Abstract
C-reaktivt protein (CRP) er en etablert markør for inflammasjon med mønstergjenkjenning reseptor-lignende aktiviteter. Til tross for den nære tilknytning av serumnivået av CRP med risiko og prognose av flere typer kreft, gjenstår det unnvikende om CRP bidrar direkte til tumorgenese, eller bare utgjør en tilskuer markør. Vi har nylig identifisert tilbakevendende mutasjoner i SNP posisjon -286 (rs3091244) i arrangøren av
CRP
genet i flere krefttyper, i stedet tyder på at lokalt produsert CRP er en potensiell sjåfør av tumorigenesis. Det er imidlertid ukjent om -286 nettstedet er den eneste SNP stilling
CRP
genet målrettet for mutasjon og om det er noen sammenheng mellom
CRP
SNP mutasjoner og andre ofte muterte gener i svulster . Heri, har vi undersøkt genotyper av tre felles
CRP
ikke-koding SNPs (rs7553007, rs1205, rs3093077) i tumor /normal prøve par 5 krefttyper (n = 141). Ingen tilbakevendende somatiske mutasjoner er funnet på disse SNP posisjoner, noe som indikerer at -286 SNP mutasjonene er fortrinnsvis valgt under utviklingen av kreft. Videre analyser viser at de -286 SNP mutasjoner av
CRP
tendens til å co-skje med mutert
APC
spesielt i endetarmskreft (
p
= 0,04, n = 67) . I motsetning mutasjoner av
CRP Hotell og
p53
eller
K-ras
synes å være irrelevant. Det resultatene så understreker den funksjonelle betydningen av -286 mutasjon av
CRP
i tumorigenesis og innebærer et samspill mellom CRP og Wnt signalveien
Citation. Su HX, Zhou HH, Wang MY, Cheng J, Zhang SC, Hui F et al. (2014) Mutasjoner av
C-reaktivt protein product: (
CRP
) -286 SNP,
APC Hotell og
p53
i Colorectal Cancer: Implikasjon for en CRP-Wnt Crosstalk. PLoS ONE 9 (7): e102418. doi: 10,1371 /journal.pone.0102418
Redaktør: Qing Song, Morehouse School of Medicine, USA
mottatt: 5 mars 2014; Godkjent: 18 juni 2014; Publisert: 15.07.2014
Copyright: © 2014 Su et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi i Kina [tilskuddet antallet 2011CB910500]; Natural Science Foundation of China National [tilskuddsnummer 30930024, 31222015, 31270813, 31170696]; Kunnskapsdepartementet i Kina [tilskudds tall PCSIRT: IRT1137, 121108]; Gansu-provinsen [tilskuddet Nummer: 1011FKCA089]; og Lanzhou University [tilskuddsnummer: lzujbky-2013-bt05, lzujbky-2014-86]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betennelse er essensielt for utvikling av kreft [1], [2]. Som en stor human akutt fase-reaktant, er C-reaktivt protein (CRP) er mye brukt som en ikke-spesifikk markør for inflammasjon [3], [4]. Imidlertid, samler bevis har åpenbart en nær sammenheng mellom serumnivået av CRP og den risiko og prognose av kreft [5]. Gitt de antatte funksjoner av CRP i vertens forsvar og medfødt immunitet [6], [7], er det sannsynlig at CRP kan spille en direkte rolle i tumorigenesis. Faktisk CRP er blitt rapportert å forhindre apoptose av myelomceller [8], og for å lette invasivitet av brystkreftceller [9]. Videre kan CRP bidra til etablering av en gunstig tumor mikromiljøet ved å fremme angiogenese [10], ved å inhibere den destruktive aktivering av komplement [11], [12], og ved å indusere proinflammatoriske cytokiner fra immun og endotelceller [3], [ ,,,0],13], [14].
