Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste kreftformer, men de nåværende terapeutiske tilnærminger for avansert CRC er mindre effektive. Dermed er nye terapeutiske tilnærminger sårt trengte. Hensikten med denne studien er å undersøke involvering av kjernefysiske protein kinase CK2 α-subenheten (CK2α) i tumor progresjon, og i prognosen av menneskelig CRC.
Metodikk /hovedfunnene
Expression nivåer av kjernefysisk CK2α ble analysert i 245 kolorektal vev fra pasienter med CRC ved immunhistokjemi, kvantitativ real-time PCR og Western blot. Vi korrelert uttrykket nivåer med clinicopathologic parametre og prognose i humane CRC pasienter. Overekspresjon av atom CK2α var signifikant korrelert med dybden av invasjonen, lymfeknutestatus, amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) iscenesettelse, grad av differensiering, og perinevral invasjon. Pasienter med høyt uttrykk nivåer av kjernefysisk CK2α hatt en vesentlig dårligere total overlevelsesrate sammenlignet med pasienter med lave nivåer av atom CK2α. I multi-varians Cox regresjonsanalyse, ble overekspresjon av kjernefysisk CK2α vist seg å være en uavhengig prognostisk markør for CRC. I tillegg ble DLD-1 humane kolonkreftceller anvendes som en cellulær modell for å studere rollen til CK2α på cellevekst og ekspresjon av CK2α i DLD-1-celler ble inhibert ved hjelp av siRNA-teknologi. Dataene indikerte at CK2α spesifikke siRNA behandling resulterte i veksthemming.
Konklusjon /Betydning
Til sammen kan overekspresjon av kjernefysisk CK2α være en nyttig markør for å forutsi utfallet av pasienter med CRC.
Citation: Lin KY, Tai C, Hsu JC, Li CF, Fang CL, Lai HC, et al. (2011) Overuttrykte Nuclear Protein Kinase CK2 α Catalytic subenhet (CK2α) som en dårlig prognosticator i Human tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (2): e17193. doi: 10,1371 /journal.pone.0017193
Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 11. august 2010. Godkjent: 25 januar 2011; Publisert: 17 februar 2011
Copyright: © 2011 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (DOH98-TD-i-111-TM006) fra Department of Health, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) sto for om lag 1 million nye tilfeller i 2002 (9,4% av verdens totale), og i motsetning til de fleste områder, tallene var ikke så forskjellig hos menn og kvinner (ratio, 1.2:1) [1]. Når det gjelder forekomst, rangerer CRC fjerde i frekvens hos menn og tredje hos kvinner. Det er i det minste en 25-gangers variasjon i forekomst av CRC over hele verden. Den høyeste forekomsten er i Nord-Amerika, Vest-Europa, og i menn spesielt, Japan. Forekomsten har en tendens til å være lav i Afrika og mellom i sørlige deler av Sør-Amerika. I Taiwan, CRC rangert som den nest hyppigst diagnostisert kreft og fører til mer enn 10000 dødsfall årlig (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm, åpnes i desember 2008). Til tross for dagens kirurgiske teknikker og kjemoterapi som har gjort betydelige forbedringer, forblir kur rate for avansert CRC lav og sykelighet er fortsatt høy [2]. Dermed fremskritt i behandlingen av denne sykdommen er sannsynlig å komme fra en fyldigere forståelse av patogenesen og biologiske egenskaper.
