Abstract
De aquaporins (AQP) er vannkanal proteiner som spiller en viktig rolle i transcellular og transepitelial vann bevegelse. Nylig har rollen som AQPs i menneskets kreft blitt et område av stor interesse. Her, ved immunhistokjemi (IHC), har vi funnet et uttrykk for AQP5 protein i 35,3% (IHC-score: ≥1, 144/408) av resected NSCLC vevsprøver. Saker med AQP5-positiv status (IHC-score: ≥2) viste en høyere rate av svulst tilbakefall enn negative i NSCLC (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005) og verre sykdomsfri overlevelse (p = 0,033, ELLER = 1,52; 95% CI: 01.04 til 02.23). Videre
in vitro
invasjon analysen bruker BEAS-2B og NIH3T3 celler stabilt transfektert med overekspresjon konstruksjoner for full lengde villtype AQP5 (AQP5) og sine to mutanter, N185D som blokkerer membran trafficking og S156A som blokkerer fosforylering på Ser156 viste at AQP5 indusert celle invasjoner mens begge mutanter ikke gjorde det. I BEAS-2B celler, uttrykk for AQP5 forårsaket en spindel-lignende og fibroblastisk morfologisk endring og tap av celle-celle kontakter og celle polaritet. Bare celler med AQP5, ikke en av to mutanter, viste et underskudd på epiteliale cellemarkører og en gevinst på mesenchymale cellemarkører. I et menneske SH3-domener protein matrise, cellulære ekstrakter fra BEAS-2B med AQP5 viste en sterk bindingsaktivitet til SH3-domener av c-Src, Lyn, og Grap2 C-terminal. Videre er det i immunutfelling assay, aktivert c-Src, fosforylert på Tyr416, viste en sterkere bindingsaktivitet til cellulære ekstrakter fra BEAS-2B med AQP5 sammenlignet med N185D eller S156A mutant. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse klarte ikke å vise tegn på genomisk forsterkning, noe som tyder AQP5 uttrykk som en sekundær hendelse. Basert på disse kliniske og molekylær observasjoner, konkluderer vi med at AQP5 gjennom sin fosforylering på Ser156 og påfølgende interaksjon med c-Src, spiller en viktig rolle i NSCLC invasjon, og derfor kan gi en unik mulighet for å utvikle en roman terapeutisk mål så vel som en prognostisk markør i NSCLC
Citation. Chae YK, Woo J, Kim MJ, Kang SK, Kim MS, Lee J et al. (2008) Uttrykk for aquaporin 5 (AQP5) Fremmer tumorinvasjon i Human Ikke småcellet lungekreft. PLoS ONE 3 (5): e2162. doi: 10,1371 /journal.pone.0002162
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, USA
mottatt: 9. januar 2008, Godkjent: 13 mars 2008; Publisert: 14. mai 2008
Copyright: © 2008 Chae et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av SPORE tilskuddet P50 CA96784-01 (til CM), Cancer Research Grant fra Pyung-Ya Foundation (til CM), og KOSEF forskningsstipend R01-2004-000-10670-0 og Korea Research Foundation stipend KFR- 2004-041-E00064 (til SJJ)
Konkurrerende interesser. DS er en betalt konsulent for Cangen bioteknologi
Innledning
De aquaporins (AQP) representerer en familie på. transmembrane vann kanalproteiner vidt distribuert i forskjellige vev i hele kroppen og spille en viktig rolle i transcellulær og transepitelial vannbevegelse [1], [2]. Så langt har minst ti forskjellige AQPs vært preget hos mennesker, og det har vært en økende forståelse for sine roller i menneskelige patofysiologi [2]. Men først nylig har data dukket opp på deg rollen som menneskelig AQPs (hAQPs) som en av de viktigste elementene som er direkte involvert i menneskelig kreft [3]. Uttrykk for hAQP1 er ofte forbundet med tykktarmskreft, kreft i bukspyttkjertelen, hjernesvulst, nyrecellekarsinom, og microvessels av (MM), parallelt angiogenese [4] – [8]. På samme måte uttrykk for AQP5 ble økt i bukspyttkjertelkreft og eggstokkreft [7], [9]. Videre har vi tidligere rapportert induksjon av AQP5 uttrykk i sitt budskap om kreft i tykktarmen utvikling [5].