på den annen side, enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) som forbinder med genetisk forhøyede konsentrasjoner av CRP ikke gi en økt kreftrisiko for den generelle befolkningen [15]. Dette tyder på at sirkulerende CRP er ikke årsaks involvert i tumorigenesis. Intriguingly, i motsetning til de tidligere nevnte pro-canceraktiviteter, tidlige studier har også dokumentert anti-kreft virkninger av CRP gjennom aktivering av makrofag /monocytt-[16] – [18]. Derfor har det vært vanskelig å definere om CRP er kun en passiv markør eller en aktiv aktør i kreft, eller å dissekere den eksakte bidraget av CRP i tumorigenesis
Serum CRP er produsert av hepatocytter i leveren.; imidlertid, samler bevis viser også en lokal produksjon av CRP ved ekstra-leverceller [3], [19]. Interessant, har vi nylig funnet ut at arrangøren av
CRP
er spesielt mutert ved SNP posisjon (rs3091244) 286 bp oppstrøms transkripsjonsstartsetet i 109 ut av 453 tumorprøver, men ikke i de samsvar normale kontroller [19 ]. Disse mutasjonene er assosiert med økt lokal
CRP
induksjon i tumorer sannsynlig via forstyrrelse av den konserverte CpG metylering motiv. Videre har de fleste av de krefttypene som ble undersøkt huse den -286 mutasjonen og fraksjonen av det muterte allel er høy (0,487, 95% CI: 0,477 til 0,517). Disse funnene støtter dermed rollen som CRP produsert
in situ
som en potensiell kreft driver som er trolig involvert i generelle mekanismer favorisering tumorigenesis [19].
I tillegg til -286 SNP, er det flere flere vanlige ikke-koding SNPs som vesentlig påvirker baseline nivå av serum CRP. Representantene inkluderer rs7553007, rs1205 og rs3093077 [15], [20], [21]. Det er derfor av interesse om disse SNP nettstedene er også målrettet for mutasjon i svulster. Vi viser her ved genotyping av 141 kreft /normale prøve parene som ingen tilbakevendende mutasjoner oppstår på 3
CRP
SNP områder, og dermed fremhever at -286 mutasjoner er svært spesifikke for tumorigenesis. Vi videre undersøkt om det er noen sammenheng mellom -286 mutasjoner av
CRP Hotell og andre ofte muterte gener i svulster. Det identifiserte sammenheng mellom -286 og
APC
mutasjoner innebærer et samspill av CRP med Wnt signal.
Materialer og metoder
Frozen tumor /normal vevsprøve parene ble oppnådd fra vevet bank av Gansu Provincial Tumor Hospital. Genomisk DNA ble isolert fra vev eller blodprøver med DNAiso Reagens eller Blood Genome DNA Extraction Kit (Takara) i henhold til produsentens instruksjoner. For identifisering av genmutasjoner, ble genomisk DNA forsterket med spesifikke primere (human
CRP
: fremover: 5′-AGGGGGGAGGGATAGCATTAGAA-3 «; omvendt: 5′-CGTCCTGCTGCCAGTGATACAAG-3»; menneskelig
p53
: fremover: 5′-CTGTCCCTTCCCAGAAAACCT-3 «; omvendt: 5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTC-3»; menneskelig
APC
: fremover: 5′-TAATACCCTGCAAATAGCAGAAATA-3 «; omvendt: 5»-GTGGCAAAATGTAATAAAGTATCAG-3 «; humane
K-ras
: frem: 5′-ATGACTGAATATAAACTTGTGGTA-3′, omvendt: 5′-CAACACCCTGTCTTGTCTT-3 «) etterfulgt av sekvensering. Genotyping av 24 SNPs (rs7553007, rs1205, rs3093077, rs4073, rs1143627, rs720816, rs723504, rs1876054, rs746961, rs2371923, rs487616, rs953183, rs400328, rs950487, rs759394, rs726402, rs1568645, rs929689, rs2254896, rs1951096, rs1843026, rs1543193, rs718015 , rs16091) ble utført ved massespektrometri-baserte Sequenom tjeneste (Genergi Biotechnology, Shanghai, Kina). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter. Alle pasienter er kinesisk. Studien ble godkjent av Ethic komiteen av Tumor Hospital Gansu Provincial.
