Abstract
Bakgrunn
Magekreft er en av de vanligste ondartede sykdommer over hele verden. Emerging bevis har vist at microRNAs (mirnas) er assosiert med tumor utvikling og progresjon. Våre tidligere studier har avdekket at
H. pylori
infeksjon var i stand til å indusere endret uttrykk for Mir-30b i mage epitelceller. Men lite er kjent om den potensielle rolle Mir-30b i magekreft.
Metoder
Vi analyserte uttrykk for Mir-30b i mage kreft cellelinjer og menneskelige mage kreft vev. Vi undersøkt effekten av MIR-30b etterligner på apoptose av magekreftceller in vitro ved flowcytometri (FCM) og caspase-3/7-aktivitet analyser. Naken mus xenograft-modell ble anvendt for å bestemme hvorvidt MIR-30b er involvert i tumordannelse av magekreft. Målet om MIR-30b ble identifisert av bioinformatikk analyse, luciferase assay og Western blot. Til slutt, vi utførte korrelasjonsanalyse mellom Mir-30b og målet uttrykk i magekreft.
Resultater
Mir-30b var signifikant nedregulert i mage kreftceller og menneske mage kreft vev. Tvangs uttrykk for Mir-30b fremmet apoptose av magekreftceller in vitro, og Mir-30b kan hemme tumorigenicity av magekreft ved å øke apoptose andel av kreftceller in vivo. Videre ble plasminogen aktivator inhibitor-1 (PAI-1) identifisert som potensielt mål av MIR-30b, og Mir-30b nivået ble omvendt korrelert med PAI-1 uttrykk i magekreft. I tillegg stanse av PAI-1 var i stand til å phenocopy virkningen av MIR-30b-overekspresjon på apoptose regulering av kreftceller, og overekspresjon av PAI-1, kan undertrykket effekten av å fremme celle apoptose av MIR-30b, som indikerer PAI-1 er potensielt involvert i Mir-30b-indusert apoptose på kreftceller.
Konklusjon
Mir-30b kan fungere som en roman tumor suppressor genet i magekreft ved å målrette PAI-1 og regulere apoptose av kreftceller. MIR-30b kan tjene som en potensiell biomarkør og terapeutisk mål mot magekreft
Citation. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) MIR-30b, nedregulert i magekreft, Fremmer apoptose og undertrykker tumorvekst ved Targeting plasminogenaktivatorinhibitor-en. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10,1371 /journal.pone.0106049
Redaktør: Gerolama Condorelli, Federico II Universitetet i Napoli, Italia, Italia
mottatt: 7 mai 2014; Godkjent: 28 juli 2014; Publisert: 29 august 2014
Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 81202310), Innovasjon Foundation of Third Military Medical University Scientific Research (No. 2009XQN20). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP forårsaker ca. 738 000 dødsfall per år, og det har blitt anerkjent som den tredje største årsaken til kreft dødsfall hos menn [1]. Tidlig diagnose og behandling har ført til gode forventninger til langsiktig overlevelse og god prognose, mens utsiktene for pasienter med avansert magekreft er fortsatt dårlig. Som andre kreftformer, er utvikling av magekreft antatt å være multifaktoriell.
Helicobacter pylori (H. Pylori)
infeksjonen har blitt anerkjent for å være en viktig årsak til magekreft [2]. Selv er rapportert mange genetiske og epigenetiske forandringer i magekreft, den molekylære mekanismen bak utviklingen av magekreft er fortsatt uklart.
microRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA som posttranscriptionally regulerer genekspresjon. Moden mirnas spesifikt kan binde seg til 3′-UTR av mål-cellulær mRNA i sin tur utløser mRNA degradering eller inhibering av translasjon [3], [4]. mirnas fungere som nøkkel regulatorer i en rekke forskjellige biologiske prosesser, inkludert utvikling, celledifferensiering, apoptose, metabolisme, og signaltransduksjon [5], [6]. Det er blitt vist at 50% av mirnas er ofte lokalisert ved kreft-assosiert genomiske regioner eller i sårbare områder [7]. Økende bevis har vist at avvikende mirnas uttrykk korrelerer med forskjellige humane kreftformer, og angir at mirnas kan fungere som oncogener eller tumor-suppressor-gener [8] – [10]. Nylig, et betydelig antall deregulerte mirnas inkludert MIR-106b-25 cluster, MIR-21, MIR-218, MIR-7, og MIR-335 har blitt identifisert som modulatorer av cellevekst, apoptose, migrasjon, eller invasjon i magekreft utvikling [11] – [15]. Disse funnene tyder på mirnas kan spille en avgjørende rolle i patogenesen av magekreft.