På funksjonsnivå, er AQP1 vist seg å være en av de forsinkede tidlig responsgener og også involvert i cellemigrering, og angiogenese [10], [11], og ekspresjon av AQP1, AQP3 og AQP5 ble indusert i løpet av lymfocyttaktivering [12]. Tidligere har vi gitt bevis for nye onkogene egenskaper AQP1 og dens uttrykk i resected vevsprøver fra ikke-småcellet lungekreft. Ytterligere bevis av rollen AQP5 i menneskets kreft ble også levert av vår gruppe [13], [14]. Ektopisk uttrykk for AQP5 i NIH3T3 celler indusert mange fenotypiske endringer karakteristisk for transformasjon både
in vitro Hotell og
in vivo
ved å fremme signalveier aktivert gjennom Ras, som er indusert av fosforylering av PKA konsensus nettstedet av AQP5.
i denne studien undersøkte vi hvilken rolle AQP5 i lungekreft. AQP5 ble valgt basert på en rekke studier: Først vår foreløpige studien viste at blant AQP1, 3 og 5, AQP5 viste den mest robuste onkogene potensial i NIH3T3 cellelinje. For det andre, selv om begge AQP1 og AQP5 viste onkogene eiendom med NIH3T3 cellelinje, AQP5 uttrykk indusert ERK-aktivering [13], mens AQP1 uttrykk gjorde ikke [15]. Tredje, uttrykk for AQP5, ikke AQP1 eller AQP3, ble funnet å være assosiert med Ras /ERK /Rb sti aktivering i tykktarm kreft cellelinjer og ble knyttet til levermetastaser i tykktarm kreftpasienter [16]. Vi har tidligere vist at ekspresjon av AQP1 i humane primære lungekreft vev; 18 av 44 prøver av ikke-småcellet lungekreft pasientene viste positiv AQP1 protein uttrykk. Imidlertid har det vist seg at AQP5 viste mer robust onkogene potensial enn AQP1 samt AQP3 i myk-agar assay, fokus dannelsesbestemmelsen, og celleproliferasjon (MTT) analyse [13] – [15], som fører oss å velge AQP5 for sin rolle i lunge kreftutvikling, ikke bare for klinisk valideringsstudie, men også for studier i sine underliggende molekylære mekanismene.
Her presenterer vi både molekylære og kliniske bevis på at AQP5 kan spille en rolle i utviklingen av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Først, basert på immunohistokjemisk analyse av hAQP5 med 408 NSCLC vev, har vi undersøkt hvorvidt ekspresjonsprofilen av AQP5 i human lungekreft korrelerer med sykdomsprogresjon og overlevelses. Deretter har vi utført invasjonen analysen og epitelial-mesenchymale overgang markør studie i humane bronkiale epitelceller overekspresjon AQP5 versus sine mutanter i tillegg til mock-kontroll, etterfulgt av ytterligere molekylære interaksjonsstudier for å belyse AQP5 mediert veien. Videre FISH analyse ble gjort for å identifisere molekylære mekanismene bak hAQP5 uttrykk.
Metoder
Cell kultur
Alle cellelinjer ble oppnådd fra American Type Tissue Collection (Rockville, MD ). Den murine fibroblast cellelinje NIH3T3 ble dyrket i DMEM i nærvær av 10% FBS. Den normale lunge cellelinje BEAS-2B ble dyrket i LHC-9 medium i nærvær av 0,5 ng /ml rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF), 500 ng /ml hydrokortison, 0,005 mg /ml insulin, 0,035 mg /ml bovint hypofyseekstrakt , 500 nM etanolamin, 500 nM phosphoethanolamine, 0,01 mg /ml transferrin, 6,5 ng /ml 3,3 «, 5-trijodtyronin, 500 ng /ml adrenalin, 0,1 ng /ml retinsyre (Clonetics Corporation, Walkersville, MD). Alle celler ble dyrket i 5% CO
to balanserte luft ved 37 ° C.