Resultater
Ingen tilbakevendende somatiske mutasjoner oppstår ved tre felles
CRP
SNP steder i svulster
for å se om andre ikke-kodende SNP områder av
CRP
er mutert i tumorer, vi konkludert med at genotyper av 3
CRP
vanlige SNPs (rs7553007, rs1205, og rs3093077) sammen med 21 flere SNPs i 141 tumor /normal prøve par 5 krefttyper,
dvs.
mage, lunge, spiserør, tykktarm og endetarm kreft. Frekvensene for alleler forbundet med lavere CRP-nivå er 48,9% for en allel av rs7553007, 47,9% for T allel av rs1205, og 79,1% for T allel av rs3093077 i normale prøver (tabell 1), og dermed gi tilstrekkelig prøvestørrelsene for deteksjon av tilbakevendende mutasjoner. Derfor har vi identifisert bare en sak av G En mutasjon på rs7553007, 0 tilfelle av mutasjon ved rs1205, og 2 tilfeller av G T mutasjoner ved rs3093077 i matchet tumorprøver. En slik lav forekomst av somatisk mutasjon ble også funnet for 21 andre undersøkte ikke-koding SNP sider fordelt på 9 forskjellige kromosomer (figur 1). Disse viser at, i motsetning til de svært tilbakevendende
CRP
-286 SNP (rs3091244) mutasjoner [19], den 3
CRP
SNP nettsider analysert her, er bare tilfeldig mutert i svulster på bakgrunnen mutasjonsfrekvens.
3
CRP
SNPs (rs7553007, rs1205, og rs3093077) og 21 flere SNPs av 141 kreft /normale prøve parene ble genotypet ved Sequenom. Disse prøvene ble samlet fra 37 magesekken, 12 lunge, spiserør 27, 24 kolon og 41 rektale kreftpasienter. (A) De mutasjonsfrekvenser på hver SNP nettsteder. Ingen av disse områdene er recurrently mutert i svulster. Frekvensen av
CRP
-286 SNP (rs3091244) mutasjon i disse prøvene er vist for sammenligning. (B) Den samlede mutasjons frekvenser av SNPs med eller uten tilhørende gener. Gene-forbundet SNP nettsteder har en tendens til å stille lavere mutasjonsfrekvenser riktignok uten å nå statistisk signifikans (to sample
t
test, to-tailed,
p
= 0,47).
Ifølge genotyping resultater, mutasjons frekvenser av SNP områder med og uten tilhørende genene er 0,97% (95% KI: 0,35 til 1,59%) og 1,30% (95% KI: 0,78 til 1,82%), henholdsvis . Selv om det ikke er statistisk signifikant, tyder dette på at gen-forbundet SNP nettsteder tendens til å være mindre utsatt for tilfeldig mutasjon enn de med ukjent forening, muligens på grunn av begrensninger som begrenser skader på genomisk loci med funksjonell betydning. Av genet assosierte SNPs, rs1143627 og rs4073 er to promoter SNPs som finner på 31 og 199 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsider av
IL-1β Hotell og
IL-8
, henholdsvis. Deres lave mutasjons frekvenser (0,7 til 1,4%) hevder at arrangøren lokalisering
per se
er ikke sannsynlig årsaken til somatisk hypermutasjon på
CRP
-286 SNP-site i tumorer; heller, vil den høye forekomsten av den -286 mutasjonen være et resultat av funksjonelle konsekvenser knyttet til den forbedrede induksjon av
CRP
, noe som kan gi vertscellekloner tilstrekkelig til fordel for å overleve og vokse i utvikling av kreft.
CRP
-286 SNP mutasjon er assosiert med mutert
APC
i endetarmskreft
CRP
-286 SNP mutasjon er mest utbredt i tykktarm kreft [19], der
p53
,
K-ras
og
APC
er blant de hyppigst muterte gener som fremmer tumorigenesis via forskjellige mekanismer [22 ] – [24]. Vi derfor søkt å undersøke om det er noen sammenheng mellom disse mutasjon hendelser. Mutert
p53
,
K-ras
og
APC
ble identifisert ved sekvensering av sine respektive hotspot mutasjon regioner,
dvs.
301-1044 av
p53
, 24-442 av
K-ras
, og 3922-4453 av
APC
i cDNA sekvens varierer, ifølge statistikken fra COSMIC database. Til tross for sin høye forekomst (ca. 50%),
CRP-
286 SNP mutasjoner viser ingen åpenbar sammenheng med mutert
p53 product: (n = 35; Tabell 2 og 2A.) Eller
K-ras
(n = 35; tabell 3 og 2B fig.). Mangelen på sammenheng mellom
p53 Hotell og
CRP
-286 SNP mutasjoner ble også bekreftet i spiserøret kreft (n = 36;. Tabell 4 og 2C figur), hvor
p53
representerer den hyppigst muterte genet.
