Abstract
Ved kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS /emfysem) vi har vist en redusert evne til lunge og alveolære makrofager (AM) for å fagocyttere apoptotiske celler (defekt «efferocytosis»), forbundet med tegn på sekundær cellulær nekrose og en resulterende inflammatorisk respons i luftveiene. Det er ukjent om denne defekten er tilstede i kreft (ingen KOLS) og i så fall om dette er et resultat av løselige meglere produsert av kreftceller.
Vi undersøkte efferocytosis i AM (26 kontroller, 15 friske røykere, 37 KOLS 20 KOLS + ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og 8 pasienter med NSCLC uten KOLS) og tumor og makrofager kreftfrie lungevev (21 NSCLC med /13 uten KOLS). For å undersøke effekten av løselige mediatorer som produseres av lungekreftceller vi deretter behandlet AM eller U937 makrofager med kreftcellelinje supernatant og vurdert deres efferocytosis evne. Vi kvalitativt identifisert arakidonsyre (AA) metabolitter i kreftceller ved LC-ESI-MSMS, og vurderes effektene av COX-hemming (med indometacin) på efferocytosis.
Redusert efferocytosis ble notert i alle kreft /KOLS-grupper i alle avdelinger. Kondisjonert medium fra kreftcellekulturer redusert efferocytosis evne til både AM og U937 makrofager med de mest markerte effektene oppstår med supernatant fra SCLC (en aggressiv krefttype lunge). AA metabolitter er identifisert i kreftceller inkludert PGE2. Den hemmende effekten av PGE2 på efferocytosis, og involvering av COX-2 veien ble vist
Efferocytosis er redusert hos KOLS /emfysem og lungekreft.; den sistnevnte i det minste delvis et resultat av inhibering av oppløselige mediatorer produsert av cancerceller som inneholder PGE2
relasjon:. Dehle FC, Mukaro VR, Jurisevic C, Moffat D, J Ahern, Hodge G, et al. (2013) Defekt Lung makrofagfunksjon i Lung Cancer ± Kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS /emfysem) -mediert av Cancer Cell Produksjon av PGE2? PLoS ONE 8 (4): e61573. doi: 10,1371 /journal.pone.0061573
Redaktør: Kjetil Tasken, Universitetet i Oslo, Norge
mottatt: 29 november 2012; Godkjent: 11 mars 2013; Publisert: 26 april 2013
Copyright: © 2013 Dehle et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den australske Lung Foundation (FD), National Health and Medical Research Council (NHMRC) Career Development Award (SH), NHMRC Practitioner Fellowship (PNR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
KOLS er spådd til å bli den tredje mest utbredte dødsårsaken i verden innen 2020 [1]. De kreftfremkallende effekten av tobakksrøyk har blitt godt beskrevet; Men røykere med KOLS har en høyere risiko for å utvikle lungekreft enn ikke-røykere uten KOLS [2], selv når korrigert for tobakksforbruket. Utbredelsen av KOLS og lungekreft er anslått å øke i de kommende tiårene på grunn av fortsatt eksponering for risikofaktorer og en aldrende befolkning. Denne statistikken er alarmerende som lungekreft er ansvarlig for flere kreftrelaterte dødsfall enn tykktarm, bryst og prostata kreft kombinert [3]. Selv om røykeslutt er fortsatt viktig, er mange nye lungekrefttilfellene oppdages i ex- snarere enn nåværende røykere. Det er et presserende behov for å bedre forstå sammenhengen mellom røyking, KOLS og lungekreft for å muliggjøre nye terapeutiske eller forebyggende strategier.
