Abstract
Forstå molekylære grunnlaget for chemoresistance er viktig å utforme terapi for å gjenopprette kjemosensitivitet . Spesielt har metadherin (MTDH) er vist å ha en kritisk rolle i chemoresistance. Over-uttrykk for MTDH korrelerer med dårlig klinisk utfall i brystkreft, nevroblastom, leverkreft og prostatakreft. MTDH er også sterkt uttrykt i avanserte livmorkreft, en sykdom som nye behandlingsformer er sterkt behov. I denne studien har vi fokusert på den terapeutiske nytten av MTDH reduksjon i endometrial kreft celler til å gjenopprette følsomheten til celledød. Celler ble behandlet med en kombinasjon av tumor nekrose faktor-α-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL), som fremmer død av maligne celler av den humane reproduksjonskanal, og histondeacetylase (HDAC) inhibitorer, som har vist seg å øke følsomheten av kreftceller i Trail-indusert apoptose. Våre data tyder på at nedbryting av MTDH i livmorkreftceller resulterte i sensibilisering av celler som tidligere var resistent svar på kombi behandling med TRAIL og HDAC hemmer LBH589. MTDH knockdown reduksjon av andelen av celler i S og økt celle arrest i G2 /M i celler behandlet med LBH589 alene eller i kombinasjon med LBH589 TRAIL, noe som tyder på at MTDH funksjoner ved cellesykluskontrollpunktet for å oppnå resistens. Ved hjelp av mikromatriseteknologi, identifiserte vi 57 nedstrøms målgener av MTDH, inkludert calbindin en og galectin-en, noe som kan bidra til MTDH-mediert terapeutisk motstand. På den annen side, i MTDH utarmet celler, inhibering av PDK1 og AKT-fosforylering sammen med økt Bim ekspresjon og XIAP degradering korrelert med øket følsomhet for celledød i respons til TRAIL og LBH589. Disse funnene tyder på at målretting eller tappe MTDH er en potensielt ny vei for å reversere terapeutisk motstand hos pasienter med livmorkreft
Citation. Meng X, Brachova P, Yang S, Xiong Z, Zhang Y, Thiel KW, et al. (2011) knockdown av MTDH sensitizes livmorkreft celler til celledød Induksjon av Død ligand TRAIL og HDAC hemmer LBH589 Co-behandling. PLoS ONE seks (6): e20920. doi: 10,1371 /journal.pone.0020920
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 22 desember 2010; Godkjent: 16 mai 2011; Publisert: 08.06.2011
Copyright: © 2011 Meng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Grant R01CA99908 til KKL, og delvis av avdelingen for obstetrikk og gynekologi Research Development Fund, Institutional stipend Antall IRG-77-004-31 fra American Cancer Society til XM, administrert gjennom Holden Comprehensive Cancer Center ved University of Iowa. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
et vanlig problem med cancerterapi er utvikling av resistens, og en forbedret forståelse av de underliggende baner som er involvert med legemiddelresistens kan føre til utvikling av nye strategier for å overvinne denne motstanden. En nylig oppdaget genet, metadherin (MTDH, også kjent som AEG-en eller LYRIC) har dukket opp som et potensielt viktig formidler av tumorprogresjon, metastase, og motstand mot kjemoterapi [1], [2], [3], [4] . MTDH er foreslått for å fremme tumorprogresjon ved integrering av flere signalveier inkludert ras, myc, wnt, PI3K /AKT, og NF-kB i forskjellige typer kreftceller [4], [5], [6], [7] , selv om mekanismen som MTDH styrer disse signalhendelser er uklart. I denne studien undersøkte vi hvilken rolle MTDH i livmorkreft og dens hemming som en mekanisme for å overvinne resistens.
Første interesse i MTDH som en faktor i chemoresistance oppsto som følge av NCI60 farmakogenetiske data, som fant at genomisk kopiantallet gevinst på 8q22 er et definerende hendelse i chemoresistance [8]. En tidligere studie rapporterte at lymfeknutemetastase er signifikant assosiert med kopitall gevinster på 8q22-Q23 i livmorkreft [9]. Hittil er MTDH den eneste kjente genet på 8q22 som har vist seg å korrelere med dårlige kliniske resultater i pasienter med faste tumorer [8].
