Abstract
Bakgrunn
Epstein Barr-virus (EBV) infiserer mesteparten av den menneskelige befolkning, forårsaker alvorlige sykdommer i en liten andel i forbindelse med miljøfaktorer. Etter primær infeksjon, forblir EBV latent i minne B cellepopulasjon for livet. Tilbakevendende reaktivering av viruset finner sted, sannsynligvis på grunn av aktivering av minne B-lymfocytter, noe som resulterer i viral replikasjon og re-infeksjon av B-lymfocytter. Metylering av det virale DNA ved CpG-motivene fører til stanse av viral genekspresjon i løpet av tidsforsinkelser. ZTA, nøkkelen viral protein som medierer latency /reaktive balanse, samhandler med metylert DNA. ZTA er en transkripsjonsfaktor for både virus og vert gener. En sub-sett av sitt DNA bindingsseter (ZREs) inneholder en CpG motiv, som er anerkjent i sin metylert form. Detaljert analyse av arrangøren av viral genet
BRLF1
viste at interaksjon med en metylert CpG ZRE (RpZRE3) er nøkkelen til velt epigenetisk stanse av genet.
Metodikk og hovedfunnene
Her har vi spørsmålet om vi kan bruke denne informasjonen til å identifisere hvilke vertsgener inneholde arrangører med liknende responselementer. En beregnings søk menneskelige genet arrangører identifisert 274 mål som inneholder 7-nucleotide RpZRE3 kjerneelement. DNA-bindende analyse av ZTA med 17 av disse målene viste at den flankerende sammenheng med den kjerneelement ikke har en stor innvirkning på evnen til ZTA til å samhandle med denaturert områder. Et andre sideliggende ZRE ble observert for en promoter. ZTA var i stand til å samhandle med dette nettstedet, selv om co-belegg med RpZRE3 kjerneelement ikke ble observert.
Konklusjon /Betydning
Denne forskningen viser 274 mennesker arrangører har potensial til å bli regulert av ZTA å velte epigenetisk stanse av genuttrykk under viral reaktivering fra latency
Citation. Flower K, Hellen E, Newport MJ, Jones S, Sinclair AJ (2010) Evaluering av et Tippe protokoll for å identifisere potensielle mål av epigenetiske omprogrammering av Kreft Associated Epstein Barr Virus. PLoS ONE 5 (2): e9443. doi: 10,1371 /journal.pone.0009443
Redaktør: Maria G. Masucci, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 14 oktober 2009; Godkjent: 02.12.2009; Publisert: 26 februar 2010
Copyright: © 2010 Flower et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Stipend fra University of Sussex og Brighton og Sussex Medical School. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Epstein Barr virus (EBV) infiserer og fører til flere sykdommer hos mennesker, inkludert Burkitt lymfom, nasofaryngeale karsinom, Hodgkins sykdom, post-transplantasjon lymfoproliferativ lidelse og mononukleose (kjertelfeber) [1] – [4]. I likhet med andre medlemmer av gammaherpesviruses familien, EBV infeksjon vedvarer for livet etter primærinfeksjon. Viruset er opprettholdt i en tilstand av tidsforsinkelser i minne B-lymfocytter og sporadiske reaktivering og replikasjon er ansett for å opprettholde den viruset i løpet av individer [5]. I EBV-induserte lymfomer, er EBV også til stede i en latent tilstand. I cellelinjer avledet fra disse lymfomer, blir det virale genom overveiende metylert [6] – [9]. Effekten av tie viral genekspresjon ikke bare hjelpemidler flukt fra immunsystemet [10], men også forhindrer ødeleggelse av tumorceller ved virusreplikasjon. Faktisk reaktivering av EBV fra tidsforsinkelsen er blitt foreslått som en rute for å behandle EBV-assosiert lymfomer [11], [12].