CRP
-286 SNP mutasjoner viser ingen sammenheng med mutert
p53
eller
K-ras
i kolon (AB) eller spiserør kreft (C) (Fishers eksakte test, to-tailed). Hvert rektangel representerer en tumorprøve med grå farge angir vill type status. Baren grafene til høyre viser hvor mange prosent av pasientene bærer de angitte mutasjoner i to pasientgrupper med eller uten CRP-286 mutasjoner.
I motsetning, en to fold berikelse av mutant
APC
ble observert i colontumorer med samtidig
CRP
-286 SNP mutasjoner (n = 38, Tabell 5 og Figur 3A). Men gjorde en slik sammenheng ikke nå statistisk signifikans trolig på grunn av den begrensede størrelsen på utvalget som vi kunne få. Vi har derfor ytterligere undersøkt 67 tumor /normale prøve par av endetarmskreft (tabell 6 og figur 3B), som er svært lik tykktarmskreft i både celletype sted genomiske endringer [25] som viser høy forekomst av både
APC
[25] og
CRP
-286 SNP mutasjoner [19]. Faktisk er co-forekomst av disse to mutasjoner i dette prøvesettet ble mer tydelig (odds ratio: 5,56, 95% KI: 1,17 til 26,36) og signifikant (
p
= 0,04). Disse resultatene tyder dermed på at CRP og APC kan samarbeide i overlappende baner under utvikling av tykktarmskreft.
CRP
-286 SNP mutasjoner tendens til å co-skje med
APC
mutasjoner i tykktarmen (A) (Fishers eksakte test, to-tailed,
p
= 0,47) og endetarmskreft (B) (Fishers eksakte test, to-tailed,
p
= 0,04 ). Hvert rektangel representerer en tumorprøve med grå farge angir vill type status. Baren grafene til høyre angir hvor mange prosent av pasientene bærer APC-mutasjoner i to pasientgrupper med eller uten CRP-286 mutasjoner.
Diskusjoner
in vitro
aktivitetene av CRP [3], [4], [6], [11], [13], [14], herunder gjenkjennelse av endogene eller eksogene faresignaler, regulering av komplementaktivering, induksjon av proinflammatoriske celle responser, fører til ideen om at CRP kan fungere som en løselig mønstergjenkjennings reseptor i medfødt immunitet og vertens forsvar [6], [7]. Men mangelen på samsvar støtte ved forskning på dyremodeller [26] – [34], humane individer [35], [36] og genetisk epidemiologi [15], [20], [21], [37], blir det usikkert om CRP spiller noen vesentlig rolle i kronisk betennelse
in vivo
eller bare representerer en uspesifikk markør som antydet av sin akutte fase uttrykk mønster. I denne forbindelse, identifisering av den svært tilbakevendende
CRP
-286 SNP mutasjoner i flere typer kreft hos mennesker [19] gir en overbevisende bevis for at dette proteinet er en potensiell sjåfør av tumordannelse og en kjernekomponent av regelverket nettverk av betennelse.
Arrangøren mutasjoner i
TERT product: [38], [39] og
CRP product: [19] utgjør de første eksemplene på at ikke-kodende regulatoriske områder kan også være målrettet for å fremme tumorigenesis ved å modulere uttrykk i stedet for aktivitetene til viktige gener. Imidlertid er det noe unikt i tilfelle av
CRP
at mutasjonen finner sted ved en felles SNP område. Dette reiser bekymring om SNP nettsteder er generelt mer utsatt for genetiske endringer, som fører til den høye forekomsten av person mutasjoner. For å møte denne bekymringen, genotypet vi 24 SNPs av 141 kreft /normale prøve par. Disse SNP’er er plassert på 9 forskjellige kromosomer, og består av 3 SNP av
CRP
, 2-promoteren SNP’er av inflammatoriske cytokiner, en SNP av en ikke-kodende gen, 18 SNP’er med ukjent krets. Til tross for dette, ble alle de SNP områder syntes å være mutert i tumorer med bare lav bakgrunn frekvens. Derfor er det svært tilbakevendende mutasjon på
CRP
-286 SNP området mest sannsynlig et resultat av utvalget ved kreftutvikling, men ikke bare på grunn av generelle egenskaper knyttet til SNP nettstedet eller genomisk plassering. Det er imidlertid fortsatt mulig at den -286 mutasjonen er bare en konsekvens av tumorigenese og ytterligere funksjonelle analyser er nødvendige for å klargjøre dette punkt.