Våre tidligere studier har avdekket at
H. pylori
infeksjon var i stand til å indusere endret uttrykk av miRNAs i mage epitelceller inkludert MIR-155, MIR-146a og MIR-30b, kan mirnas fungere som nye negative regulatorer å finjustere
H. pylori
indusert inflammasjon [16], [17]. Videre viste vi at Mir-146a kan spille potensielle rolle i utviklingen av magekreft ved å modulere spredning og apoptose av magekreftceller [18]. Spesielt, har vi også funnet Mir-30b kan regulere autofagi prosessen under
H. pylori
vedvarer infeksjon, og dermed bidra til utholdenhet av
H. pylori
infeksjoner [19]. Imidlertid rollen til mir-30b i magekreft er fremdeles i stor grad ukjent.
plasminogenaktivator-inhibitor 1 (PAI-1) er hoved serin protease inhibitor av vevstype-(t-PA) og urokinasetype ( u-PA) plasminogenaktivator, og derfor spiller en viktig rolle i den plasminogen-plasmin system [20]. Tidligere studier har vist PAI-1 er en dårlig prognostisk faktor i flere vanlige tumorer, og er assosiert med kreftinvasjon og metastase [21]. Nylig har mange grupper også har funnet at PAI-1 kan fremme tumorvekst via inhibering av celle apoptose. For eksempel, tilsetning av en stabil villtype-PAI-1 i den humane prostatacancercellelinje PC-3, human promyelocytisk leukemicellelinje HL-60 og til og med ikke-tumorceller, resulterte i en signifikant inhibering av apoptose [22] . Når injisert subkutant i nakne mus med PAI-1 overekspresjon murine fibrosarkom-celler, ble tumorene raskt etablert, mens PAI-1-manglende celler hadde et undertrykt tumorgenisitet [23]. En annen rapport viste at genetisk og farmakologisk hemming av PAI-1 i humane tumorcellelinjer (HT-1080, A549, HCT-116, og MDA-MB-231) økt spontan apoptose, og interessant, implantert PAI-1 knockdown HT- 1080 celler til PAI-1 knockout mus resulterte i redusert tumordannelse og forlenget overlevelse sammenlignet med kontrollmus [24]. Disse studiene gir viktige bevis på at PAI-1 utøver en beskyttende rolle mot tumor celle apoptose.
I denne studien fant vi at Mir-30b var signifikant nedregulert i mage kreftceller og tumorvev. Ektopisk uttrykk for Mir-30b kan fremme apoptose av magekreft celle in vitro, og Mir-30b kan hemme tumorigenicity av magekreft i naken mus xenograft modell. Dessuten, PAI-1 ble identifisert som mulige mål for MIR-30b, og MIR-30b kan indusere apoptose og undertrykke tumorvekst ved å undertrykke ekspresjon av PAI-1. Våre funn tyder på at Mir-30b kan fungere som en roman tumor suppressor genet i magekreft og kan være en potensiell terapi mål for magekreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Etisk og Eksperimentell komiteen i tredje Military Medical University. Alle dyr kirurgi ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Studien omfatter vevsprøver ble godkjent av etikk Review Board på Third Military Medical University, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før deltakelse.
Vevsprøver
Totalt har magekreft vev og tilstøtende ikke-tumorvev ble oppnådd fra pasienter med primær magekreft som gjennomgår radikal gastrektomi på Southwest Hospital, Third Military Medical University, Kina, og clinicopathologic egenskapene til mage kreftpasienter er oppsummert i tabell 1. Etter kirurgisk fjerning, ble vevene frosset umiddelbart i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Studien ble godkjent av etikk vurdering bord på Third Military Medical University, og informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før deltakelse.