Prognose av nydiagnostiserte CRC hovedsakelig baserer seg på det amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) scenen bestemmes av dybden av invasjonen, involvering av lymfeknuter, og fjernmetastaser [3], [4]. Men i virkeligheten, er det vel kjent at pasienter med samme AJCC stadium CRC skjerm overlevelse heterogenitet, med noen pasienter som oppviser forholdsvis korte overlevelsestid. Følgelig identifisering av mer lovende prognostiske faktorer som er faktisk svært forutsigbare for CRC pasienter som gjennomgår kirurgisk behandling er obligatorisk. Mange studier har antydet den rollen som genetiske endringer kan ha i utvikling og progresjon av CRC [5], [6]. Molekyl patologi kan være nyttig ikke bare for å forstå sykdommen patogenese, men også for å gi nyttige prognostiske molekylære markører. Noen foreslåtte biologiske prognostiske faktorer omfatter overekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), Enhancer av Zeste homolog 2 og transglutaminase 2 [7] -. [9]
Protein kinase CK2 (tidligere kjent som kasein kinase 2) er en svært konservert serin /treonin kinase. Det er fordelt overalt i eukaryote organismer, hvor det som oftest ser ut til å eksistere i tetramer komplekser som består av to katalytiske subenheter (αα, α «α» eller αα «) og to regulerings p-subenheter [10], [11]. CK2 er en bemerkelsesverdig multifunksjonell proteinkinase med et stort utvalg av mer enn 300 substrater, hvorav mange er kritisk involvert i prosessen med cellevekst, proliferasjon, differensiering og [12], [13]. Forstyrrelse av
Saccharomyces cerevisiae
gener som koder for både CK2 katalytiske subenheter fører til en svikt i utvikling, og den demonstrasjon at knockout av genet som koder for det regulatoriske CK2 β subenhet i mus er også dødelig forsterker viktigheten av CK2 i vedlikeholds av cellelevedyktighet i normal cellelivet og i løpet av embryogenesen [14], [15]. I β-underenheten, kan visse cysteinresiduer spille en rolle i å forankre kinase for å atomstrukturer. CK2 aktivitet kan ha en rolle i cellevekst gjennom sin signal til viktige områder i atom matrise og kromatin strukturer [16]. Flere vekst stimuli kan forbedre CK2 atomskyt, slik at høyere nukleære lokaliserings er observert i tumorceller sammenlignet med normale celler [17], [18].
Videre CK2 feilregulering i tumorceller kan påvirke den apoptotiske aktivitet og for å forbedre celleoverlevelse [19]. CK2 kan utøve antiapoptotic effekter gjennom ulike mekanismer. For eksempel, CK2 motvirke apoptose ved å beskytte Bid fra tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) -indusert caspase-8-mediert degradering [20]. CK2 er også involvert i fosforylering av flere proteiner forbundet med apoptose, inkludert p53and nukleær faktor-kB [21], [22]. I tillegg er Fas-reseptor-mediert celledød reguleres ved CK2 uttrykk [23].
Nivået av CK2 synes å være strengt regulert i normale celler og motstår en endring i deres indre nivå av CK2 [24]. Økende bevis indikerer at CK2 enzymet er en komponent av regulerings proteinkinase-nettverk som er involvert i flere aspekter av cellulær transformasjon og kreft [25]. Økninger i CK2 nivå og aktivitet er konsekvent blitt observert i en rekke humane kreftformer, inkludert brystkjertel, hode og nakke, og nyrekreft [26] – [28]. Overekspresjon og prognostisk betydning CK2 α subenhet har bare blitt observert i lungekreft, prostatakreft og leukemi [29] – [31]. Så vidt vi vet, er uttrykket og prognostisk betydning av atom CK2α i menneskelig CRC fortsatt ukjent. Målet med denne studien var å undersøke sammenhengen mellom atom CK2α uttrykk og clinicopathologic parametre og prognose i menneskelige CRC pasienter. Vi vurderte også effekten av siRNA-hemmet CK2α uttrykk på spredning av tykktarmskreftceller.
Resultater
Grunndata
To hundre og førtifem CRC pasienter, 139 menn og 106 kvinner, ble inkludert i studien. Alder varierte fra 21 til 88 år åringer ved første diagnose (gjennomsnitt 64 år). Basert på AJCC klassifisering, var det 36 scene I pasienter, 98 stadium II pasienter, 110 stadium III pasienter, og en scene IV pasient. Oppfølging for disse pasientene varierte fra 2,93 til 123.97 måneder (gjennomsnittlig 68,3 måneder). Under oppfølging, 69 pasienter døde av CRC. Postoperative komplikasjoner skjedde ikke hos disse pasientene.
Nuclear CK2α uttrykk ble oppregulert og forbundet med flere clinicopathologic parametre i CRC
Vi undersøkte uttrykk for atom CK2α i 245 CRC pasienter ved immunhistokjemi, og i fire pasienter ved Western blot. Resultatene indikerte at atom CK2α ekspresjon var høyere i tumorvev enn i ikke-tumorvev (figur 1). I tillegg kvantitativ real-time PCR-analyse viste at ekspresjon av CK2α ble vesentlig øket i tumorvev sammenlignet med ikke-tumorvev (tabell 1). Som vist i tabell 2, kjernekraft CK2α uttrykk hadde en statistisk signifikant sammenheng med dybde på invasjon (
P
= 0,008), lymfeknutestatus (
P
0,001), AJCC staging (
P
0,001), grad av differensiering (
P
= 0,011), og perinevral invasjon (
P
= 0,041). De representative mikrofotografier av atom CK2α uttrykk for ulike parametere ble vist i Figur 2. Det var ingen signifikant sammenheng mellom kjernekraft CK2α uttrykk og alder, kjønn og vaskulær invasjon.