Vi har vist at alveolære makrofager (AM) i KOLS er defekte i deres evne til å fagocyttere apoptotiske -celler (efferocytosis) [4] – [7], som har potensiale til å bidra til den overskytende apoptotisk materiale som vi har rapportert i COPD luftveiene [8]. Dette un-ryddet materialet kan deretter gjennomgå sekundær nekrose og videreføre den inflammatoriske responsen [8]. På dette stadiet er det ukjent om det er også en feil i efferocytosis evnen til
lungevev
makrofager fra KOLS fag, selv om våre funn med en smoking musemodell tyder på at dette kan være tilfelle [9], [ ,,,0],10]. Også ukjent er om det er feil i efferocytosis evne AM og lungevev /tumor-assosiert makrofager fra pasienter med kreft i fravær av KOLS, og i så fall om løselige meklere produsert av lungekreft celler hemme efferocytosis.
tyder på at un-ryddet apoptotiske materiale som resulterer fra defekte efferocytosis, i tillegg til sine inflammatorisk virkning, kan stimulere tilstrømningen av regulatoriske T-lymfocytter som utøver immunundertrykkende effekter mot anti-tumor immunitet og dermed bidra til svulsten evne å unnslippe utrydding [11]. Enten defekter i mekanismene som fører til defekt efferocytosis i KOLS også spille en direkte rolle i å skape en pro-tumor miljø og bidra til økt mottakelighet for lungekreft er ukjent.
Kreftceller er direkte immunsuppressive ved å slippe pro inflammatorisk mediatorer inkludert arakidonsyre (AA) metabolitter slik som prostaglandiner (PGE) [12]. PGE frigjøres i celler som uttrykker konstitutiv cyklooksygenase-2 (COX-2), reguleres ved frigjøring av AA ved fosfolipase A 2 etterfulgt av metabolismen av COX. PGE2 har vist seg å redusere fagocytose av bakterier via en e-prostanoid 2 reseptor-mediert prosess [13].
Vi undersøkte derfor efferocytosis i AM fra kontrollene, røykere, strøm /ex-røyker KOLS forsøkspersoner og pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) med /uten KOLS. Vi har også undersøkt makrofager fra tumor og tumor-fri vev oppnådd ved lobektomi fra pasienter med NSCLC med /uten KOLS.
Vi deretter undersøkt om løselige mediatorer som produseres av lungekreftceller ville direkte undertrykke makrofag efferocytic evne. Vi vurderte virkningen av supernatanten fra kreftcellekulturer for efferocytosis deretter påført elektrospray ionisering tandem-massespektrometri (LC-ESI-MSMS) analyse for AA-metabolitter i lungekreftceller. Vi endelig undersøkt muligheten for COX-hemmer indometacin å forbedre efferocytosis.
Materialer og metoder
Subject befolknings og bronchoalveolar lavage prøver (BAL)
Kreft og KOLS-gruppene inkluderte pasienter omgår bronkoskopi ved Royal Adelaide Hospital (RAH) for å etterforske mistanke om lungekreft. Vi følger en liten gruppe av pasienter med lungekreft uten kols til ytterligere dissekere effektene av lungekreft alene mot KOLS. Styrer, røykere og enkelte KOLS pasienter ble rekruttert fra vår frivillige database. Kontrollene hadde normal lungefunksjon og ingen historie med lungesykdom, kreft eller allergi. Vi har tidligere fant ingen signifikante forskjeller i efferocytosis mellom aldri-røyker og ex-røyker kontroller og derfor gruppert dem sammen som «kontrollgruppe». Skriftlig informert samtykke ble innhentet med etikk godkjenning gitt av RAH
Fleksibel bronkoskopi ble utført og bronchoalveolar lavage prøver (BAL) oppnådd i henhold til anbefalinger fra American Thoracic Society som tidligere rapportert [4] -. [7], [14]. For pasienter med kreft, ble BAL tatt godt unna det berørte området av lungen. Spiro vurdering av predikerte verdier og nedre grenser for normalitet (LLN) for forsert vitalkapasitet (FVC), forsert ekspiratorisk volum i første sekund (FEV (1)), og FEV (1) /FVC ratio ble utført og diagnosen kols etablert hjelp av Global Initiative for kronisk obstruktiv lungesykdom (GOLD) kriterier (FEV1 /FVC 70%) med røntgen og klinisk sammenheng [15]. For tre pasienter hvor FEV1 /FVC var noe høyere som LLN, tilstedeværelse av emfysem ble bekreftet med høy oppløsning CT eller røntgen; disse pasientene ble derfor tatt med. Kreftpasienter alle hadde NSCLC diagnostiseres på grunnlag av World Health Organization kriterier [16] og ble videre kategorisert på tilstedeværelsen av KOLS. Mikrobiologisk kolonisering og differensialcelletall ble vurdert av SA Pathology (Adelaide, South Australia).