EBV ventetid blir forstyrret følgende fysiologisk aktivering av B-lymfocytter, gjennom ekspresjon av ZTA (BZLF1, sebra, EB1, Z) [13] – [15]. ZTA er en sekvens-spesifikk DNA-bindende protein, som ligner den bzip familien av transkripsjonsfaktorer og spiller en avgjørende rolle i den reaktivering av viral genekspresjon og replikasjon av genomet. Gjennom direkte interaksjon med ZTA responselementer (ZREs) i arrangører, regulerer ZTA uttrykk for viral og cellulære gener. Mange vert og viruspromotere som er evaluert oppdatert inneholde ZREs innenfor de proksimale fem hundre nukleotider av 5 «sekvens. Så langt, åtte har eksperimentelt bekreftet bindingssteder for ZTA i sine proksimale promoter regioner:
BSLF2 + BMLF1 product: [16], [17];
BRLF1 product: [18];
BZLF1 product: [17], [19], [20]; felles promoter for
BHLF1 Hotell og
BHRF1 product: [19]; lytisk
EBNA1
arrangøren Fp [21];
BRRF1 product: [22]; og
BMRF1 product: [23]. Videre er 6 vertsgener direkte regulert av ZTA gjennom ZREs i sine arrangører
DHRS9 product: [
24
];
EGR1 product: [25], [26];
CIITA product: [27];
IL-8 product: [28];
IL-10 product: [29]; og
IL-13 product: [
30
]. ZTA samhandler med et variert utvalg av ZREs [31] og flere nettsteder finnes i noen ZTA-responsive arrangører, noen ganger i umiddelbar nærhet. Et eksempel er viral promoter for
BZLF1
genet, Zp, som inneholder to funksjonelle ZIIIA og ZIIIB ZREs innenfor en total spenn på 20 nukleotider [17], [19], [20].
ZTA har uvanlig trekk ved samspill med en sub-sett av ZREs som inneholder en metylert CpG motiv [32]. I noen tilfeller ZTA er i stand til å interagere med den ikke-metylert ZRE, mens for andre ZREs interaksjonen med ZTA er avhengig av metylering [22], [26], [32] – [34]. Dette har ført til klassifisering av ZREs inn i tre klasser: Klasse I ZREs ikke inneholder en CpG motiv; klasse II ZREs inneholder en CpG motiv som er anerkjent i både denaturert og ikke-denaturert stater; og klasse III ZREs inneholder en CpG motiv, men blir bare gjenkjent når metylert [35]. Evnen til ZTA til å samhandle med metylerte CpG-inneholdende ZREs tillater ZTA å aktivere genekspresjon i den latente virusgenomet til tross for den undertrykkende metylering status og således velte epigenetisk stanse av det virale genom [22], [32] – [35].
Til dags dato tre gener med CpG-holdige ZREs har blitt studert: EBV
BRLF1
, EBV
BRRF1 Hotell og menneskelig
EGR1 product: [22], [26], [32] – [35]. Av disse undersøkelse av regulering av EBV genet
BRLF1
gitt overbevisende bevis for at samspillet av ZTA med en metylert ZRE var instrumental i reaktivere EBV inn lytisk syklus i B-lymfocytter [32] – [35]. Den viral
BRLF1
genet inkluderer tre ZREs i promoter proksimale region [18], [32]. To av ZREs inneholde CpG motiver; RpZRE2, er en klasse II ZRE og den andre, er RpZRE3 en klasse III ZRE [35]. Evnen til et enkelt punkt-mutasjon i ZTA å skille mellom samspillet av ZTA med metylert og ikke-denaturert RpZRE3 tillatt relevansen av samspillet ZTA med denne arrangøren skal etableres [34], [36], [37]. Den viral
BRRF1
genet inneholder to CpG-holdige ZREs, som ZTA bare kommuniserer med i sine denaturert tilstander [22]. Tilstedeværelsen av en CpG holdig ZRE i formidler av den menneskelige
EGR1
genet, som er anerkjent av ZTA i sin metylert form, tyder på at EBV kan velte epigenetisk stanse av vertsgener for å modulere vertscellen miljø [26].
RpZRE3 kjerneelement (TCGCGAA), som ble tydelig vist seg å være nødvendig for velt epigenetisk stanse av
BRLF1
i B-lymfocytter [34], [36], [37], ble valgt til å identifisere alle menneskets gener som inneholder en eksakt match til denne CpG-holdige ZRE i -500-1 område av arrangøren og vurdere om de er anerkjent av ZTA i sin naturlige sammenheng.