plasmidkonstruksjoner og produksjon av stabile cellelinjer
humant cDNA fra HEK 293 ble amplifisert ved polymerase-kjede reaksjon (PCR) ved anvendelse av primere for villtype AQP5 (AQP5) og deretter innsatt i EcoRI og Xhol sete av pcDNA 3.1 (+). Kloner ble bekreftet ved restriksjonsanalyse og ved DNA-sekvensering av begge trådene. Serin 156 eller asparagin 185 ble erstattet med alanin eller asparaginsyre, henholdsvis, ved hjelp av PCR-basert seterettet mutagenese for å produsere den S156A eller N185D AQP5 mutant basert på den AQP5 pcDNA3.1 -konstruksjonen som tidligere beskrevet [13]. AQP5 WT og to mutanter ble satt inn i EcoR I og BamH I-setene av p3XFLAG-CMV-14 (Sigma) og verifisert ved DNA-sekvensering av begge trådene av mutantene. Expression konstruksjonene ble transfektert inn NIH3T3 og BEAS2B celler med Fugene 6 i henhold til produsentens anbefalinger. Alle transfektanter ble selektert med 800 ug /ml G418 i 3 uker og utvalgte kloner ble screenet med Western blot ved anvendelse av AQP5-antistoff og /eller RT-PCR. Når sammenflytende, ble cellene subdyrket ved trypsinering (0,05% trypsin, 0,53 mM EDTA i Hanks «balanserte saltløsning). Bildene som viser morfologi av ulike stabile celler som uttrykker ulike konstruksjonene ble tatt gjennom fasekontrastmikroskop (ECLIPSE TE300, Nikon Co., Tokyo, Japan).
Invasion analysen
Matrigel invasjonen analysen var utføres med NIH3T3 og BEAS2B celler. BioCoat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) som rekonstruerer basalmembranen ble kjøpt for å vurdere celle invasjon. 24-brønners vevkulturplate innsatser belagt med Matrigel ble gjen hydrert i 2 timer i 37 ° C media. Media (0,6 ml) inneholdende 5% føtalt bovint serum ble tilsatt til hver plate vel som en kjemoattraktant, og 0,2 ml (2 x 10
4 celler) av cellesuspensjonen ble tilsatt til hver pakning. Etter inkubering i 24 timer ble det ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre side av membranen ved skrubbing. For å minimere effekten av celleproliferasjon på invasjonen analysen, har vi bekreftet at i de første 24 timene, BEAS-2B celler gjennomgår minimal celledeling og ikke viser noen merkbar forskjell i celleproliferasjon mellom celler som uttrykker AQP5 og celler som uttrykker mock vektor (fig. S1). Invasjon av celler til undersiden av Matrigel-belagte membranen ble detektert ved farging av cellene med Mayers hematoksylin-løsning og visualisering av cellene under et mikroskop. Etter farging ble cellene tellet under et mikroskop i fire tilfeldig utvalgte felter (forstørrelse x 100), og resultatene ble uttrykt i form av et søylediagram. Analyser ble utført med triplikatbrønner for hver tilstand.
Immunoblotting og immunopresipitering
Lysater fra dyrkede celler og vev ble fremstilt i iskald NP-40 lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 137 mM NaCl, 10% glycerol og 0,1% Nonidet P-40) inneholdende en inhibitor cocktail av 10 mM β-glycerol-fosfat, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 mM NaF, 10 mM Na-ortovanadat, 4,5 E /ml aprotinin ( Sigma), og 1 ug /ml leupeptin (Sigma). Råprotein Lysatene (30 ug) ble separert ved 12% SDS-PAGE (BIORAD), overført til nitrocellulosemembraner (BioRad), og blokkert i 1 time med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann med 0,05% Tween 20. Det følgende kommersielle antistoffer ble benyttet for Western blot analyse: anti-AQP5 (1:200, Alpha Diagnostic), anti-α-catenin antistoff (1:1000, Cell Signaling) anti-γ-catenin antistoff (1:1000, Cell Signaling) , anti-fibronektin antistoff (1:1000, Cell Signaling), anti-vimentin antistoff (1:1000, Cell Signaling), anti-E-cadherin antistoff (1:1000, Cell Signaling), anti-c-Src-antistoff (1 :1000, Cell Signaling), anti-fosfor Src-antistoff (1:1000, Cell Signaling), anti-Lyn antistoff (1:1000, Cell Signaling), anti-grap2 antistoff (1:1000, Cell Signaling), og anti- β aktin antistoff (1:5000, Sigma). Fosfo-Src-antistoff ble først anvendt; blotter da ble strippet og re-strøket med anti-src og beta-aktin antistoffer. Passende anti-kanin og anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:3000; Amersham) ble brukt. Immunreaktive bånd ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Pierce).