Nuclear CK2α uttrykk i ikke-tumor og tumorvev , analysert ved hjelp av immunhistokjemi, som ble vist i panel A og B, respektivt. Forstørrelse: 400 ×. Panel C. Nuclear CK2α uttrykk i fire ikke-tumor /svulst parene ble undersøkt med Western blot
Forstørrelse:.. 400 ×
Overuttrykte av kjernefysisk CK2α som en uavhengig prognostisk markør for CRC
Korrelasjoner av kliniske resultater med atom CK2α uttrykk er vist i figur 3. Inferior total overlevelse var signifikant assosiert med overekspresjon av kjerne CK2α (mener merking index 40%,
P
0,0001). Pasienter med høy uttrykk nivåer av kjernefysisk CK2α hadde en ti-års total overlevelsesrate på 22,2% sammenlignet med 72,5% for pasienter med lave nivåer av atom CK2α.
Alle statistiske tester var tosidig. Signifikansnivå.
P
0,05
uni-varians analyse av prognostiske markører for CRC er oppsummert i tabell 3. Nodal status (
P
= 0,025) og overekspresjon av kjerne CK2α (
P
0.0001) ble korrelerte signifikant med total overlevelse
Denne foreningen mellom overekspresjon av kjernefysisk CK2α og overlevelse forble selv etter kontroll for andre. velkjent prognostiske markører i multi-varians-analyse (tabell 4). I multi-varians analyse, overekspresjon av kjernefysisk CK2α var prognostisk uavhengig (hazard ratio = 4,53, 95% konfidensintervall = 2,46 til 8,32,
P
0,0001).
Effect av slå ned på CK2α på tykktarmskreft celleproliferasjon
for å bestemme effekten av CK2α uttrykk på DLD-en human tykktarmskreft celleproliferasjon,
CK2
α genet ble slått ned ved transfeksjon av CK2α- spesifikke siRNA. Egge sirnas ble brukt som kontroller. Etter CK2α spesifikke siRNA behandling, uttrykket nivået av atom CK2α i DLD-1 celler ble betydelig hemmet (Figur 4A). Imidlertid, egge siRNA førte ikke til noen signifikant inhibering (figur 4A). Vi telles antall kolonier av siRNA-behandlede og un-behandlet DLD-1 celler. Kolonier av CK2α-spesifikke siRNA-behandlede celler var betydelig færre enn for ubehandlet og egge siRNA-behandlede celler (redusert til 33% (dag 8) og 57% (dag 14) av de av un-behandlede celler, henholdsvis ) (figur 4B). De representative mikrofotografier ble vist i figur 4C. Resultatene indikerte en rolle CK2α fremme celleproliferasjon og er konsistent med kliniske data som er beskrevet ovenfor.
Panel A. Nuclear CK2α uttrykk i siRNA behandlet og ubehandlet DLD-1 kolon kreftceller ble undersøkt av Western blot-analyse. Panel B. Histograms representerer celleproliferasjonsprosesser analyseresultatene basert på gjennomsnittet av tre uavhengige forsøk. * Angir
P
0,001 sammenlignet med ubehandlet DLD-1 celler. Panel C. De representative mikrofotografier.
Diskusjoner
Forhøyet CK2α mRNA nivået har blitt rapportert i flere humane kreftformer, inkludert melanom og lungekreft [32], [33]. Men til tross for disse studiene, kliniske data som arbeider med spesifikk ekspresjon av CK2α på proteinnivået er mangelvare. En fersk studie viste forhøyet CK2α protein uttrykk i prostata kreft [30]. Så vidt vi vet, er dette den eneste studie med immunhistokjemi for å vurdere CK2α uttrykk i kreft hos mennesker. Ekspresjonen av atom CK2α i human CRC er fortsatt ukjent. I denne studien, ble uttrykket nivåer av atom CK2α i kolorektal vev fra 245 pasienter med CRC vurdert, og resultatene viste at kjernefysisk CK2α uttrykk var høyere i tumor kolorektal vev enn i ikke-tumor kolorektal vev.