Cellelinjer og cellekultur
Alle cellelinjer brukes i denne studien ble innhentet fra Shanghai Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), den menneskelige mage kreft cellelinjer AGS var dyrket i Hams F12 (Hyclone) medium med 10% føtalt bovint serum (FBS), andre magekreft cellelinjer MKN45, HGC-27, BGC-823, SGC-7901 og humane embryonale nyre (HEK) 293-celler ble dyrket i DMEM (Hyclone) med 10% FBS, ble de alle opprettholdt i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C som tidligere beskrevet.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen), etterfulgt av en revers transkripsjon ved å bruke TaqMan miRNA assays (Ambion), med U6 liten kjerne RNA som en intern referanse normalisert. QRT-PCR-reaksjoner ble utført ved bruk av følgende parametere: 95 ° C i 2 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 sek. QRT-PCR-analyser av mRNA av PAI-1 ble utført ved hjelp av PrimeScript RT-PCR-sett (Takara), som de følgende parametere: 95 ° C i 30 s etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 5 s og 72 ° C i 30 sek. MRNA nivået av β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Sekvensene til primerne som brukes er vist i tabell 2.
Northern blot
Små størrelse RNA ble isolert ved anvendelse av Mirvana RNA Isolation Kit (Ambion). Tre par av kliniske prøver ble tilfeldig valgt ut fra de 21 pasienter for påfølgende Northern blot-analyse. Northern blot ble utført i henhold til standard prosedyre som descried tidligere [17]. De DNA-oligonukleotid antisense-prober anvendt for å detektere MIR-30b og U6 snRNA var som følger: MIR-30b (5’AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 «) og U6 (5′-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3»)
Cell transfeksjon.
Mir-30b etterligner, egge MIR-kontroll, kjemisk modifisert Mir-30b duplex (agomir), kjemisk modifisert egge MIR-kontroll, PAI-1 siRNA, eller siRNA negativ kontroll ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., Kina). PAI-1 (Serpine1) Menneskelig cDNA ORF Clone ble kjøpt fra Origene (Origene Technologies, Beijing, Kina). Transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll.
celle apoptose analyse av FCM
SGC-7901 eller HGC-27 celler ble sådd i 12-brønns plate ved en passende tetthet og dyrket til 30% konfluens etter 24 timer. Da celler ble transfektert med MIR-30b etterligner eller MIR-kontroll, og mediet ble erstattet med serum-fritt DMEM i 48 timer. For kotransfeksjonen eksperimentere med Mir-30b og PAI-1 som uttrykker vektor, ble SGC-7901 celler transfektert med MIR-kontroll eller Mir-30b etterligner, og deretter med PAI-1 Menneskelig cDNA ORF Clone vektor (angitt som PAI-1) eller tom vektor 24 timer senere. 24 timer etter transfeksjon vektor, ble mediet erstattet med serum-fritt DMEM i ytterligere 24 timer. Til slutt ble cellene tilført apoptose analyse. For FCM-analyse, en Annexin V-FITC apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen) ble brukt, deretter analysert ved flowcytometri (BD FACSCantoTM II).
caspase-Glo 3/7 analysen
aktiviteten av caspase-3/7 ble påvist ved anvendelse av caspase-Glo 3/7 Assay (Promega). Tilsett 100 ul av Caspase-Glo 3/7 reagens for å hvite vegger 96-brønns plate, bland forsiktig innholdet i brønnene, og deretter inkuberes i brønnene ved romtemperatur i 30 minutter. Den luminescens ble oppdaget ved hjelp av GloMax-96 Mikro luminometer (Promega).