Materialer og metoder
Identifikasjon av menneske arrangører Inneholder RpZRE3-kjerneelementer: Innledende Sampling
Arrangøren regioner (definert som -500 til en basepar fra transkripsjonsstartsetet) i en prøve menneske proteinkodende gener i Ensembl (49) [38] ble hentet med Biomart data management system [39]. Prøven representerte 40% av det humane genom. Et søk ble gjort etter alle forekomster av et nøyaktig (forover og bakover) kamp for å identifisere de arrangører med TCGCGAA RpZRE3 kjerneelement
Identifikasjon av menneske arrangører Inneholder RpZRE3-kjerneelementer. Whole Genome skanning
en identisk skjerm ble foretatt på hele det menneskelige genomet fra Ensembl (50) [40], noe som resulterer i identifisering av 274 arrangører som ble utpekt til RpZRE3-promoter-274 data-set. De 7 nukleotider i RpZRE3 kjerneelementet, sammen med 10 flankerende nukleotider på hver side, ble ekstrahert fra hver av de 5 gener fra den opprinnelige sampling. Transkripsjonsfaktor bindingssetet (TFBS) Perl-moduler [41] ble brukt til å lage en posisjon Vekt matrise (PWM), basert på hele lengden av disse 27 nukleotidsekvenser. TFBS Perl-moduler ble også brukt til å søke promotorområdene (-500 til en) av alle menneskelige proteinkodende gener i Ensembl 50 [40] som ble hentet ved hjelp Biomart [39]. De arrangører som passet PWM med en terskelverdi 80% og inneholdt en eksakt match til RpZRE3-kjerneelement i tillegg ble filtrert ved hjelp av 2 kriterier (a) tilstedeværelse av CpG øyer og (b) -funksjonen (basert på over- representasjon av Gene ontologi (GO) termer [42]). Plasseringen av CpG øyer ble spådd å bruke prege programmet CpGPlot [43] med standardvalgene. Kun gener med et CpG øy til stede i promotoren ble beholdt. Farten sikt kommentarer for molekylær funksjon og biologiske prosesser ble hentet fra Ensembl for hvert gen [40]. Antallet av gener i RpZRE3 promoteren datasettet med hvert GO sikt kommentaren ble sammenlignet med det totale antall gener i Ensembl med samme GO sikt. Farten vilkår som skjedde med en betydelig høyere frekvens (p 0,05) i RpZRE3 datasettet, sammenlignet med hele genomet, ble definert som over-representert
DNA Binding Analyse av EMSA på RpZRE3 Inneholder arrangører
.
dobbelttrådet merket DNA-prober ble gjort ved å merke 6 pmol av oligonukleotid (27 nt lange) ved 5′-enden med [γ-
32P] ATP (30 uCi) ved anvendelse av polynukleotidkinase (Roche). 12 pmol av den komplementære oligonukleotid tråd ble tilsatt og inkubert med det merkede enkelt streng ved 95 ° C i 2 minutter, 65 ° C i 10 min, og 37 ° C i 30 minutter for å binde trådene. Konsentrasjonen av proben var 33,3 nM. Oligonukleotidene består kjernen 7-mer-sekvensen omgitt av 20 nukleotider svarende til beslektet flankerende sekvens for hver enkelt promoter og syntetisert. Der det er angitt i figuren, ble den sentrale CpG motiv metylert på begge cytosines under syntese (Sigma).
ZTA protein var
in vitro
omregnes hvetekim ekstrakt (Promega). Dette ble inkubert med den merkede probe (til en endelig konsentrasjon på sonde 3,3 nM) i 30 minutter ved romtemperatur, før prøven ble fraksjonert på en 8% polyakrylamidgel innfødt ved 100 volt i 1 time. Etter påvisning av radioaktivt merket DNA ved hjelp av en storm phosphorimager, ble de relative signalene ble kvantifisert ved hjelp av Imagequant-programvare (GE Healthcare, UK).