In vitro
og
in vivo
chemoresistance analyser bekreftet at MTDH knockdown sensitizes ulike typer svulster – inkludert brystcancer, leverkreft, prostatakreft, og neuroblastoma- til flere kjemoterapeutiske midler så som 5- fluorouracil (5-FU), cisplatin, paclitaxel, og doksorubicin [1], [10], [11]. Men evnen til MTDH knockdown for å bevisstgjøre celler til målrettet terapi, som har kommet for å symbolisere fremtidens kreftbehandling, har ennå ikke blitt utforsket.
Tumor nekrose faktor (TNF) -α relaterte apoptose-induserende ligand (TRAIL) har nylig dukket opp som en lovende målrettet terapeutisk strategi i ulike typer kreft på grunn av sin pro-apoptotiske egenskaper [12], [13]. Som medlem av TNF-familien, aktiverer TRAIL spesielt ytre apoptotiske baner i kreftceller ved å binde seg til dødsreseptorer. Viktigere, TRAIL selektivt fremmer apoptose av tumorceller, men har ingen effekt på normale humane reproduktive veisceller, inkludert de i endometrium, ovarie, cervix, eller egglederen [13]. Noen kreftceller er resistente mot TRAIL-indusert apoptose [14], [15], [16], derfor kombinatoriske regimer har blitt vedtatt å gjenopprette følsomhet [13], [17]. I flere undersøkelser har histon-deacetylase (HDAC) inhibitorer blitt vist å ytterligere øke følsomheten for TRAIL-fremkalt celledød ved apoptose [18], [19], [20], [21]. Dessverre noen kreftceller forblir motstandsdyktig mot kombinert TRAIL og HDAC hemmer behandling [22], og nye måter å gjenopprette følsomhet for disse målrettet terapi er nødvendig.
Vi har undersøkt effekten av tappe MTDH nivåer på å gjenopprette følsomhet for Trail- baserte målrettet terapi. Dataene rapportert her viser at MTDH regulerer cellesyklus og celleoverlevelse i respons på behandling med HDAC hemmere og TRAIL, noe som tyder på at MTDH er et lovende terapeutisk mål å øke effekten av TRAIL og HDAC hemmer kombi behandling.
Resultater
MTDH uttrykk er forhøyet i livmorkreft cellelinjer og vev
MTDH var sterkt uttrykt på proteinnivå i alle seks livmorkreft cellelinjer som ble testet (RL95, AN3CA, KLE, Ishikawa, Hec50co og ECC1, figur 1A). I endometrial kreft pasientens vev, ble MTDH uttrykk forhøyet i forhold til normal endometrium (figur 1B). Nærmere bestemt ekspresjon av 80 kDa MTDH og antatte 50-55 kDa MTDH isoformer var signifikant høyere i endometriekreft prøver inkludert papillære serøs, sarkom, og adenokarsinom, mens MTDH var ikke påvises i normale endometriale vev (figur 1B). Fordi ingen MTDH ble oppdaget i normal endometrievev, vi utslettet for tumor suppressor LKB1 som en kontroll (figur 1B). Øket ekspresjon av cytoplasmisk MTDH i endometrisk adenokarsinom og atom MTDH i noen metastatisk endometrial cancer ble også observert i endometrial cancer vev, som vist i figur 1C ved immunhistokjemi med en MTDH-spesifikt antistoff. XIAP og FLIP er to pro-overlevelse proteiner forbundet med døds reseptor-induserte ekstrinsiske apoptotiske reaksjonsvei [12]. Vi har derfor undersøkt om det er en sammenheng mellom uttrykk for pro-overlevelse proteiner XIAP og FLIP med MTDH uttrykk. Mens uttrykk for MTDH og XIAP ikke korrelerer, gjorde vi oppdager en sammenheng med FLIP uttrykk (figur 1B). Den økte ekspresjon av MTDH i alle kreftceller og vev som ble undersøkt tyder på at den kan spille en rolle i endometrial karsinogenese
(A) Ekspresjon av MTDH ble påvist i alle de seks testede endometrial cancer-cellelinjer. RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H (Ishi), KLE og Hec50 celler. (B) Uttrykk for MTDH ble oppdaget i endometrial vev fra to normale individer, fire pasienter med papillær serøs, tre pasienter med adenokarsinom, og to pasienter med livmor sarkom. Uttrykk for den tumorsuppressorgenet LKB1 og to anti-apoptotiske gener, XIAP og FLIP, ble også påvist ved Western blotting i de samme prøvene. (C) MTDH uttrykk ble oppdaget av immunhistokjemi flekker med sykdom spektrum (livmorkreft progresjon) vev array med over 50 prøver av endometrial vev fra godartet til kreft. (I) normal endometrievev, (ii) lav karakter endometrial adenokarsinom, (iii) høy klasse endometrial adenokarsinom, og (iv) livmorkreft metastatisk til bukhulen. Original forstørrelse, × 400.