tumorgenisiteten analyser i nakne mus
mus brukt i dette eksperimentet ble opprettholdt under spesielle patogenfrie forhold. Levedyktig MIR-30b mimics- og MIR-kontroll-transfekterte SGC-7901-celler (1 x 10
6) ble suspendert i 100 ul PBS og så injisert subkutant i hver side av den bakre flanke av den samme hunn BALB /c atymiske naken mus på 4 til 6 ukers alder som beskrevet tidligere [25]. Tumorvekst og det forhold, inkludert den generelle helse og opptreden av musene ble undersøkt hver tredje dag i 4 uker. Tumor beared mus viste ikke tegn til smerte eller ubehag som vekttap eller atferdsendringer, slik at alle musene ble avlivet ved CO
2 kvelning på dag 28 etter injeksjonen. Tumor volum (V) ble overvåket ved å måle lengden (L) og bredde (W) med calipers og beregnes med formelen (L x W
2) × 0,5.
TUNEL farging
tumorene ble høstet etter 26 dager, og fiksert i 10% formaldehyd-oppløsning, deretter innstøpt i parafin. Seksjoner (5 um tykk) som hadde blitt deparaffinized og rehydratiserte ble farget med hematoksylin og eosin. Apoptotiske tumorceller ble farget ved in situ terminal deoxynucleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) metode med bruk av en in situ celledød deteksjon kit (POD, Roche Diagnostics Co.). Negativ kontroll ble utsatt for den samme farging for TUNEL uten TdT. Bilder ble samlet inn ved hjelp av mikroskop med × 200 forstørrelse.
Konstruksjon av plasmider
bygging av ulike luciferasepreparater rapport vektorer for Mir-30b målet ble utført som tidligere beskrevet [16], [26] og konstruksjon inneholdende mutant avkom region ble generert som en kontroll. Sekvensene til oligonukleotider som brukes er vist i tabell 2.
Luciferase-analyse og GFP undertrykkelse eksperimenter
HEK-293-celler ble sådd i 96-brønn plate med 5000 celler per brønn på dag før transfeksjon. Cellene ble transfektert med hver ildflue luciferase reporter vektor, Renilla luciferase kontroll vektor, PRL-TK (Promega), og Mir-30b etterligner eller MIR-kontroll (GenePharma). Luciferase-assay ble utført ved hjelp av den dobbelte luciferase-rapportøranalysesystemet (Promega).
For GFP undertrykkelse eksperimenter, ble HEK-293-celler sådd i 12-brønns plate ved 1 x 10
5 per brønn i dagen før transfeksjon og deretter ble transfektert med Mir-30b etterligner eller MIR-kontroll med ulike GFP reporter vektorer. Cellene ble utsatt for flowcytometrisk analyse, og dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest Pro.
Western blot
Behandlede celler ble vasket med iskald PBS og deretter lysert ved en cellelyseringsbuffer (Pierce). Etter sentrifugering ved 12 000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C, ble proteinkonsentrasjonen målt ved hjelp av BCA-proteinanalysesettet (Pierce). Celle protein lysater ble separert på 12% SDS-polyakrylamidgel denaturert og deretter overført til en polyvinylidendifluorid-membran. Membranene ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltoppløsning, pH 7,4, inneholdende 0,05% Tween 20, og ble inkubert med primære antistoffer for PAI-1 (1:1000, Abcam) og β-aktin (1:1000 , Santa Cruz) ved 4 ° C natten over hhv. Membraner ble vasket og inkubert med pepperrot peroksidase-konjugert sekundære antistoffer (1:5000, Santa Cruz) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinet av interesse ble visualisert ved hjelp av ECL Western blotting substrat (Pierce) og Chemidoc XRS Gel Dokumentasjon System (BioRad).