Konkurranse EMSAs ble utført med en 100 x overskudd av en dobbeltkjedet ikke-merket oligonukleotid i tillegg til standard EMSA reaksjonen. Like mengder på hver av de komplementære oligonukleotider ble varmebehandlet på samme måte som de merkede prober og fortynnet for å gi en oppløsning konsentrasjon på 3,33 uM. Dette ble tilsatt til EMSA reaksjonen ved en sluttkonsentrasjon på 333 nM (dvs. 100X overskudd).
Oligonukleotider
oligonculeotides som ble benyttet var dobbelt tråd versjoner av følgende sekvenser (5′-3 « ):
XPC GGTGCGTCACTCGCGAAGTGGAATTTG
ZC3H8 GCTTCCCGGCTCGCGAAAGGGAGGACC
HDAC2 TCCCCCACTGTCGCGAAGCTCCCGCCC
MNT CCGCGGCGTCTCGCGAAGGGAGGGGCG
Cyclin L2 GGGCGGCTCCTCGCGAAGCTCCACGGC
RpZRE3 GTTTATAGCATCGCGAATTTTGAGTGC
CAPN2 CCGGGGAGGCTCGCGAATCGCGGTCCA
CDO1 CGTCCCAGCGTCGCGAACCACAGCGGC
FALZ GGCGCGCAGCTCGCGAAATGCCCGGCG
KIF1B GCTTCGGCCCTCGCGAAACTCCGCCCG
LLGL1 TCGGCCGGGCTCGCGAAGGGACGCCCG
LMO4 GGATCCCGGGTCGCGAAGGGCAGCCCA
MBD4 CCTCCTGCTCTTCGCGAACCGCCCCGC
PLEKHJ1 AGCCGCTCCCTCGCGAAAGTTGGCCCC
PRKD1 CTTCCTGGGGTCGCGAACTTCCCGGGC
SEC14L CGCCCGCTACTCGCGAAGCCCAGCCCG
TADA3L GCTGCGCTTCTCGCGAAAGGGCAGGCA
TOP2B CCGCGCCCCATCGCGAAGATCCGGAGC
XPCLMNTR GGTGCGTCACTCGCGAAGGGAGGGGCG
MNTLXPCR CCGCGGCGTCTCGCGAAGTGGAATTTG
XPC Mcore GGTGCGTCACCCCCTTAGTGGAATTTG
XPCLM3Mcore GGTCCGCCTCCCCCTTAGTGGAATTTG
AP1 mut GATCCACCCCTTAGAGGAAAACATACG
Prediksjon av transkripsjonsfaktor Binding nettsteder Bruke Promo
transkripsjonsfaktor bindingssetet prediksjon program PROMO [44] ble brukt sammen med standardinnstillingen på 15% ulikhet verdi, for å identifisere potensielle bzip transkripsjonsfaktor bindingssteder innenfor XPC oligonukleotid.
Resultater
Identifikasjon av menneske arrangører som inneholder RpZRE3 kjerners element: initial Sampling
den første søk etter RpZRE3-sentrale elementer i en prøve av menneskelig arrangører avslørte 67 gener med en RpZRE3-kjerneelement . 5 av disse som er involvert i regulering av genet ble valgt ut for DNA-bindingsanalyse. Disse 5 gener var ZC3H8 (ENSG00000144161), HDAC2 (ENSG00000196591), XPC (ENSG00000154767), MNT (ENSG00000070444) og CyclinL2 (ENSG00000116148) og sammen med RpZRE3 element fra viral
BRLF1
promoter (RP), dannet den RpZRE3-promoter-6-datasettet.
DNA-bindingsanalyser ble utført med de metylerte former av hver av de 5 humane promotorene ved hjelp av 27mer dobbel tråd oligonukleotider som omfatter den 7-nukleotid kjerneelement og 10-nukleotid flanker region på hver side sammen med RpZRE3 fra Rp. Elektromobilitet skiftanalyser (EMSA) ble gjennomført med
in vitro
oversatt ZTA protein. ZTA protein /DNA komplekser dannet lett med oligonukleotidene fra alle seks promotorer (figur 1). Spesifisiteten av analysen er vist ved den manglende kompleksdannelse med kontroll protein. I tillegg, foretok vi konkurrerende eksperimenter med et overskudd av umerkede oligonukleotider og inkludert en versjon med en mutant ZRE for ytterligere å undersøke spesifisiteten av interaksjonen. Dette bekrefter at ZTA interagerer med alle seks RpZRE3 kjerneelementer spesifikt.