SH3 domene bindende
TranSignal SH3 domene rekke III flekket med peptider som representerer 34 forskjellige menneske SH3 domener inkludert GRB2 og Src, ble kjøpt fra Panomics og testet for deres binding til AQP5 segmenter og AQP5 WT opprettholde naturlig topologi i henhold til produsentens anvisninger. De SH3 domener som inneholder proteiner på rekken ble oppdaget i to eksemplarer. I korthet membranfiltere inkubert med 30 ug /ml protein for over natten. Etter vasking protein binding ble visualisert ved inkubasjon med HRP-konjugert antistoff His eller FLAG antistoff. Dette forsøk ble utført minst to ganger med hver enkelt protein.
Protein identifikasjon og interaksjon
For pull-down-analyser, GST fusjonsproteiner (SH3 domene-inneholdende proteiner) og GST ble anskaffet fra Panomics. Celler ble lysert i NP-40 lyseringsbuffer, og lysater ble deretter inkubert med enten GST eller GST-fusjonsprotein ved 4 ° C i 2 timer, etterfulgt av tilsetning av 20 ul glutation-Sepharose 4B kuler. Etter 30 minutters blanding ble kulene vasket fire ganger. Proteiner ble eluert i Laemmli-prøvebuffer og ble analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av immunoblot med angitte antistoffer.
Kreft vev microarray
microarray (TMA) ble konstruert ved hjelp av formalinfiksert, parafin- innebygde vev av 419 NSCLC hentet fra Avdeling for patologi av Asan Medical Center under godkjenning av Internal Review Board (IRB nummer~~POS=HEADCOMP: 2006-0019). Lunge Prøvene ble erholdt fra 1996 til 1999. Den opprinnelige H DAKO Cytomation, Carpinteria, CA) og etterfulgt av kromogen deteksjon med diaminobenzidine (DAB). Negative kontroller ble utført ved å utelate det primære antistoffet inkubasjon trinn.
Skårer for immunhistokjemi
farging på TMA ble gradert semi-kvantitativt vurderer både fargeintensitet og andelen positive tumorceller ved to studie patologer (SJJ og MJK) blindet til clinicopathologic variabler. Den fargeintensitet ble scoret på en skala fra fire klassetrinn: 0, ingen farging av kreftceller; 1, svak flekker; 2 moderat farging; 3 sterk farging. Prosentandelen av fargede tumorceller ble gradert på en skala fra 2 karakterer: 0, 10% og en, 10%. AQP5 uttrykk i kreftvev ble definert som positiv når produktet av intensitet poengsum prosentvis score er en eller flere. Både histologisk type og grad ble bekreftet på hematoxylin og eosin (H E). Farget TMA skred
Fluorescens in situ hybridisering analyse
Seksti-ni NSCLCs som hadde et uttrykk for AQP5 (poengsum = 2 eller 3) ble satt sammen i to TMA blokker for FISH analyse, hver. Seksjoner (5 mikrometer tykke) av TMA lysbilder ble deparaffinized og forbehandlet for fisk. Sonden for AQP5 påvisning ble hentet fra Homo sapiens 12 BAC RP11-469H8 inneholder hele AQP5 genet (GenBank Tiltredelse nei. AC025154), og merket med rhodamin (Macrogen, Seoul, Korea). To genomiske DNA-kloner med 91 kb og 68 kb størrelser franke 12p13.31 region merket med FITC ble brukt som kontroll prober (Macrogen, Seoul, Korea). FISH ble utført ved hjelp Vysis reagenser i henhold til produsentens protokoller (Vysis, IL, USA). Lysbilder ble kontra med 4, 6-diamidino 2-phenylindole for mikroskopi. Signalet ble tellet under × 1000 forstørrelse.