knockdown av MTDH reduserer kolonidannelse
På grunn av forhøyet uttrykk for MTDH i de ulike livmorkreft cellelinjer og menneske endometriekreft prøver, vi neste undersøkt den tumorigent potensialet MTDH i Type II livmorkreft cellelinje Hec50co med en kort-hårnål RNA (shRNA) spesifikk for MTDH. En 3.49-fold reduksjon i MTDH genekspresjon ble oppdaget av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) i MTDH shRNA-transfektert Hec50co celler sammenlignet med kontrollgruppen egge shRNA-transfekterte celler (tabell S1). Uttømming av MTDH redusert kolonidannelse i celler som stabilt uttrykker MTDH shRNA sammenlignet med kontroll shRNA (figur 2A, B). Disse resultatene ble bekreftet ved hjelp av tre shRNA konstruksjoner rettet mot ulike regioner av MTDH. En lignende fenotype ble også observert på knockdown av MTDH i Ishikawa H Type I livmorkreftceller, noe som indikerer at forhøyet MTDH uttrykk er vanligvis nødvendig for livmorkreft kolonidannelse.
Hec50co celler ble transfektert med kontroll eller MTDH shRNA ekspresjonsvektorer . (A) Kolonier dannet ved kontroll eller MTDH shRNA-transfekterte Hec50co-celler er vist etter transfeksjon av shRNAs og etter seleksjon med 2 ug /ml puromycin i 3 uker. (B) Kvantifisering av den relative kolonidannelse i kontroll versus MTDH knockdown Hec50co celler.
Identifikasjon av MTDH regulerte gener i livmorkreft cellelinjer
For å identifisere nedstrøms gener mediere tumorigent effekter av MTDH i livmorkreft cellelinjer, ble Affymetrix oligonukleotid mikromatriser (menneskelig gen matrise 1,0 ST) brukes til å oppdage differensielt uttrykte gener i Hec50co celler stabilt transfektert med enten MTDH shRNA eller en kontroll shRNA (data er blitt deponert på GEO, GSE26134) . Uttømming av MTDH ved knockdown resulterte i at minst to-ganger-genekspresjon endring av 57 gener (figur 3A). Flere av disse genene ble tilfeldig valgt å bekrefte endringene ved QRT-PCR (figur 3B).
(A) Varme kartet over to ganger endring av genuttrykk (bestemt fra Affymetrix rekkedata) mellom kontroll og MTDH knockdown Hec50co celler. (B) genekspresjon endringer ble validert ved QRT-PCR for de angitte gener identifisert i microarray (* p 0,05). (C) uttrykk og /eller fosforylering av de angitte proteiner ble undersøkt i Hec50co celler som stabilt uttrykker enten kontroll shRNA eller MTDH shRNA. Total PDK1 og β-actin ble brukt som laste kontroller. (D, E) Uttrykk for PIP3 ble oppdaget i kontrollen (D) eller MTDH knockdown (E) Hec50co celler ved PIP3 immun-fluorescerende flekker.