(a) Nukleotidsekvensen av en tråd av hvert oligonukleotid som spenner over de angitte ZREs er vist, med den konserverte RpZRE3 kjerneelementet (TCGCGAA) innrettet. Dobbel tråd versjoner av disse sekvenser ble anvendt som prober i EMSA, med 2 cytosines innenfor CpG kjernemotivet metylert. Den RpZRE3 fra EBV BRLF1 promoter er inkludert. (B) DNA binding mellom
in vitro
oversatt ZTA med hver sonde ble foretatt av EMSA. Evnen til ZTA (Z) for å samvirke med proben ble sammenlignet med en uprogrammert oversettelse lysat (C) som en negativ kontroll. Komplekset ble separert på en 8% gel ved elektroforese og visualisert ved phosphoimaging. Det overskytende sonde kan sees på bunnen av gelen. Sonden anvendes i hvert forsøk er angitt nedenfor for gelen. (C) Konkurranse for hver ZRE sekvens (ved 100X overskudd) mot merket RpZRE3 ble bestemt av konkurranse EMSAs. Data fra minst 2 eksperimenter ble tatt for å beregne konkurranse, dvs. prosentandelen av merket probe fortrenges av umerket konkurrent. Metylerte ZREs ble anvendt for både probe og konkurranse. AP1 mut, et oligonukleotid som tidligere vist ikke å påvirke ZTA [36], ble anvendt som en negativ kontroll for å definere graden av ikke-spesifikk binding. Feilfelt indikere standard feil
Identifikasjon av menneske arrangører som inneholder RpZRE3-kjerneelementer:. Whole Genome skanning
Hele menneskelige genom ble skannet for ytterligere RpZRE3-kjerneelementer. Dette resulterte i et data-sett av gener 274, betegnet den RpZRE3-promoter-274 datasettet (se tabell S1). For å vurdere om det var en påvirkning av flankerende sekvens på samspillet mellom ZTA med disse ZREs vi foretok en systematisk filtreringsprosess. Den RpZRE3-promoter-274 datasett ble først filtrert ved hjelp av en posisjons vekt matrise (PWM) som ble generert fra RpZRE3-promoter-6-datasettet. Treff ble ytterligere filtrert for gener med minst et CpG øy i promoteren og en over-representert GO sikt. Dette resulterte i 12 tidligere var ukjente promotorer og et ytterligere en som hadde blitt identifisert i startbildet (figur 2). Sammen med prosjektpartnere fra startskjermen og viral
BRLF1
promoter (RpZRE3-promoter-seks datasettet), disse danner RpZRE3-promoter-18 data-set.
(a ) den bioinformatikk analyse foretatt for genomet brede skanningen er representert som et flytskjema. Genetisk inngang eller utgang er representert ved ovaler og filtre av trapeziums. (B) En plassering Vekt Matrix (PWM) ble opprettet ved hjelp av sammenstilte sekvenser av den RpZRE3-promoter-seks datasettet. Disse sekvensene er vist i fig. 1 (a). Dette ble brukt for å filtrere de genomiske data fra humane promotersekvensene (-500 til 1). (C) overrepresentert ble identifisert GO termer ble funnet for de 274 gener. (D) De 13 gener som er identifisert som kandidat gener, 12 tidligere ukjente gener og en fra det første skjermbildet og tilhørende Ensembl tiltredelses koder.
Oligonukleotider ble utformet etter samme prinsipper med 10 nukleotider av flanke sekvens på hver side av RpZRE3-kjerne-elementet, og evnen til ZTA til å kommunisere med hvert område i sin metylert form ble vurdert. Den EMSA analyse viste at alle tolv av de nylig identifiserte denaturert arrangører ble gjenkjent av ZTA (figur 3).
EMSA analyse med
in vitro
oversatt ZTA protein (Z) eller en uprogrammert oversettelse lysat (C) ved hjelp av sonder som er angitt til høyre for hver gel ble utført som beskrevet i fig. 1.