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Students t test ble benyttet for å analysere forskjellene mellom gruppene. Forholdet mellom den MIR-30b nivå og PAI-1expression ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjon. Statistisk analyse ble utført med SPSS (versjon 17). Statistiske forskjeller ble erklært signifikant på
P
0,05 nivå. Statistisk signifikante data er merket med en stjerne (
P
0,05 (*),
P
. 0,01 (**)
Resultater
redusert MIR-30b uttrykk i humane mage kreft cellelinjer og prøver GC vev
for å finne ut hvilken rolle MIR-30b i patogenesen av magekreft, vi analyserte Mir-30b nivåer i ulike magekreftceller, inkludert HGC-27, AGS, BGC-823 og SGC-7901. Som vist i figur 1A, uttrykket av MIR-30b var signifikant nedregulert i fire cellelinjer sammenlignet med en pool av fem ikke-tumor mage vev (
P
. 0,01)
(A) Sammenligning av uttrykk nivå av Mir-30b mellom normal mageslimhinnen vevsprøver og mage kreft cellelinjer HGC-27, SGC-7901, BGC-823 og AGS . **
P
. . 0,01, sammenlignet med normalt vev (B) Relativ uttrykk for Mir-30b i 21 mage kreft vev sammenlignet med matchede tilstøtende ikke-tumor mage vev (C) Sammenligning av gjennomsnittlig uttrykk for MIR-30b i to grupper av B. data representerer gjennomsnitt ± SD **
P
0,01, sammenlignet med normal mageslimhinnen. (D) Analyse av Mir-30b uttrykk ved hjelp av Northern blotting. Total RNA ble ekstrahert fra tre sammenkoblede magekreft (T) og tilstøtende ikke-kreft gastrisk vev (N), som ble tilfeldig valgt fra alle pasienter. RNA ble hybridisert sekvensielt med Mir-30b og U6 sonde, og U6 ble brukt som en kontroll for RNA lasting.
uttrykk for MIR-30b ble videre undersøkt i 21 paret GC og tilstøtende ikke-tumor mage vev gjennom TaqMan kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR). Som vist i figur 1B ble nedgang på MIR-30b funnet i 18 av 21 pasienter (85,7%) sammenlignet med tilsvarende ikke-tumorvev. Videre har spredningsdiagrammet viste at MIR-30b ble signifikant nedregulert i magecancerprøver versus normal gastrisk mucosa, med en gjennomsnittlig 6,28 ganger reduksjon (
P
= 0,002) (figur 1C). For å validere uttrykket data innhentet fra QRT-PCR, 3 av alle 21 parene prøvene var tilfeldig valgte å bestemme nivået av MIR-30b ved hjelp av Nord-bolt. Vi fant også konsistent nedsatt ekspresjon av MIR-30b i magekreft, sammenlignet med ikke-tumor gastrisk vev (figur 1D). Disse resultatene tyder på at Mir-30b uttrykk er ofte nedregulert i magekreft og kanskje er involvert i utviklingen av magekreft.
Overuttrykte Mir-30b øker apoptose av magekreftceller
en av kjennemerket på kreft er dens evne til å unngå apoptose [27], så vi undersøkt effekten av MIR-30b på magekreftceller apoptose. SGC-7901 eller HGC-27 celler ble transfektert med Mir-30b etterligner eller egge MIR-kontroll, og gyldigheten av MIR-30b ektopisk uttrykk ble bekreftet ved QRT-PCR (figur 2A). Da effekten av MIR-30b på apoptose av SGC-7901 eller HGC-27 celler ble evaluert ved flowcytometri (FCM) analyse og caspase-3/7 aktivitetsanalyser. Som vist i figur 2B og 2C, fant vi at andelen av apoptotiske celler ble betydelig økt i SGC-7901 eller HGC-27 celler transfektert med Mir-30b ligner sammenlignet med MIR-kontroll-transfekterte celler (16,08%
mot
8,25% til SGC-7901 celler, og 17,83%
versus
10,87% til HGC-27 celler). Videre ble signifikant økning i caspase-3/7 aktivitet funnet i SGC-7901 eller HGC-27 celler transfektert med Mir-30b sammenlignet med MIR-kontroll transfektanter (
P
0,01, figur 2D). Over Resultatene viser at overekspresjon av Mir-30b kan fremme apoptose av magekreft in vitro.
