samme klassifiserings resultatene i vår multi-antistoff analysen. For å inkludere LCNEC, utvidet vi vår antistoff panel ikke bare med vimentin, som kan tjene som en markør for sarcomatoid carcinoma [8], men også med neurendocrine markører (CD56, synaptophysin, Kromogranin A). Positivitet av en eller flere av disse markørene er nødvendig for diagnostisering av nevroendokrine differensiering [2]. For å skåne endelig vev av bioptiske materiale, implementert vi en bi-farge multi-antistoff farging analysen som gjør at ikke bare samtidig farging av 6 antistoffer på samme vev delen, men også veritabel samtidig evaluering. For å demonstrere at det ikke er noen interferens mellom antistoffene har flere valideringsforsøk foretatt: Et testsett ble farget med vår multi-antistoffanalyse og serielle seksjoner er blitt farget med hvert antistoff, individuelt. Her kan ingen forskjeller i fargemønstre eller kromogen bakgrunns reaksjoner observeres (figur 2, figur S1). For å undersøke mulige kryss farging av andre DAB-basert gjenkjenning system analysen ble utført på testsettet mens utelate den andre primære antistoffer (P63, kromogranin A, synaptophysin, CD56). Hvis gratis og /eller tilgjengelige bindingssteder av de første antistoffene ble eksisterende, ville disse være synlig i brun farge. Gjennom de fargede objektglass, disse forsøk viser at alle bindingssetene av de første primære antistoffer (vimentin, TTF1) blir blokkert av AEC-basert deteksjonssystem som ingen brun DAB farging var synlig (figur S1). Heller ikke kunne vi belyse hvilken som helst positiv statistisk sammenheng mellom antistoffene blir visualisert ved den samme kromogent påvisningsmetoden. Hvis det var bakgrunnsfarging, enten kjernekraft eller cytoplasma av tilsvarende markører som fører til falsk fortolkning, ville dette ha vært reflektert i positive statistiske sammenhenger. Tvert imot, vi har oppdaget statistisk signifikant negativ korrelasjon av p63 med nevroendokrine markører, så vel som med TTF1. Nylig Sterlacci et al etablert doble flekker som består av TTF1 /CK7, p63 /CK5 /6 og TTF1 /CK5 /6 for klassifisering av NSCLC og viste resultater som ligner på våre [10]. Yanagita et al. har publisert en kommersielt tilgjengelig med flere antistoffanalyse inneholdende 4-antistoff, TTF1, napsin A, p63 og CK5 /6 [11]. Disse tidligere etablerte antistoff cocktails vise seg å være nyttig, men bare tjene til å skille LAC fra SCC. Muligheten til å undersøke for LCNEC er ikke tatt hensyn til. Men spesielt denne enhet av LCNEC bebor ikke bare en infavourable prognose, men kjemoterapeutiske regimer som ligner på de som brukes i SCLC må vurderes [14]. I den aktuelle litteratur, LCNEC er bare å bli diagnostisert NSCLC hvis viser nevroendokrine vekstmønstre i kombinasjon med ekspresjon av minst en av de nevroendokrine markørene CD56, chromogranin A eller synaptophysin [2].