Vi undersøkte efferocytosis i AM fra 24 kontroller, 15 friske røykere, 20 nåværende /16 ex-røyker KOLS fag og 8 pasienter med NSCLC uten KOLS og 17 med KOLS (tabell 1). Vi har også undersøkt makrofager fra tumor og tumor-fri vev oppnådd ved lobektomi fra pasienter med NSCLC (21 med /13 uten KOLS) (tabell 2).
lunge vev prøver
tumor og ikke-tumor lungevev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår lobectomy ved Institutt for Cardiothoracic Surgery, RAH, etter informert samtykke, som tidligere beskrevet [17], [18]. Tumor ble innhentet ved hjelp av en biopsi nål, mens biopsier ble samlet fra ikke-tumor ( «normal») områder godt unna kreft (ca. 5 mm × 5 mm i størrelse). Biopsier ble utført av en kvalifisert kirurgisk patolog, slik at representanten svulsten og prøvene normale vev ble samlet. A «Medimachine» vev disaggregator (BD) ble anvendt for å fremstille enkeltcellesuspensjoner fra lungevev som tidligere beskrevet [9], [17].
Prøver ble kategorisert som «Kontroll (ikke-tumor) «(non -cancer området fra pasienter med kreft /nei KOLS), «Control (tumor) «(kreft nettstedet fra pasienter med kreft /nei KOLS),» KOLS (non-tumor) «(ikke-kreft område fra pasienter med kreft + KOLS) . og «KOLS (tumor)» (kreft nettstedet fra pasienter med kreft + KOLS)
Utarbeidelse av makrofager
Makrofager fra BAL og vev ble isolert som rapportert [4] – [7] ( detaljert i Hjelpemiddel Informasjon S1).
Immunologiske reagenser og cellelinjer
Immunologiske reagenser, cellelinjer (normale menneskelige bronkiale epitelceller (16HBE), lunge adenokarsinom (H2009, H1466), og små cellekreft (SBC-1)) og kultur /stimulerings vilkår er beskrevet i Hjelpemiddel Informasjon S1.
Efferocytosis evne BAL, vev og U937 makrofager
Efferocytosis ble undersøkt ved flowcytometri som rapportert [ ,,,0],4] – [7] og detaljert i saksdokumenter S1
LC-ESI-MSMS analyse for AA metabolitter i dyrkede lungekreftceller
20 mL 4 × 10
5 kreftceller. eller primærluftveis epitelceller oppnådd ved bronkial brushings ved bronkoskopi (som kontroll) ble undersøkt for tilstedeværelse av AA og COX avledet AA-metabolitter (PGE2, PGD2, PGF2a, TXN2, 6ketoPGF1, 11-hydroxyeicosatetraenoic syre (11-HETE), tromboksan B2 (TxB2); lipoksygenase (LOX) produkter (12- og 5- HETE); eikosapentaensyre (EPA), dokosaheksaensyre (DHA), (8-hode, LTB4), 12 (5) TETE, PGB2 og 13 (5) hode ved hjelp av LC-ESI-MSMS som beskrevet i Hjelpemiddel Informasjon S1.
Effekt av prostaglandiner på efferocytosis
Klargjøring av kondisjonert medium fra kreftcellelinjer er beskrevet i saksdokumenter S1. Vi først undersøkte effekten av endogent PGE2 på efferocytosis. U937 makrofager ble behandlet med varierende konsentrasjoner av PGE2 (0,1-10 mm) før vurdering av efferocytosis. Etter å ha vist en doseavhengig effekt på efferocytosis vi deretter vurdert de potensielle effektene av PGE2 produsert av lungekreftceller på efferocytosis. Cellene ble behandlet med supernatant fra SBC-1 celler ± COX-hemmer indometacin (1-10 mm) før å vurdere virkningene av kreftcelle supernatant på efferocytosis.
Statistisk analyse
Kruskal-Wallis og Spearman Rank korrelasjonstester ble brukt. For in vitro eksperimenter, «behandling» Resultatene ble sammenlignet med kontroller [RPMI media behandlings] med enveis ANOVA og Dunnetts test.