(A) Relativ uttrykk for Mir-30b i AGS, HGC-27, og SGC-7901 celler transfektert med speil 30b etterligner eller MIR-kontroll i 48 timer. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter, ***
P
0,001. (B) Effekten av MIR-30b på apoptose ble undersøkt av FCM-analyse. SGC-7901 eller HGC-27-celler ble transfektert med MIR-30b etterligner eller MIR-kontroll, og deretter ble mediet erstattet med serum-fritt DMEM i 48 timer, ble cellene analysert for apoptotiske hastighet etter farging med Annexin V-FITC og PI . Data representerer gjennomsnitt ± S.D. fra fire uavhengige forsøk, **
P
0,01. vises (C) En representant FCM-analyse i B. (D) SGC-7901 eller HGC-27 celler ble transfektert med Mir-30b etterligner eller MIR-kontroll i 48 timer. Aktiviteten av kaspase-3 og kaspase-7 ble påvist ved anvendelse av caspase-Glo 3/7 analysen. Dataene er gjennomsnitt ± S.D. 6 duplikasjoner fra fire uavhengige forsøk, **
P
. 0,01
Mir-30b undertrykker tumorigenicity og fremmer celle apoptose in vivo
For å kunne fastslå enten MIR-30b er involvert i tumordannelse av magekreft, var naken mus xenograft modell som brukes. Fordi vi fant ut at Mir-30b spilt en mer betydelig rolle i å fremme SGC-7901 celler apoptose enn HGC-27 celler in vitro, utforske vi rollen som MIR-30b i tumorigenesis av magekreft ved hjelp SGC-7901 celler. MIR-kontroll- og Mir-30b-transfekterte SGC-7901 celler ble injisert subkutant i enten bakre flanken av de samme nakne mus. Musene ble fulgt for observasjon av xenograft vekst i 4 uker. Det ble funnet at innføringen av MIR-30b inn i SGC-7901-celler førte til en betydelig reduksjon i størrelsen av tumorvolum (figur 3A og 3B), og tumorer avledet fra MIR-30b behandlet SGC-7901-celler vokste langsommere sammenlignet med kontrollen gruppen under hele tumorvekst perioden (figur 3C, venstre panel). Når svulster ble høstet, gjennomsnittlig volum av tumorer avledet fra Mir-30b ligner gruppen var bare 27,87% av det i MIR-kontrollgruppen (figur 3C høyre panel,
P
0,01). Tumorene ble høstet etter 26 dager fra to sider av den bakre flanke av den samme mus, ble apoptose in situ målt ved TUNEL. Som vist i figur 3D, tumorsnitt fra MIR-30b ligner behandlede xenotransplantater viste en betydelig økning i TUNEL-positive celler. Disse resultatene sterkt antydet at innføringen av Mir-30b kan hemme magekreft vekst ved å fremme apoptose av kreftceller.
(A) Effekt ofmiR-30b på tumordannelse in vivo xenograft modus. MIR-kontroll- og MIR-30b-transfekterte SGC-7901 (1 x 10
6) ble suspendert i 100 ul PBS og så injisert subkutant i hver side av den bakre flanke av den samme hunn BALB /c atymiske nakne mus. To representative tumorbærende mus etter 4 uker vaksinasjonen ble vist. (B) Den betydelige forskjeller i tumorvolumet mellom MIR-kontrollgruppe og Mir-30b gruppe fra 6 mus. (C) Den tumorvolum ble målt hver tredje dag etter injeksjon av SGC-7901-celler med behandling som beskrevet i A, og tumorvekstkurve ble vist. Forskjellen av tumorstørrelse mellom MIR-kontrollgruppe og Mir-30b gruppen var statistisk signifikant, ** P 0,01. (D) Tumorene ble høstet etter 26 dager fra to sider av den bakre flanke av den samme mus, ble apoptose in situ målt ved TUNEL. Alle data ovenfor er representative minst tre uavhengige eksperimenter.