Data fra tabellen indikerte at MTDH regulerer uttrykket av gener involvert i invasjon, tett veikryss, samt chemoresistance (tabell S1 og S2). For eksempel, galectin-en (LGALS1) og calbindin 1 (Calb1) var betydelig nedregulert på mRNA (Figur 3B) og proteinnivåer (figur 3C) i MTDH shRNA-transfekterte Hec50co celler. Calb1 og galectin-1 er to mulige MTDH nedstrøms gener som kan regulere metabolismen av fosfatidylinositol, som er en del av PI3K /AKT-signalreaksjonsveien som vanligvis oppregulert i livmorkreft [23]. Vi undersøkte også endringer i genuttrykk i Ishikawa H livmorkreftceller i respons til MTDH taushet observert noe overlapping med gener som ble endret i Hec50co celler (tabell S3 og S4).
neste søkt å forstå hvordan MTDH regulerer PI3K /Akt veien. Ekspresjon av galectin-1 oppreguleres på forskjellige typer av tumorer og er rapportert å formidle tumorinvasjon og metastase ved å øke ekspresjonen av matriks metalloproteinase MMP-9 og MMP-2 og fremme reorganisering av aktin cytoskjelettet [24]. I samsvar med en tidligere studie hvor overekspresjon av MTDH fremmer aktivering av PI3K /AKT-reaksjonsveien i neuroblastom [7], vi har oppdaget en inhibering av komponenter av PI3K /AKT-signalveien i Hec50co celler med utarmet MTDH sammenlignet med kontroll (figur 3C) . Nærmere bestemt, en dramatisk reduksjon i PDK1 fosforylering ved S241 og AKT-fosforylering ved både T308 og S473 forekom i MTDH knockdown-celler, selv om ingen signifikant endring i total PDK1 proteinnivå ble påvist (figur 3C). Videre, som vist i figur 3D og E, ble en dramatisk reduksjon i nivået av PIP3 detektert i Hec50co celler med MTDH shRNA i forhold til celler med kontroll shRNA. Disse funnene viser at MTDH kan aktivere pro-overlevelse veier av PI3K /AKT via oppregulering av PIP3.
MTDH knockdown sensitizes celler til målrettede kreft terapier
For å overvinne motstand mot terapi, HDAC inhibitorer så som LBH589 har blitt brukt til å gjenopprette TRAIL-fremkalt apoptose i forskjellige typer av kreft [18], [19]. Hec50co celler ble tidligere vist å være resistente mot TRAIL-mediert apoptose [13]. Derfor, for å teste innvirkningen av MTDH på følsomhet for TRAIL i disse celler, behandlet vi Hec50co celler med eller uten MTDH (kontroll vs. MTDH knockdown) med kombinerte TRAIL og LBH589 behandling i tre dager og deretter undersøkt celleviabilitet. Sammenlignet med egge shRNA transfektert Hec50co celler, stabil MTDH knockdown beskjedent økte følsomheten Hec50co celler til monoterapi terapi (enten LBH589 eller TRAIL alene, 4A, B). Imidlertid, som vist i figur 4B, er en mer dramatisk induksjon av følsomhet forekom i stabil MTDH knockdown Hec50co celler med en kombinasjon av LBH589 og TRAIL. Disse data tyder på at MTDH uttrykk er en viktig faktor bak motstanden mot den kombinerte diett.
(A) Celledød induksjon av LBH589 som monoterapi ble påvist i kontroll eller MTDH knockdown Hec50co celler. Etter 3 dager ble celledød bestemt ved WST-1-metode. (B) Cell død som følge av ulike konsentrasjoner av TRAIL (5 til 50 ng /ml) alene eller i kombinasjon med 5 nM LBH589 ble analysert i kontroll eller MTDH knockdown Hec50co celler.
apoptose regulatorer involvert i MTDH-mediert celledød
for å studere molekylære mekanismen av celledød i MTDH knockdown celler, ble uttrykket av proteiner assosiert med apoptose (både pro- og anti-apoptotiske faktorer) testet i MTDH kontroll og knockdown celler etter enkelt behandling (LBH589 eller TRAIL) eller etter kombinert behandling (LBH589 og TRAIL). Kombinasjonen behandling ikke øke ekspresjon av stien reseptorer DR4 og DR5. I tillegg var det ingen endringer i uttrykket av anti-apoptotiske gener BCL-XL, MCL-en, eller FLIP i MTDH kontroll og knockdown Hec50co celler etter kombinatorisk behandling (figur 5).