i tillegg er våre data viste CK2α atom opphopning i CRC, i samsvar med tidligere studie gjennomført i prostatakreft. Det mekanistiske grunnlag av CK2α atom opphopning er foreløpig uklart, men, som en CK2 katalytisk subenhet, dens kontinuerlig tilstedeværelse i kjernen kan ikke bare være relatert til øket proliferativ kapasitet av dedifferensierte tumorceller, men også til deres markert motstand mot apoptotiske signaler. Hva kan være funksjonell konsekvens av atom opphopning av CK2 i kreftceller? En studie utført av Scaglioni et al. viste at CK2 fosforylert den promyelocytisk leukemi protein (PML, en tumor suppressor) og rettet mot den for nedbrytning av proteasomet [34]. Tap av kritiske CK2 fosforyleringssetet i PML resulterte i stabilisering av dette protein, forbedring av PML-indusert apoptose. Videre, i human ikke-småcellet lungekreft, er det et omvendt forhold mellom PML ekspresjon og CK2 aktivitet. Siden PML er en kjernefysisk-matrise-assosiert protein, kan en kjernefysisk opphopning av CK2 være funksjonelt relevant å inaktivere kreftundertrykkende funksjoner av PML. I en annen studie er CK2 nylig blitt beskrevet som en viktig regulator av tumor suppressor NKX3.1 i LNCaP prostatakreftceller. Som PML, ble det funnet at blokkering CK2 aktivitet i LNCaP celler med inhibitor apigenin førte til en rask reduksjon i NKX3.1 opphopning som ble reddet av proteasomhemmingen [35].
I denne studien har vi demonstrert for første gang at overekspresjon av atom CK2α i CRC vev ble korrelert med flere clinicopathologic parametere inkludert dybden av tumorinvasjon, lymfeknutemetastase, og perinevral invasjon. Selv om mekanismene bak disse assosiasjonene er fortsatt uklart, vil flere linjer med bevis for disse korrelasjoner bli diskutert i nedenfor. For det første bevis for sammenhengen mellom overekspresjon av kjerne CK2 og dybden av invasjon kommer fra matriks-metalloproteinaser (MMP), som lenge har vært assosiert med cancer-celleinvasjon og metastase [36]. En fersk studie viste at PC-3 menneskelige prostata kreft celler over-uttrykker membran type-1 matriksmetalloproteinase (MT1-MMP) vokste raskere enn mock-transfektert kontrollceller [37]. Dette resultatet antydet at invasjonen fremmende MT1-MMP er direkte knyttet til tumor aggressivitet. Genome-wide uttrykk profilering av MT1-MMP-overekspresjon versus MT1-MMP-forstummet kreftceller og en ytterligere data mining analyse av allerede eksisterende uttrykk database med 190 humane tumorer av 14 krefttyper ledet til å identifisere 11 gener, inkludert CK2 er uttrykk for som korrelert godt og universelt med at av MT1-MMP [38]. For det andre, ved hjelp av immunohistokjemi, assosiasjonen mellom VEGF-C og utviklingen av lymfeknutemetastase er blitt beskrevet av Yonemura Y et al [39]. Som svar på hypoksi, skjedde i de fleste svulster dyrket større enn 1 mm
3, kan uttrykket av VEGF-C bli stimulert av hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) [40]. Det ble vist at inhibitorer av CK2 blokkert aktivering av HIF-1, og deretter ekspresjon av VEGF-C [41]. Til slutt, den økte neurite formasjonen vist i de foregående
in vitro
studier tyder på at aksonal migrasjon kan være et nøkkelelement i perinevral invasjon. Aksonal vekst er en kompleks prosess som krever neurotrofiske vekstfaktorer og aksonale lede molekyler [42], [43]. En studie utført av Arevalo et al. viste at nervevekstfaktor, en av de neurotrofiske vekstfaktorer, kan stimulere vekst axon gjennom aktivering av CK2 [44].