Statistical Analysis
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av chi-kvadrat test med SPSS programvare (SPSS 12.0K Inc., Chicago, Illinois, USA). Pasientenes gjennomsnittsalder og tumorstørrelse ble evaluert ved t-test. Overlevelseskurver ble produsert ved hjelp av Cox modell for å teste risikoen for kreft død. Prognostiske faktorer ble undersøkt av både univariate og multivariate analyser. I multivariat analyse, alder, kjønn, histologisk grad, og tumorstadium ble gjort rede for. Vi har ikke kontroll for behandlingsmetoder siden et flertall av pasientene ble operert og TNM stadium basert på hvilke behandlingsmetoder er bestemt, viste ingen sammenheng med AQP5 uttrykk. Alle p-verdier var tosidig, og forskjeller på p. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
AQP5 overekspresjon er assosiert med dårligere prognose i NSCLC
En betydelig uttrykk for AQP5 protein ble observert hos 16,9% (69/408) av NSCLC TMA prøver (farging score på 2+, definert som positiv) (tabell 1, figur 1A). Som vist i figur 1A, bare kreftceller, ikke tumor-infiltrerende lymfocytter, viste AQP5 uttrykk. Inkludert tilfeller med svak uttrykk (immnunostaining score på 1+), var det så høyt som 35,3% (144/408, tabell 1). Interessant nok var AQP5 overekspresjon observert hovedsakelig hos lunge adenokarsinomer (p 0,001, Tabell 2). Imidlertid, ingen annen statistisk signifikant korrelasjon ble funnet i NSCLCs mellom AQP5 ekspresjon og demografiske og patologiske faktorer, slik som alder, kjønn, histologisk differensiering, og tumorstadium (tabell 2). På grunn av utilstrekkelig prøvestørrelse av metastatiske tilfellene (n = 4), ikke lenger statistisk sammenheng studie av metastasering ble utført.
photomicrographs av AQP5 farging i Arrayed ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) vev. Eksempler på svak (1), moderat (2), og sterke (3) immunoreaktivitets i NSCLCs (a til c, henholdsvis) Original forstørrelse × 200. (B) Kaplan Meier kurve i NSCLC pasienter. AQP5-positive tilfeller vises en mindre gunstig sykdomsfri overlevelse (log rank p = 0,011) enn AQP5-negative saker.
Til vår overraskelse, saker med AQP5-positive status vises en høyere rate av svulst tilbakefall enn negative i NSCLC (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). Selv AQP5 overekspresjon var ikke statistisk signifikant sammenheng med total overlevelse, bemerkelsesverdig, de med NSCLC viste en dårligere sykdomsfri overlevelse (log rank test, p = 0,011) (Fig. 1B). Selv etter justering for histologisk grad og tumorstadium, ble AQP5 overekspresjon i NSCLC fremdeles signifikant assosiert med tidligere sykdomsprogresjon (p = 0,033; OR = 1,52; 95% CI: 01.04 til 02.23). Derfor synes AQP5 status å være en uavhengig molekylær markør assosiert med dårligere kliniske utfall.
Menneskelig AQP5 fremmer celle invasjon
Fra våre kliniske funn, har vi en hypotese om at AQP5 kan indusere celle invasjon, en nødvendig skritt for tumormetastaser. For å undersøke hvorvidt AQP5 overekspresjon fremmer celle invasjon i humane bronkiale epitelceller og, på samme tid, for å bestemme hvilke komponenter av AQP5 proteinet spiller en rolle i prosessen, vi først utført Matrigel invasjon assay i BEAS-2B cellelinjer som stabilt uttrykker AQP5 og sine to mutanter, N185D som blokkerer membran trafficking og S156A som blokkerer fosforylering på S156 stedet AQP5 molekyl [13], [14], [17]. Interessant nok celler med AQP5 viste den høyeste grad av celle invasjon mellom fire grupper (Fig. 2A, 2C). Selv om høyere enn den mock, graden av celle invasjon i celler med N185D og S156A mutanter var klart mindre enn den for celler med AQP5 (fig. 2A, 2C). Disse funnene tyder på at både membran uttrykk for AQP5 og dens fosforylering på S156, PKA konsensus nettstedet, er viktig for AQP5 indusert celle invasjon i BEAS-2B celler. For å utelukke muligheten for at dette fenomenet er ikke unikt for menneske bronkial epitelceller, utførte vi den samme analysen ved hjelp av musen fibroblast NIH3T3 cellelinjer, som ble transfektert med samme uttrykk konstruerer [13] og har observert lignende funn (Fig. 2B, 2D) .