PAI-1 er en kandidat målet genet fra Mir-30b
For å vurdere funksjonen av MIR-30b videre, er det viktig å finne ut hvilke verts mRNA blir regulert av Mir-30b. I vår forrige undersøkelse, vi undersøkte mRNA uttrykk profilen i fem par primære tumor vev av magekreftpasienter og matchet ikke-tumorvev ved hjelp av microarray. Helt, fant vi 303 oppregulert gener (fold change 2,
P
0,05) i mage kreft vev sammenlignet med ikke-tumorvev (data ikke vist). Vurderer downregulated uttrykk for Mir-30b i magekreft, fokuserte vi på listen over gener som viser økt uttrykk og valgt de 30 beste økte gener i magekreft, så bestemt om disse genene var potensielle mål av Mir-30b ved hjelp prediksjon algoritme , TargetScan. Interessant, fant vi ut at PAI-1 genet som ble oppregulert i microarray (3,83 ganger,
P
= 0,04) kan være et sannsynlig mål gen fra Mir-30b (figur 4A). For å direkte adresse om Mir-30b binder seg til 3′-UTR av målet mRNA, bygget vi luciferase rapport vektorer som inneholder den antatte Mir-30b bindingssteder innenfor 3′-UTR. Som vist i figur 4B, observerte vi en markert reduksjon i luciferase aktivitet (
P
0,01) etter contransfection av luciferase rapport vektorer og Mir-30b etterligner. I motsetning til dette ble ingen endring av luciferase observert i celler transfektert med den mutante 3′-UTR-konstruksjoner. Dette resultatet ble senere bekreftet av GFP undertrykkelse eksperimenter. Som vist på figur 4C og 4D, ble GFP fluorescens signifikant redusert i celler transfektert med GFP rapport vektorer inneholdende bindingsseter og MIR-30b etterligner, mens det var ingen forandring av GFP fluorescens i celler transfektert med mutante vektor og MIR-30b etterligner. Videre er overekspresjon av MIR-30b i AGS og HGC-27-celler resulterte i nedregulering av protein nivåer av PAI-1 (figur 4E). Til sammen over data tyder på at PAI-1 er et potensielt mål av MIR-30b, og Mir-30b kan nedregulerer målet protein.
(A) Sekvens justering av MIR-30b og dens målse i 3′-UTR av PAI-1. (B) HEK293 celler ble transient transfektert med luciferase rapport vektorer, og enten Mir-30b etterligner eller MIR-kontroll. Luciferase-aktivitet ble normalisert til aktiviteten av Renilla luciferase. (C og D) HEK-293-celler ble transfektert med GFP rapport vektor eller mutant vektor, og enten MIR-30b etterligner eller MIR-kontroll. GFP fluorescens ble overvåket ved fluorescens mikroskop og FCM-analyse. (E) Western blot analyse for PAI-1 av AGS og HGC-27 celler transfektert med Mir-30b etterligner eller MIR-kontroll. Alle data ovenfor er representative for minst tre uavhengige eksperimenter, **
P
. 0,01
Inverse sammenheng mellom mir-30b og PAI-1 uttrykk i mage kreft vev og kreftcellelinjer
i betraktning at MIR-30b er nedregulert i magekreft, og det har blitt rapportert at PAI-1-protein i magekreft vev er dramatisk høyere enn i de ikke-tumorvev, [28], vi utførte korrelasjonsanalyse mellom Mir-30b og PAI-1 uttrykk i mage kreft cellelinjer og mage kreft vev. Som vist i figur 5A topp, PAI-1 proteinnivå var lavest i AGS celle blant de fem gastriske cellelinjer. I motsetning til dette, MIR-30b nivå var den høyeste i AGS, sammenlignet med andre cellelinjer (figur 5A nederst). Deretter undersøkte vi PAI-1 og MIR-30b uttrykk i 21 sett med magekreft og tilstøtende ikke-tumorvev. Vi fant at 81% (17/21) av magekreft viste høyere PAI-1 mRNA, sammenlignet med normale vev. I kontrast, Mir-30b ble ofte nedregulert i 18 av 21 svulster. Ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse, observerte vi en signifikant invers korrelasjon mellom Mir-30b og PAI-1 mRNA (Figur 5B,
R
= -0,6475,
P
= 0,0123). Over resultater tyder på at Mir-30b uttrykk er inverst korrelert med PAI-1 uttrykk i magekreft, og forbedret PAI-1 uttrykk i magekreft kan være et resultat av redusert Mir-30b uttrykk.