Vårt studium har vist at overekspresjon av kjerne CK2α kan være en uavhengig prognostisk markør for CRC. Kliniske data som arbeider med den prognostiske verdi av CK2α er begrenset. Ved hjelp av global genekspresjon profilering, har CK2α genet blitt identifisert som en prognostisk markør hos pasienter med plateepitelkarsinom i lungene [29]. Laramas et al. gitt bevis for en sterk sammenheng mellom en kjernefysisk lokalisering av CK2α og dårlige prognostiske faktorer i menneskelig prostata kreft [30]. I tillegg har studier av Kim et al. viste at overekspresjon av CK2α protein i leukemi ble assosiert med dårlig pasient utfall [31]. Så vidt vi vet, er det ingen rapport nevne den prognostiske betydningen av kjernekraft CK2α i menneskelig CRC. Det er bemerkelsesverdig å observere at, for første gang, overekspresjon av kjerne CK2α kan være en uavhengig prognostisk markør for CRC. Overekspresjon av kjerne CK2α er derfor en nyttig markør for å forutsi utfallet av pasienter med CRC som hadde en kirurgisk reseksjon av tumoren. Pasientene med CRC viser overekspresjon av kjernefysisk CK2α bør følges opp nøye.
Materialer og metoder
forsøkspersonene
Pasienten kohorten besto 245 sammenhengende CRC saker fra 1998 til 2002 dokumentere patologiske og kliniske faktorer og kliniske utfall. Ingen av disse pasientene hadde fått preoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling. Den ikke-tumor del ble tatt fra grovt normal tykktarmsslimhinne bort fra tumor i resekterte kolorektale prøven. Clinicopathologic parametre for CRC ble bestemt i henhold til AJCC klassifisering. Oppfølgingen varighet ble definert som perioden mellom drift dato og dag i siste besøk, i henhold til pasientens journal. The Institutional Review Board på Chi-Mei Medical Center godkjent vevet oppkjøpet protokollen for å gjennomføre denne studien. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker før vev oppkjøpet. Tumor /non-tumor par av kolorektal vev ble analysert for atom CK2α uttrykk.
Immunhistokjemisk analyse
Nuclear CK2α uttrykk ble analysert ved immunhistokjemi. Parafininnstøpte vevsblokker ble delt på fem mikrometer og overført til objektglass (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan). Hepatom ble anvendt en positiv kontroll for CK2α. Den negative kontroll bestod av utelatelse av det primære antistoff og inkubasjon med fosfatbuffer saltvann. Etter rehyfration og gjenfinning antigen, ble antigenet sperre utført ved anvendelse av Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution (Dako, Carpinteria, CA) i 5 minutter. Platene ble deretter inkubert med et primært antistoff: polyklonalt anti-CK2α (Stressgen BioReagents, Victoria, Canada) i 30 minutter ved romtemperatur i en fortynning på 1:50. Påvisning av den immunreaktive farging ble utført av avidin-biotin-peroksidasekompleks fremgangsmåten i henhold til produsentens instruksjoner. En følsom Dako REAL EnVision Detection System (Dako) ble anvendt som påvisningssystemet. Etter inkubasjon med diaminobenzidin i 5-8 minutter, ble seksjonene motfarget og montert for mikroskopisk tolkning. Den immunoreaktivitets ble uavhengig scoret av to patologer (C-F Li og C-L fang). Prosentandelen av tumorceller med moderat eller sterk kjernekraft immunoreaktivitets ble spilt inn, og scorer fra samme pasient ble i gjennomsnitt å få en midlere atom CK2α merking indeksen. Cutoff av gjennomsnittet merking indeksen for å definere kjerne CK2α overekspresjon var atom reaktivitet i 40% celler (median verdi). Klinisk datainnsamling og immunhistokjemisk analyse ble utført uavhengig av hverandre, i en etterforsker-blindet studie.
RNA ekstraksjon og cDNA syntese
I henhold til produsentens instruksjoner, total RNA fra 10 svulsten og ikke -tumor par av kolorektal vev ble isolert ved hjelp av en RNA-ekstraksjon kit (Sigma, St. Louis, MO). RNA kvalitet ble analysert ved hjelp Agilant 2100 Bioanalyzer. De RIN verdier av alle 20 prøver var over 7. cDNA-syntese ble utført som beskrevet i vårt tidligere studium [45]. Syntetiserte cDNA ble lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Primere og prober
Taqman genuttrykk Analyser inkludert primere og prober av CK2α og β-aktin, en intern kontroll, ble kjøpt fra Applied Biosystems. Analysen antall CK2α og β-aktin var Hs00751002_s1, og Hs99999903_m1 hhv.