Ikke desto mindre er det interessant at selv om fire undersøkte
CRP
SNPs alle påvirker serumnivå av CRP, er det bare -286 SNP målrettet av tumorigenesis. Dette tyder på at effekten av de andre 3 SNPs er sekundære til -286 SNP, som kan delvis forklares med avhengighet av
CRP
uttrykk på arrangøren CpG metylering, en viktig epigenetisk mekanisme i genet stanse [ ,,,0],40]. Faktisk har vi nylig vist at høy CRP uttrykk er korrelert med lav promoter metylering, og vice versa [19]. Av de 5 CpG-motivene i
CRP
promoteren, evolusjonært konservert -286 CpG ser ut til å være nøkkelen, særlig for ekstrahepatiske celletyper, i bestemmelse av basalnivået av
CRP
uttrykk [19] . Ettersom de fleste av -286 mutasjoner er C A /T-overganger som forstyrrer metylering motiv, er det sannsynlig at slike genetiske endringer vil i sin tur bidra til å slå på promoteraktivitet av
CRP
sannsynlig via senke hemmende metylering signal og legge til rette for binding av transkripsjonsfaktorer til den underliggende E-box sekvens [41]. Disse kan etter hvert gi den påfølgende deltakelse av distale regulatoriske elementer som inneholder den andre
CRP
SNPs.
Den høye tilbakefall og pervasiveness av
CRP
-286 SNP mutasjoner i tumorer foreslå at lokalt produsert CRP, i stedet for sirkulerende CRP, driver utvikling av kreft. Dette paradoks kan forklares ved den stramme avhengighet av virkningene av CRP på inflammatoriske microenvironments [3], [13], [14], [36]. Sirkulerende CRP er produsert av leveren som en pentamer primært som viser anti-inflammatorisk aktivitet [7], [42], [43]. Dess hepatocytter, ekstrahepatiske celler er også i stand til å utskille CRP lokalt i respons til inflammatoriske stimuli. Videre utløser beriket i inflammatorisk loci vil indusere rask conformation endringer i pentamer CRP innlegget sitt
in situ
produksjon [44] – [49], for å frigjøre det fulle potensialet i ligandbindende [47], [48] , [50], komplementregulering [46], [48], [51] – [54] og stimulering av proinflammatoriske og angiogene cellere [48], [49], [55] – [61]. Som sådan bør den lokale overflod av CRP og dets interaksjon med stressende mikro være mer relevant for sykdomsprogresjon; mens sirkulerende CRP-nivå i hovedsak gjenspeile den underliggende inflammatorisk status.
Den feilregulering av Wnt signalveien er den hyppigste hendelse observert i tykktarmskreft, som vanligvis er manifestert ved å inaktivere mutasjoner av
APC
eller aktivere mutasjoner av
β-catenin product: [25]. En direkte konsekvens av
APC
inaktive er stabilisering av
β-catenin Hotell og avvikende aktivering av nedstrøms målgener [62]. Det er derfor av interesse at
CRP
har vist seg å være et mål av
β-catenin product: [63]. Videre våre resultater viser at
CRP
-286 SNP mutasjoner tendens til å co-skje med mutant
APC
i tykktarm og endetarm svulster. Dette skulle tilsi at de to sekretoriske molekyler,
dvs.
CRP og Wnt, kan handle i feed-back og samarbeids manerer å fremme tumorigenesis, som fortjener nærmere undersøkelser. Gitt den abnormt aktivert Wnt signal og svært indusert
CRP
uttrykk i tumorer, aktuell målgruppe begge molekylene kan være en potensiell mulighet for kolorektal kreft terapi.
Takk
Vi takker Mr . Jing Zhao for hans utmerkede teknisk assistanse.