Kontroll eller MTDH knockdown Hec50co cellene ble behandlet i 24 timer med bærerkontroll, 20 nM LBH589, 25 ng /ml TRAIL eller LBH589 og TRAIL ved de konsentrasjoner som er angitt. Lysater ble oppsamlet. Uttrykk av DR4, DR5, og apoptose relaterte caspase-3, caspase-8, PARP-1, BID, FLIP, XIAP, Bim, MCL-en og BCL-XL ble analysert ved Western blotting.
det er interessant at pro-apoptotiske BH3-proteinet bare Bim var oppregulert i ubehandlet MTDH knockdown Hec50co celler sammenlignet med kontrollceller (figur 5), noe som indikerer at nedbrytning av MTDH alene kan føre til induksjon av pro-apoptotiske faktorer. Når kontroll Hec50co celler ble behandlet med LBH589 alene eller i kombinasjon med TRAIL, ekspresjon av Bim økt. I kontrast, uttrykk for Bim ble betydelig forbedret i MTDH knockdown Hec50co celler uten behandling, mens behandling med enten LBH589 eller TRAIL ytterligere forbedret uttrykk for Bim. Men Bim uttrykk ble svakt redusert i MTDH knockdown celler etter samtidig behandling med LBH589 og TRAIL.
I kontrollceller, post-translasjonell modifikasjon av XIAP skjedde ved behandling med LBH589, som demonstrert av en høyere trekkende arter, og reduksjon av både totalt og modifiserte XIAP ble bare påvist med LBH589 og TRAIL kombinasjonsbehandling (figur 5). Denne effekten ble forsterket da MTDH ble slått ned, slik at vi har oppdaget en større reduksjon i XIAP post-translasjonell modifikasjon i MTDH knockdown Hec50co celler sammenlignet med kontrollceller etter LBH589 og TRAIL behandling. Videre ble signifikant induksjon av spalting av kaspase-8, caspase-3 og PARP-1 detektert etter en enkelt behandling med LBH589 eller TRAIL, eller en kombinasjon i MTDH knockdown Hec50co celler sammenlignet med kontrollceller. Reduksjon av budet ble også observert i MTDH knockdown celler behandlet med kombinasjonen av LBH589 og TRAIL. Sammen er disse dataene viser at knockdown av MTDH kan øke ytre apoptose indusert av TRAIL og LBH589, og rektor mekanismen er via oppregulering av Bim. Nedregulering av XIAP og påfølgende aktivering av caspase-8 og caspase-3 samt nedstrøms underlag som PARP-1 forekommer også.
Cellesyklus sjekkpunkt regulering av MTDH
For å bestemme den nøyaktige mekanisme som MTDH gir resistens mot TRAIL og LBH589 behandling, ved siden undersøkte vi rolle MTDH i cellesykluskontroll. Kontroll og MTDH knockdown Hec50co celler som var ubehandlet eller behandlet med TRAIL alene hadde lignende cellesyklus profiler (Figur 6A). I motsetning til dette, behandling med HDAC-inhibitoren LBH589 i celler som mangler MTDH resulterte i en større andel av celler vedvarende i G2 /M-fasen. Når Hec50co MTDH knockdown-celler ble behandlet med både LBH589 og TRAIL, en redusert andel av cellene i S-fasen, og en øket andel av celler ble arrestert i G2 /M (fig. 6A). Disse dataene viser at MTDH har en betydelig rolle i regulering av cellesyklus sjekkpunkt i sammenheng med kombi TRAIL og HDAC hemmer behandling.