Matrigel invasjonen assay ble utført med hver av BEAS-2B celler (A, C) og NIH3T3 celler (B, D) som uttrykker AQP5 eller hver av to mutanter. AQP5 indusert celle migrasjon og invasjon i BEAS-2B, udødeliggjort menneskelige bronkial epitelceller samt NIH3T3 celler. I motsetning til dette, har begge de N185D mutant (forringet membran handel) og S156A mutant (forringet fosforylering ved Ser 156 av PKA) ikke indusere cellemigrering og invasjon i enten BEAS-2B-celler eller NIH3T3-celler sammenlignet med Mock.
AQP5 uttrykk fører til fibroblast-lignende morfologiske forandringen i bronkiene epitelceller
Vi da besluttet å vurdere eventuelle morfologiske forandringer ledsaget av AQP5 overekspresjon. Den morfologi av Beas-2B humane bronkiale epitelceller bærer enten mock vektor flagg eller flagg /AQP5 ble undersøkt av fasekontrastmikroskop. Som forventet, narretransfekterte BEAS-2B-celler viste høyt organisert celle-til-celle-adhesjon og vedlikeholdes celle polaritet, som er den typiske morfologi av normale epitelceller (fig. 3). Med uttrykket av AQP5 forårsaket en markert spindellignende og fibroblastisk forandring i cellemorfologi og et tap av celle-til-celle-kontakt og celle polaritet (fig. 3). Disse morfologiske endringer kan innebære at AQP5 spiller en rolle i epitel-mesenchymale overgang (EMT).
morfologi av Beas-2B humane bronkiale epitelceller uttrykker mock vektor flagg eller flagg /AQP5 ble avslørt av fasekontrast mikroskopi. BEAS-2B-celler opprettholdt høyt organisert celle-til-celle-adhesjon og celle polaritet som en typisk epithelial morfologi. Ekspresjonen av AQP5 forårsaket en spindellignende og fibroblastisk morfologi og tap av celle-celle-kontakter og celle polaritet. Skala barer, 50 mikrometer.
AQP5 uttrykket er assosiert med molekylære markører for epitel-mesenchymale overgang
For å bekrefte om AQP5 virkelig induserer EMT i humane bronkiale epitelceller, vi utførte western blot analyse for å kontrollere proteinmarkører for EMT. Av notatet, blant BEAS-2B celler som stabilt uttrykker AQP5 (klon # 1 og # 2), N185D, S156A mutanter og mock vektor, bare celler som uttrykker AQP5 viste et underskudd på epiteliale cellemarkører, for eksempel E-cadherin, α catenin og γ catenin, og en gevinst på mesenchymale cellemarkører inkludert fibronektin og vimentin (fig. 4). Både endringer i morfologi og molekylære profil AQP5 overekspresjon celler gi fast bevis for at AQP5 stimulerer bronkial epitelceller å gjennomgå EMT.
Uttrykk av epitel proteiner inkludert E-cadherin, α-catenin og γ-catenin, og mesenchymale proteiner, inkludert fibronektin og vimentin ble undersøkt ved immunblotting i de fire separate BEAS-2B-celler, som hver bærer overekspresjon konstruere for AQP5 (klon # 1 og # 2), N185D, S156A og Mock. Bare celler med AQP5 utstilt et tap av epiteliale markører og en gevinst på mesenchymale cellemarkører. 1, AQP5 klone # 1; 2, AQP5 klon # 2; 3, N185D; 4, S156A; 5, Mock basert på BEAS-2B cellelinjer.