(A) uttrykk for mir-30b og PAI-1 i mage kreft cellelinjer MKN45, MGC-823, SGC-7901, AGS og HGC-27. Top, western blot analyse av PAI-1 protein nivåer; bunn, QRT-PCR analyse av Mir-30b nivåer. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. (B) MIR-30b og PAI-1 mRNA nivåer i mage kreft vev ble analysert ved QRT-PCR. Det innfelte grafen viste en statistisk signifikant invers korrelasjon (
R
= -0,6475,
P
= 0,0123). U6 og β-aktin fungert som interne normaliserte referanser for Mir-30b og PAI-1 mRNA, henholdsvis.
PAI-1 er potensielt involvert i Mir-30b-indusert apoptose
for ytterligere å undersøke om PAI-1 er involvert i Mir-30b-forfremmet apoptose, vi først testet hvis stanse av PAI-1 uttrykk kan ha lignende apoptose fremmende effekt som Mir-30b overekspresjon. SGC-7901-celler ble transfektert med PAI-1 siRNA eller negativ kontroll-RNA (NC) i 48 timer, som vist i figur 6A, kan mRNA-nivåer av PAI-1 bli vesentlig redusert ved sin siRNA. Deretter vises PAI-1 siRNA åpenbare økninger i den apoptotiske hastighet i SGC-7901-celler (Figur 6b, 6c), sammenlignet med MIR-kontroll. Spesielt, PAI-1 siRNA var i stand til å phenocopy effekten av MIR-30b overekspresjon på apoptose regulering av kreftcelle (figur 6B, 6C). En representant eksempel på prikkplott ble vist i figur 6D. Neste, vi også undersøkt om PAI-1 kan oppheve effekten av å fremme apoptose av Mir-30b. SGC-7901-celler ble transfektert med MIR-kontroll eller MIR-30b ligner i 24 timer, og etterfulgt av transfeksjon med PAI-1 human cDNA ORF-klone-vektor (indikert som PAI-1) eller tom vektor. Som vist i figur 6E-G, er overekspresjon av PAI-1 resulterte i tydelig undertrykkelse på effekten av MIR-30b-indusert apoptose. Til sammen våre resultater tyder på at PAI-1 er potensielt involvert i Mir-30b-forfremmet apoptose.
(A) PAI-1 siRNA hemmer uttrykk for PAI-1 effektivt på mRNA nivåer. RT-PCR ble anvendt for å overvåke ekspresjon av PAI-1 48 timer etter transfeksjon med siRNA for PAI-1 eller negativ kontroll RNA, β-actin tjente som en intern kontroll. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter, **
P
0,01. (B) SGC-7901-celler ble transfektert med MIR-kontroll, MIR-30b eller PAI-1 siRNA, og mediet ble erstattet med serum-fritt DMEM i 48 timer, den aktivitet av kaspase-3 og kaspase-7 ble detektert ved å bruke caspase-Glo 3/7 analysen. Dataene er gjennomsnitt ± S.D. 6 duplikasjoner fra tre uavhengige eksperimenter, **
P
0,01. (C) SGC-7901-celler ble behandlet som (B), og deretter ble cellene analysert for apoptotisk hastighet etter farging med Annexin V-FITC og PI. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter, **
P
0,01. (D) En representant FCM-analyse i (C) ble vist. (E) SGC-7901 celler ble først transfektert med MIR-kontroll eller Mir-30b etterligner, og deretter med PAI-1 Menneskelig cDNA ORF Clone vektor (angitt som PAI-1) eller tom vektor 24 timer senere. 24 timer etter transfeksjon vektor, ble mediet erstattet med serum-fritt DMEM i ytterligere 24 timer, og til slutt den aktivitet av kaspase-3 og kaspase-7 ble påvist ved anvendelse av caspase-Glo 3/7 analysen. Dataene er gjennomsnitt ± S.D. 6 duplikasjoner fra tre uavhengige eksperimenter, **
P
0,01. (F) SGC-7901-celler ble behandlet som (E), og til slutt ble cellene analysert for apoptotisk hastighet etter farging med Annexin V-FITC og PI. Data representerer gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter, **
P
0,01.