(A) Cell sykkelprofiler ble bestemt i kontroll eller MTDH knockdown Hec50co celler på 24 timer etter behandling med 20 nM LBH589, 25 ng /ml TRAIL, eller LBH589 og TRAIL i kombinasjon. Prosentandelen av celler i G1, ble S og G2 /M-fasene bestemt. (B) Endringen i Aurora A, Aurora B, p21, histon H3-acetylering i lysin 9, histon H3 fosforylering ved serin 10 og total histon H3 ble vurdert ved Western blotting etter 24 timers behandling med de angitte reagenser. Total histon H3 ble anvendt som en kontroll lasting. (C) En modell for de belyses mekanismen som knockdown av MTDH øker celledød av TRAIL og den HDAC-inhibitor LBH589. MTDH knockdown reduserer fosforyleringen av PDK1 og dets substrat AKT, noe som resulterer i økt ekspresjon av proteinet proapoptotiske Bim. XIAP uttrykk er nedregulert som reaksjon på kombinerte LBH589 og TRAIL-behandling, for derved å frigjøre XIAP hemming av caspase-3 og -8 aktivering. Kollektivt, regulering av disse banene fremmer apoptotisk celledød.
For å undersøke mekanismen som MTDH regulerer cellesyklus, uttrykk for cellesyklus regulatorer ble målt. Økning av Aurora A på proteinnivået ble observert i MTDH knockdown celler sammenlignet med kontrollceller (Figur 6B). Når kontroll og MTDH knockdown Hec50co celler ble utsatt for LBH589, var det en økning i Aurora A, Aurora B, acetylering av histon H3 på lysin 9, fosforylering av histon H3 på serin 10, og p53-uavhengig oppregulering av p21 WAF1, inhibitoren av cyclin-avhengige kinaser (figur 6B). Interessant, TRAIL behandling resulterte i en betydelig reduksjon i histon H3 fosforylering, noe som tilsvarte en reduksjon i prosentandelen av celler i G2 /M fase sammenlignet med ubehandlede celler. Samlet disse dataene implisere en ny rolle for MTDH i å regulere cellesyklus sjekkpunkter.
Diskusjoner
Selv om MTDH har vært knyttet til både metastasering og motstand mot kjemoterapi i ulike typer kreft [1], [ ,,,0],25], er mekanismen og biologisk funksjon av MTDH stort sett ukjent. Uttømming av MTDH kan forsterke virkningene av kjemoterapeutiske legemidler, slik som doxorubicin, paclitaxel og 5-FU [10], [11]. Her kan vi rapportere at uttrykk for MTDH er sterkt forhøyet i livmorkreft vev i forhold til normal endometrium. Våre data viser at uttømming av MTDH med en bestemt shRNA kan også øke cellular følsomhet for målrettet terapi, inkludert HDAC hemmer LBH589, TRAIL og et kombinasjonsregime med både agenter. Som vist i figur 6C, har vi identifisert potensialet mekanismen som knockdown av MTDH øker celledød i respons til behandling med TRAIL og den HDAC-inhibitor LBH589. Nærmere bestemt, har celler som mangler MTDH redusert fosforylering av PDK1 og dets substrat AKT, som i sin tur stimulerer ekspresjon av proteinet proapoptotiske Bim. Kombinert LBH589 og TRAIL behandling resulterer i nedregulering av XIAP, og dermed gir aktivering av caspase-3 og -8. Disse molekylære endringer medfører apoptotisk celledød i celler som mangler MTDH. Våre data tyder derfor på at MTDH-mediert resistens oppstår gjennom aktivering av pro-overlevelse signalveier og potensielt av avvikende regulering av cellesyklus sjekkpunkter.