Denne analysen viste at for RpZRE3-promoter-18 data-set, gjorde flankerende sekvens rundt metylert kjerne 7-mer element ikke har en dyp effekt på evnen til ZTA å samhandle med promotorer og derfor det sentrale element var tilstrekkelig til å lette binding. Dette ble illustrert ved generering av en PWM ved hjelp sekvensen fra RpZRE3-promoter-18 data-sett (figur 4), som avslørte neglisjerbare sekvenskonservering utsiden av kjerneelementet.
(a) En posisjon Vekt matrise (PWM), opprettet ved hjelp av sonde sekvenser av datasettet RpZRE3-promoter-18.
Anerkjennelse av de ikke-denaturert arrangører
ZTA er i stand til å gjenkjenne mange responselementer som gjør ikke inneholder et CpG-motivet, og derfor ikke har et metylert kjerneelement (klasse I ZREs) [15], [35]. Dessuten gjenkjenner ZTA en CpG innehold ZRE, RpZRE2, selv i fravær av metylering (klasse II ZREs) [33]. Evnen til ZTA å gjenkjenne arrangører i sine ikke-denaturert former kan påvirke evnen til EBV å endre sin genekspresjon, så vi undersøkte klassifiseringen av ZRE for hver av de 17 menneskelige arrangører.
En serie DNA-bindende eksperimenter med oligonukleotider som representerer de menneskelige arrangører i RpZRE3-promoter-18 data-set, ble gjennomført sammenligne ikke-metylert med denaturert RpZRE3-kjerneelementer. Interaksjonen mellom ZTA med områder var kvantitativ, som vist ved reduksjonen i kompleksdannelsen som ZTA proteinkonsentrasjonen ble titrert på hver av de metylerte promotorene (figur 5). Alle bar en skjerm neglisjerbar binding til de ikke-denaturert oligonukleotider (minst 10 ganger lavere enn de denaturert nettsteder), og kan derfor bli klassifisert som klasse III ZREs.
DNA-bindende analyse av
in vitro
settes ZTA protein (Z) eller en uprogrammert oversettelse lysat (C) med både ikke-metylerte og metylerte versjoner av probene er angitt til høyre for hver gel ble utført ved EMSA som beskrevet i fig. 1. En titrering av ZTA protein (01:02, 01:04, 01:08) ble brukt til å sammenligne ikke-denaturert binding til den av denaturert tilsvarende. Kvantifisering av kompleksene som dannes mellom ZTA og de ikke-metylerte og metylerte prober, fra minst 2 eksperimenter, er representert som et histogram til høyre for den tilsvarende gel. Kompleksdannelse er vist i forhold til den maksimale binding for hver sonde. Feilfelt indikere standard feil
ZTA vises en reproduserbar interaksjon med ikke-metylert XPC oligonukleotid.; samspillet nådde 50% av bindingen observert med det metylerte oligonukleotid (figur 5). Dette øker muligheten for at XPC kjerne RpZRE3 element er påvirket av flankerende sekvens til å oppføre seg som en klasse II ZRE.
Tilleggs ZRE sidestilt med en RpZRE3-kjerneelement i flankerende område
For å identifisere enten sekvenser overdragelse metylering uavhengig anerkjennelse var begrenset til en bestemt flanken av XPC, en serie av mutante oligonukleotid sonder som utveksles flankesekvenser mellom XPC og en klasse III nettsted (MNT), som ikke gjenkjennes når ikke-denaturert, ble utformet. Analyse av interaksjonen med ZTA av EMSA viste at evnen til å meddele ZTA binding bodde innenfor 5′-sekvens av XPC; hybrid XPCLMNTR var i stand til å binde men MNTLXPCR var ikke (figur 6). Dette antydet at det 5′-flankerende sekvens XPC av RpZRE3 elementet påvirkes binding. Det var imidlertid overraskende å oppdage at mutasjon av RpZRE3 element innenfor XPC ikke hindre interaksjon med ZTA (figur 6).