kvantitativ real-time PCR
uttrykk nivåer av målgener ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR i ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems), som beskrevet i vårt tidligere studium [45]. Terskelsyklus (
C
t
) er det brøkdelnummeret som fluorescensen som genereres ved spaltning av sonden overstiger et fast nivå over grunnlinjen. For en valgt terskel, et mindre start kopi nummer resulterer i en høyere
C
t
verdi. Mengden av CK2α mRNA i tumor eller ikke-tumorvev, standardisert mot mengden av β-aktin mRNA ble uttrykt som Δ
C
tumor
eller Δ
C
ikke-tumor
=
C
t
(CK2α) -.
C
t
(β-aktin)
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og siRNA behandling
Menneskelig tykktarmskreft cellelinje (DLD-1) ble hentet fra Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Moregate Biotech, Bulimba QLD, Australia), 100 enheter /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycin sulfat, og 250 ng /ml amfotericin B (alle fra Sigma). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. For siRNA behandling, ble cellene transfektert med 30 nM CK2α spesifikk eller egge siRNA (Applied Biosystems), ved hjelp av SIPORT NeoFX Transfeksjon Agent. 48 timer etter transfeksjon, ble kjerneproteiner ekstrahert, og deretter Western blot ble utført for å evaluere effekten av siRNA behandling.
Nuclear proteinpreparat
totalt cellulært vev og nukleære proteiner ble ekstrahert med NE -per Kjerne- og Cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil anvendelse. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av en BCA Protein Assay Kit (Pierce Bioteknologi) med bovint serumalbumin som en standard.
Immunoblotting
denaturert proteinprøver ble utsatt for 10% SDS-PAGE. Proteiner ble overført til nitrocellulosemembraner. Blokkerte Blottene ble inkubert ved romtemperatur natten over med anti-CK2α polyklonalt antistoff (1:161 fortynning). β-aktin (Sigma, 1:8000 fortynning) ble anvendt som en intern kontroll for likt protein lasting. Blottene ble inkubert ytterligere med sekundære antistoffer konjugert med peroksidase (Sigma) i 1 time ved romtemperatur. Forbedrede Chemiluminescence reagenser (Pierce Bioteknologi) ble anvendt for å visualisere de målrettede proteiner, som så ble semi-kvantitativt målt ved densitometri. Alle forsøkene ble utført tre ganger, uavhengig av hverandre.
celleproliferasjonsanalyse
Etter siRNA behandling, de transfekterte cellene ble dyrket i en 37 ° C, 5% CO
2 inkubator i 4 , 8 og 14 dager. Individuelle kolonier (mer enn 50 celler /koloni) ble fiksert, farget ved anvendelse av en løsning av 1% krystallfiolett i metanol i 30 minutter, og telles. Analysen ble foretatt tre ganger, uavhengig av hverandre. For hvert eksperiment ble det brukt to brønner pr tilstand. Feilfelt er SD
Statistisk analyse
Forskjeller i atom CK2α uttrykk mellom tumor og ikke-tumorvev i samme pasient og i celleproliferasjon ble analysert ved hjelp av en sammenkoblet
t
test. Noen clinicopathologic parametre ble undersøkt i denne studien. De var alder, kjønn, dybden av invasjonen, lymfeknutestatus, iscenesettelse, grad av differensiering, vaskulær og perinevral invasjon. Korrelasjonen mellom atom CK2α uttrykk og clinicopathologic parametre ble undersøkt med χ
2 test. Alle tid-til-event endepunkter i henhold til ulike clinicopathologic parametre ble plottet i et Kaplan-Meier metoden og betydningen ble deretter bestemt ved en uni-varians log-rank test. I prinsippet til disse viktige parametere i uni-varians analyse (
P
≤0.05) ble inngått multi-varians Cox regresjonsmodell bestemme hasardratio og uavhengighet prognostisk effekt i en trinnvis bakover mote. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS programvare versjon 14 (SPSS, Chicago, IL). En
P
verdien av 0,05 ble betraktet som signifikant
Takk
Forfatterne ønsker å takke Kuo-Shan Wen for hans hjelp med immunhistokjemi.. Forfatterne vil også gjerne takke Wen-Chun Chen for hennes assistanse med klinisk datainnsamling.