Ved hjelp av en microarray tilnærming, vi identifisert mange kandidat gener som er forskjellig regulert i celler mangler (MTDH shRNA) eller uttrykke (kontroll shRNA) MTDH. Av spesiell interesse var calbindin 1 (CALB1) og galectin-en, to proteiner som tidligere har vært knyttet til pro-overlevelse signalveier. CALB1 er et kalsiumbindende protein med fire aktiv kalsiumbindingsdomener. CALB1 ble rapportert til å samhandle med Myo-inositol monophosphatase (IMPA) ved hjelp av fag-display og å indusere IMPA aktivitet opptil 250 ganger [26], [27]. IMPA er et enzym som dephosphorylates myo-inositol-monofosfat, myo-inositol-1,3-difosfat, og myo-inositol-1,4-difosfat å generere fri myo-inositol som spiller viktig rolle i programmert celledød [28]. Galectin-1, en beta-galaktosidase-bindende protein, er sterkt uttrykt i en rekke humane kreftformer og har vist seg å spille en rolle i signalisering PI3K og Akt-aktivering [29]. I glioblastom-celler, knockdown av galectin-1 svekker evnen til insulin-lignende vekstfaktor (IGF1) stimulering for å heve cellulære PIP3 nivåer (Perry et al., 2010, AACR 101
st årsmøtet abstrakt 301). Våre data indikerer at MTDH-mediert oppregulering av galectin-1 og CALB1 kan være mekanismen som MTDH stimulerer en økning i PIP3 nivåer, for derved å aktivere den PI3K /AKT /mTOR pathway. Denne reaksjonsvei spiller en viktig rolle i endometrial karsinogenese, enten ved mutasjon av PTEN, eller ved andre mekanismer, er konstitutiv aktivering regelen. Vår identifikasjon av over-uttrykk for MTDH fører til økt PIP3 nivåer gir enda en potensiell forklaring på den høye aktiviteten i PI3K og AKT ofte funnet i livmorkreft.
Hemming av MTDH ble vist å øke celledød indusert av LBH589 og TRAIL kombinasjonsbehandling (figur 4). TRAIL kan indusere ytre apoptose via direkte binding med dødsreseptorer. Imidlertid, mens TRAIL kan selektivt indusere apoptose i endometrial kreft celler, kan den ikke indusere apoptose i normale endometriale vev ved samme konsentrasjon. Videre vil konsentrasjonen av TRAIL (200 ng /ml) er nødvendig for å indusere apoptose i kreftceller endometrial er mye høyere enn det som tidligere ble brukt for celler fra andre solide tumorer (for eksempel 25-50 ng /ml i bukspyttkjertelkreft) [13], [ ,,,0],30]. Dette indikerer potensiell baseline motstand mot TRAIL i livmorkreft som kan være knyttet til høy MTDH uttrykk. For å overvinne motstand, har flere kjemoterapi eller målrettede hemmere som har blitt rapportert å øke følsomheten for TRAIL-indusert apoptose blitt brukt i kombinatoriske regimer [12]. Her viser vi at HDAC hemmer LBH589 kan øke TRAIL-mediert caspase-8 aktivering og påfølgende ytre celledød i endometrial kreft celler. Knockdown av MTDH kan ytterligere stimulere caspase-8-spaltningssete indusert ved LBH589, TRAIL, eller en kombinasjon av de to. En økning i XIAP post-oversettelse modifikasjon, en reduksjon i total XIAP, og induksjon av apoptose pro-genet Bim ble observert i celler behandlet med den LBH589 alene. Tap av bud ble observert i MTDH knockdown celler etter LBH589 og TRAIL kombinasjonsbehandling, noe som sannsynligvis skyldes Bud aktivering via cleavage. Funnet av redusert Bim med samme behandling var noe uventet. Imidlertid våre data på figur 3 tyder på at MTDH knockdown regulerer negativt Akt veien, noe som i første omgang kan resultere i forhøyet ekspresjon av Bim. Som celler fremgang gjennom apoptose, kan mindre stabile proteiner være gjenstand for degradering. Siden MTDH knockdown-celler har akselerert celledød i respons til kombinasjonsbehandling (figur 4), er det mulig at reduksjonen i Bim er en refleksjon av hurtig protein omsetningen.