(a) Skjematisk fremstilling av probene, som illustrerer XPC og MNT-prober, og den flanke swap prober XPCLMNTR og MNTLXPCR, ved siden av den tilsvarende EMSA analyse, utført på samme måte som beskrevet i fig. 1. (b) Kvantifisering av kompleksene dannet med hver sonde, fra 2 forsøk ble foretatt. Kompleksdannelse er representert som en prosentandel av den ZTA kompleks med den ikke-denaturert XPC probe. Feilfelt indikere standard feil. (C) Skjematisk fremstilling av prober, noe som indikerer muterte kjernesekvensen. EMSA-analyse ble utført som beskrevet i fig. 1. (d) Kvantitering av kompleksene dannet med hver sonde, fra 2 forsøk ble foretatt. Kompleksdannelse er representert som en prosentandel av den ZTA kompleks dannet med det ikke-denaturert XPC probe. Feilfelt indikere standard feil.
En ytterligere forklaring på samspillet av ZTA med ikke-metylert XPC arrangøren er at en obskur ZRE er til stede i 5 «flanke. For å møte dette ytterligere vi forsøkt å identifisere mulige ZREs i XPC arrangøren hjelp av transkripsjonsfaktor bindingssetet prediksjon program PROMO [44], [45]. Selv om dette programmet inneholder en PWM for ZTA bindingsseter, ble ingen spådde i denne sekvensen. Men PROMO spådd tilstedeværelse av AP1, c-fos og c-jun bindingssteder innenfor 5 «flanken av XPC (5’TGCGTCA) (figur 7). c-fos og c-jun proteiner er begge medlemmer av bzip transkripsjonsfaktor familien; de danner AP1 DNA-bindende aktivitet enten som homodimerer eller heterodimerer. Det er relevant at fos /Jul dimers dele noen DNA anerkjennelse motiver med ZTA [15] – [17], [31], [46] – [49]. Dette har ført til hypotesen om at den forutsagte AP1 sete i 5»-flankerende sekvens er en ytterligere ZRE som er ansvarlig for binding til den ikke-metylert XPC oligonukleotid. For å teste den hypotese, ble ytterligere mutasjoner innført i den 5 «flankerende sekvens XPC i den forutsagte AP1 området (5’TCCGCCT). Evnen til ZTA å interagere med dobbel AP1 /kjerne mutant område (XPCLM3Mcore) ble sammenlignet med den kjerne eneste mutant. Dobbel mutasjon av den forutsagte AP1 området og kjernen avskaffet evne ZTA til å samhandle med XPC oligonukleotid, noe som viser at binding av ZTA til den ikke-metylert XPC stedet bodde med dette AP1 området (figur 7).
(a) PROMO transkripsjonsfaktor bindingssetet prediksjon programvare identifisert en AP1 området som er markert i 5 «flanke sekvens av XPC. De spesifikke nukleotid mutasjoner er understreket. Kompleksene som dannes av EMSA er vist til høyre for den tilsvarende probesekvens. (B) Kvantitering av kompleksene dannet med hver sonde, fra 2 forsøk ble foretatt. Kompleksdannelse er representert som en prosentandel av den ZTA kompleks dannet med den XPC muterte kjerne probe. Feilfelt indikere standard feil.
Denne analysen viste at RpZRE3 kjerneelement ikke er anerkjent i sin ikke-denaturert tilstand i sammenheng med noen av de virale eller cellulære arrangører i RpZRE3-promoter-18 data-set, og at dette ZRE er spesielt anerkjent når metylert.
Diskusjoner
en beregnings søk avslørte et sett av 274 menneskelige gener med mobil arrangører som inneholder 7-mer RpZRE3 kjerneelement. Flankerende sekvens kan påvirke interaksjonen av noen transkripsjonsfaktorer med DNA, for eksempel, er interaksjonen av E2F familie med DNA påvirkes av en region på minst 8 nukleotider 5 «og 11 nukleotider 3» til den sentrale nukleotid [50]. Før tildeling av alle 274 gener som kandidater for regulering av ZTA, var det viktig å vurdere om beslektet flankerende sekvens hadde en dyp effekt på binding av ZTA. Betraktning av sekvensene som er representert i den flankerende sekvensen av dette sett av gener viste at den var variert; alle fire nukleotider var representert i 55% av posisjoner og tre av de fire nukleotider var representert ved de gjenværende stillinger. Faktisk er den umiddelbare flanken av RpZRE3 kjerneelement, som består av fire nukleotider både 5 «og 3», hadde 100% fremstilling av alle fire nukleotider. Det kan derfor konkluderes med at den flankerende sekvens ikke forhindrer binding til det metylerte RpZRE3 kjerne, og en PWM generert fra RpZRE3-promoter-18 datasettet viste liten bevaring utenfor kjernen motiv. I motsetning til interaksjon med det ikke-metylert kjerneelement først å ha vært påvirket av flankerende sekvens i kun en av de 18 promotorer. Imidlertid ytterligere analyse viste at dette er på grunn av tilstedeværelsen av en andre ZRE i den flankerende sekvens.