AQP5 samhandler med c-Src, en potent EMT trigger
Deretter undersøkte vi den mulige molekylære mekanismen bak EMT fremme eiendom AQP5. Humant AQP5 bærer en diproline peptidsekvens (RTSPVGSP) i sløyfen D [18], [19] som bærer en sekvenslikhet med den SH3 bindings konsensus området. Det er således mulig at dette segmentet av AQP5 kan bindes med SH3-domenet av et adaptermolekyl [18]. Derfor, utførte vi et humant SH3 domener protein matrise for å undersøke potensialet av flere SH3 domene inneholdende proteiner som bindes til humant AQP5. Spesielt, renset AQP5 fra stabile BEAS-2B-celler viste bindingsaktivitet til SH3-domenet av c-Src, Lyn, og Grap2 C-terminal (figur 5A). Den AQP5 segment inneholdende en fosforylert Loop D (88 aa gjennom 182 aa) var også i stand til å binde SH3-domenet av c-Src, Lyn, og Grap2 C-terminal (Fig. 5A). Den AQP5 segment inneholdende en ufosforylerte Loop D, var imidlertid ikke i stand til å binde seg til SH3 domener fra tre proteiner (Fig. 5A). Fosforyleringen status for hvert protein ble ytterligere bekreftet.
(A) Et humant SH3 domener protein rekke ble brukt for å undersøke de potensielle bindings aktivitetene til flere SH3 domene-inneholdende proteiner til AQP5. Ikke bare AQP5, men også AQP5 segment inneholdende en fosforylert Loop D (88 aa gjennom 182 aa) ble funnet å binde seg til SH3-domenet av c-Src, Lyn, og den Grap2 protein. Den AQP5 segment inneholdende en ufosforylerte Loop D, var imidlertid ikke i stand til å binde til den SH3-domenet av noen av disse proteiner. (B) GST pull-down-analysen ble utført med tre forskjellige GST fusjonsproteiner: en c-Src SH3-domenet, en Lyn SH3 domene og et C-terminalt domene Grap2 SH3 protein. Celler som stabilt uttrykker AQP5 i humane bronkiale epitelceller, BEAS-2B, viste en sterk interaksjon med c-Src-SH3-domenet protein, Lyn SH3 domene protein og det C-terminale domene Grap2 SH3 protein. (C) AQP5 er co-immunopresipitert med c-Src i BEAS-2B celler stabilt transfektert med AQP5 uttrykk konstruere. Videre er ko-immunopresipitert med AQP5 bare en aktivert form av c-Src, fosforylert på Tyr 416,. 1, Mock; 2, N185D; 3, S156A; 4, AQP5; M, vekt markør molekylær.
I tillegg har vi utført en GST pull-down analysen for å verifisere en direkte interaksjon mellom AQP5 og Src-familie molekyler. I denne analysen anvendes tre forskjellige GST fusjonsproteiner: en c-Src SH3-domenet, en Lyn SH3 domene og et C-terminalt domene Grap2 SH3-protein, som ble identifisert til å interagere med SH3 AQP5 i domene protein matriser. I samsvar med resultatet fra SH3 domene protein matriser, AQP5 stabilt uttrykt i BEAS-2B humane bronkiale epitelceller viste en sterk interaksjon med c-Src, Lyn og C-terminal Grap2 SH3 domener proteiner (Fig. 5B).
til slutt, for å bekrefte våre funn
in vivo
, utførte vi en immunoprecipitation analyse i menneskelig bronkial epitelial cellelinje, BEAS-2B. Denne gangen har vi fokusert på c-Src, et molekyl kjent for sin EMT fremme aktivitet [20]. Som forventet, AQP5 co-immunopresipitert med c-Src i celler som stabilt uttrykker AQP5 (Fig. 5C). Intriguingly, c-Src ko-immunprecipitated med AQP5 viste seg å være en aktivert form av c-Src, som blir fosforylert ved Tyr416 (fig. 5C). Vi merker oss også at cellene uttrykker AQP5 har mer aktivert c-Src enn cellene bærer N185D eller S156A mutant (Fig. 5 C), noe som antyder at interaksjonen med AQP5 kan være et viktig skritt i å aktivere c-Src.
AQP5 overekspresjon kan ikke være forbundet med genomisk forsterkning
for å belyse de molekylære mekanismene bak AQP5 overekspresjon, har vi undersøkt tilstedeværelsen av genomisk forsterkning gjennom FISH analyse. Ut av 69 tolkbare tilfeller av NSCLC TMA, ikke en eneste klart mønster av genomisk forsterkning ble påvist (Fig. S2), noe som antyder at ektopisk uttrykk for AQP5 kan være en sekundær molekylær hendelse.