I respons på LBH589 behandling alene eller med TRAIL de to viktigste virkninger av MTDH knockdown på cellesyklusen var en reduksjon i prosentandelen av celler i S og en samtidig økning i prosentandelen av celler i G2 /M, hvor cellene ser ut til å bli arrestert. På cellenivå, men knockdown MTDH alene i fravær av behandlingen ikke påvirke ekspresjonen av kanoniske cellesyklusregulerende proteiner. For eksempel, LBH589 betydelig forbedret histon H3-acetylering på lysin 9 (figur 6B), som kan tillate den transkripsjonelle aktivering av p21-genet [31]. Men H3 endringen ble ikke påvirket av shRNA knockdown av MTDH. Proteasome-mediert degradering av Aurora A, Aurora B og c-FLIP ble rapportert å være ansvarlig for økningen i følsomhet for TRAIL av HDAC hemmer behandling i enkelte kreftceller [15], [32]. Imidlertid ble det ikke observert noen signifikante endringer i Aurora A og B eller C-FLIP nivåer i livmorkreftceller behandlet med LBH589 i våre studier.
Dette er den første rapporten om MTDH innvirkning på motstand i målrettet behandling for livmorkreft . For disse studiene, valgte vi en kombinasjon av LBH589 og TRAIL grunn av virkningen av disse midlene på proapoptotiske veier. Vi viser her at knockdown av MTDH sensitizes celler til programmert celledød om en mekanisme som involverer hemming av PDK1 og Akt fosforylering, økning i Bim, og reduksjon i XIAP. Derfor kan vi målrette MTDH for å forbedre følsomheten til ikke bare kjemoterapi, men også målrettede midler som virker gjennom programmert celledød. Disse dataene gir overbevisende bevis for at, ved downregulating MTDH i livmorkreft, kan vi foredle apoptosiske trasé og respons på behandling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Normal livmor vev og endometrial vev fra livmorkreft ble samlet med samtykke fra pasienter under University of Iowa Institutional Review Boards godkjent protokoll. Vi innhentet informert skriftlig samtykke fra alle deltakerne i denne studien.
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelivmorkreft cellelinjer Hec50co, RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa H, og KLE ble opprettholdt som tidligere beskrevet [33]. Celler ble dyrket i DMEM medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin (alt fra Gibco BRL, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft. For å generere en MTDH knockdown modell, ble Hec50co celler transfektert med MTDH sh RNA eller styre ikke-tie shRNA konstruerer per produsentens instruksjoner (ORIGENE, Rockville, MD). Individuelle cellekloner resistente mot puromycin ble utvidet og utsatt for screening for MTDH uttrykk ved Western blotting.
Endometrial vev og vev Arrays
Normal endometrial vev og endometrial vev fra livmorkreft ble samlet inn fra universitetet av Iowa Sykehus og klinikker. Endometrial sykdom spektrum (livmorkreft progresjon) vev array (UT 801) ble kjøpt fra USA Biomaks, Inc. (Rockville, MD).
reagenser, Antistoffer og Western blotting
Menneskelig rekombinant TRAIL (TNF-relatert apoptose induserende ligand) ble innkjøpt fra R og anti-spaltet caspase-3, caspase-8, DR4, DR5, Bim, Bud, FLIP, XIAP, p21, PARP-1 p-AKT S473, p-AKT T308, PDK1, p-PDK1 S204, histon 3, p -histone 3 serine10 og histon 3 lysin 9 acetylering antistoffer var fra Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA). Hel-celle protein lysatene ble utarbeidet og analysert ved Western blotting som tidligere beskrevet [34].
Expression Array og RT-qPCR analyse
Total RNA ble isolert fra MTDH knockdown og kontrollere livmorkreft celle linjer (i biologiske triplicates for kontroll og MTDH knockdown celler) ved hjelp av
mir
Vana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX), og cDNA ble generert ved hjelp av High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Et menneske genet matrise 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA) ble avhørt ved hjelp av biologiske triplicates i DNA Kjerne Facility ved University of Iowa, og Partek Genomics Suite (Partek Inc, St. Louis, MO) programmet ble brukt til å generere genekspresjon verdier. Alle data er MIAME kompatibel og rådata har blitt deponert i en MIAME klage database GEO, som detalj på nettsiden https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi?acc= GSE26134. Sjonsnummer for Hec50co celler er GSE26134 og for Ishikawa H celler er GSE27828. Flere MTDH nedstrømsgener ble tilfeldig valgt å validere microarray data ved hjelp av TaqMan primere og prober (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) for kvantitativ RT-PCR-analyse.