Disse resultater viser at tilnærmingen til å gjennomføre en beregningsmønstertilpasning søk etter de 7-mer RpZRE3 hovedelement er en rask og pålitelig metode for å identifisere arrangører som inneholder ZREs som er anerkjent av ZTA bare når de er metylert (klasse III ZREs)
Identifiseringen av to tilstøtende sidestilte ZREs i XPC arrangøren presenterer en interessant problem.; kan begge områdene bli okkupert på en gang? Den naturlige Stillingen av ZREs er tidligere blitt beskrevet for en viral promoter;
BZLF1 Hotell og celle promoter
EGR1
. I
BZLF1
promoter, er elementene plassert med 12 basepar mellom de sentrale nukleotider; begge kan være opptatt samtidig, og begge er funksjonelt relevante [17], [19] – [20]. For
EGR1
promoter, elementene er i umiddelbar nærhet med bare åtte nukleotider mellom de sentrale nukleotider [25], [26]. Det er ingen bevis for samtidig okkupasjon av ZTA og bare ett element ser ut til å være funksjonelle
in vivo product: [26]. Ordningen av
XPC
promoter plasserer elementene 8 nukleotider fra hverandre, identisk med
EGR1
, og det er ingen bevis fra DNA-bindende eksperimenter for samtidig okkupasjon av områdene. Som en ZRE er anerkjent i en metylering avhengig måte, og den andre føres når ikke-denaturert, er det mulig at ordningen kan gi en fail-safe mekanisme for å sikre at genet er regulert i begge sine denaturert og ikke-denaturert stater .
det enkle regne tilnærmingen til å identifisere plasseringen av denne metylering avhengig og romanen DNA-bindende motiv i menneskelige gen-arrangører identifisert 274 gener potensielt regulert ved å overvinne epigenetisk stanse i løpet av viral replika syklus. Gitt de kjente funksjonene ZTA i omprogrammering viral genekspresjon, forstyrre cellesykluskontroll og replikere viral DNA, er det interessant å merke seg at Gene Ontologi vilkår som er overrepresentert i RpZRE3-promoter-274 gen-settet er i stor grad involvert i transkripsjon, kromatin re-modellering og mitose. Dette antyder sterkt at ZTA kan aktivere dette settet med cellulære gener for å utføre disse funksjonene. Teste om disse genene aktiveres under ventetid avbrudd i minne B-lymfocytter
in vivo
er teknisk utfordrende gitt både knapphet på minne B-lymfocytter i perifert sirkulasjon og infrequency av latency avbrudd
in vivo
.
samlokalisering av RpZRE3 kjerneelement i 274 menneskelige arrangører er usannsynlig å ha vært drevet av en evolusjonær fordel for viruset, men kan gjenspeile involvering av en mobil transkripsjonsfaktor i samspill med samme element . Dette skulle tilsi at dette settet av gener deler en felles modus for regulering under menneskelig utvikling eller differensiering. Videre vil det være interessant å spørre om co-forekomst av RpZRE3-kjerneelement med andre transkripsjonsfaktor bindingssteder danner en co-operative
cis
-regulator modul som kan belyse regulering av disse verts og virale gener .
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
RpZRE3-promoter-274 data-set. En tabell av gener som inneholder en RpZRE3 kjerneelement i 500 bp promoter omegn doi: 10,1371 /journal.pone.0009443.s001 plakater (0,05 MB XLS )
takk
Vi takker Queensta Miller og James Heather for diskusjon.