Diskusjoner
Vi har tidligere vist at overekspresjon av AQP5 i musefibroblaster, NIH3T3-celler, induserer celleproliferasjon sekundært til aktivering av Ras, som blir mediert av fosforylering av AQP5 i sin PKA konsensus område (S156), og denne undersøkelsen tydelig gitt en forening mellom AQP5 og Ras signaltransduksjonsbane [13], [14]. I tillegg har vi nylig rapporterte en studie som beskriver en indusert uttrykk for AQP5 protein i løpet av kolorektal karsinogenisitetsstudier og molekylære stier hvor AQP5 protein uttrykk kan påvirke tykktarmskreft utvikling av sin interaksjon med Ras /ERK /Rb signalveien [16].
i motsetning til disse tidligere rapporter, her, vi har fulgt rollen AQP5 på progresjon av NSCLC. Dette er delvis basert på vår tidligere rapport, som ikke bare viste onkogene eiendom AQP1 i NIH3T3 celler, men også beskrevet uttrykket profilen til AQP1 i NSCLC [15]. Denne rapporten, selv gitt viss innsikt om rollen AQPs i NSCLC, viste ikke enten klinisk implikasjon eller relaterte molekylære stier. I vår forstudie for AQP5 i NSCLC, la vi merke til en rekke AQP5 uttrykk i flere NSCLC cellelinjer inkludert H1975, H1838, H1650, H1437, og H838. I tillegg, lik våre observasjoner med NIH3T3 muse fibroblast-celler [13], [14], har vi nylig identifisert at AQP5 overekspresjon i BEAS-2B-celler induserer aktivering av ERK-reaksjonsveien som fører til stimulering av celleproliferasjon (Kang et al., manuskript under forberedelse); humane bronkiale epitelceller stabilt transfektert med AQP5 viste signifikant høyere spredning rente enn celler stabilt transfektert med mock (Fig. S1). Basert på disse foreløpige funn og tidligere observasjoner vi hadde med AQP1 i NSCLC og AQP5 i kolorektal kreft studien har vi undersøkt uttrykket profilen til AQP5 i et stort panel av kliniske prøver.
Mens uttrykk for AQP5 i sin melding nivå er rapportert i enkelte deler av normal menneskelig bronkial og alveolar vev [21], så langt, AQP5 uttrykk profiler i NSCLC vevsprøver, i sin protein nivå, har ikke blitt rapportert. For å finne kliniske implikasjoner av AQP5 overekspresjon i NSCLC, har vi samlet resected menneskelige NSCLC vev med et gjennomsnitt på fem års oppfølging, som vi utførte immunokjemi å undersøke protein uttrykk nivå AQP5. Mens vi funnet AQP5 uttrykk i kreftceller, kan vi ikke se noen bevis på AQP5 immunoreaktivitets blant tumor-infiltrerende lymfocytter, som er i strid med våre tidligere funn som viser en indusert uttrykk for AQP5 meldinger under lymfocytter aktivering [12]. Selv om dette avviket kan være et resultat av flere grunner, er det mulig at AQP5 uttrykk under lymfocyttaktivering kan være en midlertidig hendelse og at når lymfocytter aktiveres, kan de downregulate AQP5 uttrykk.
Vi har identifisert tre interessant uttrykk profiler av AQP5 protein i NSCLC med klinisk sammenheng. Først blir et uttrykk for AQP5 protein lagt merke til i 35,3% (144/408, tabell 1.) av resected NSCLC vevsprøver. For det andre, NSCLC tilfeller med AQP5-positive status vises en høyere rate av svulst tilbakefall enn negative (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). Tredje, AQP5 overekspresjon i NSCLC ble signifikant assosiert med tidligere sykdomsprogresjon (p = 0,033; OR = 1,52; 95% CI 1.4 til 2.23) og verre sykdomsfri overlevelse. Vi tror at dette er den første kliniske bevis som indikerer en sterk sammenheng mellom AQP5 uttrykk og utfallet av kreftpasienter som gjennomgikk kirurgi, og videre foreslå at hAQP5 er en potensiell uavhengig prognostisk markør.