Resultater
Pasient demografi
BAL volumer ble betydelig redusert for strøm røyker kols og kreft (ingen KOLS) grupper vs kontroller (tabell 1). Total WCC ble økt i dagens-røykere uten KOLS vs kontroller (tabell 1). Typisk BAL ga 75- 95% AM. Det var ingen signifikante forskjeller i% AM eller lymfocytter i noen pasientgruppen vs. kontroller (tabell 1), selv om det var en ikke-signifikant trend for en redusert% av lymfocytter i kreftgruppene.
BAL og vev makrofag efferocytosis
betydelig redusert efferocytosis ble notert i kreft og KOLS-grupper for både AM og vev makrofager lunge, og for AM fra friske røykere. Efferocytosis varierte mellom avdelinger, med AM viser en større phagocytic evne enn vev eller tumor makrofager, uavhengig av KOLS status (KOLS: (gjennomsnitt ± SEM) BAL 12,83 ± 0,87 ikke-svulstvev 8,67% ± 0,52 7,48% ± 0,78 ; ikke-KOLS: BAL 20,30 ± 1,79 ikke-svulstvev 9,45% ± 0,48 7,80% ± 0,68). I KOLS, ble efferocytosis redusert uavhengig av røykestatus og lungekreft (figur 1). For vevsmakrofager, ble efferocytosis redusert i COPD i samme grad i vev tilstøtende til tumor og i upåvirket områder, mens hos kreftpasienter uten COPD, ble efferocytosis bare redusert i tumorområder. Det var ingen signifikante forskjeller i efferocytosis mellom BAL makrofager fra KOLS vs. KOLS-pasienter med kreft (figur 1) eller mellom KOLS ikke-kreft vs. KOLS kreft vevsmakrofager
A. Efferocytosis av BAL-avledet alveolære makrofager ble vurdert for kontroller ( «C»), røykere, Strøm- og ex- røykere med kols ( «KOLS Cur» og «KOLS Ex»), KOLS-pasienter med lungekreft ( «KOLS Kreft») og pasienter med lungekreft og ingen KOLS ( «Cancer»); B. Tissue fra Controls ( «C Non-Tumor») (ikke-kreft område fra pasienter med kreft /nei KOLS), «KOLS Non-Tumor» (ikke-kreft område fra pasienter med kreft + KOLS), «KOLS Tumor» (kreft området fra pasienter med kreft + KOLS) og «Kontroll Tumor «(kreft nettstedet fra pasienter med kreft /nei KOLS). * Signifikant (p 0,05) lavere uttrykk vs. kontroller (ikke-parametrisk Kruskal-Wallis test) Boksplott stede median ± 25. og 75-prosentilene (solid boks) med den 10. og 90th persentiler vist av kinnskjegg utenfor boksen
.
lungekreft cellelinje supernatant sperre efferocytosis
AM fra kontroller eller pasienter med lungekreft var co-dyrket med supernatant fra NSCLC (H2009, H1466), og SCLC (SBC-1) celler. For AM fra kontrollene, lungekreft supernatant betydelig redusert efferocytosis med 29% -33% (figur 2). Interessant, supernatant påvirket ikke (allerede betydelig redusert) efferocytosis evne AM fra lungekreft fag.
A. Effekt av kreft cellelinje supernatanter på fagocytose av apoptotiske bronkial epitelceller av alveolære makrofager. Makrofager fra (A) kontrollpersoner eller (b) pasienter med lungekreft ble inkubert i normale RPMI media eller kreft cellelinje supernatanter (H2009, H1466, SBC1) i 24 timer før fagocytose analysen. Verdiene er presentert som prosentandel av makrofager inntak apoptotiske celler *, p 0,05 sammenlignet med RPMI media behandling (n = 5 eksperimenter utført in triplo, enveis ANOVA, Dunnetts test). Data presentert som boksplott som beskrevet i Figur 1.
lungekreft cellelinjer inneholde AA metabolitter
Alle tre lunge kreft cellelinjer (A549, H2009, SBC-1) viste påvisbare nivåer av PGE2, PGD2, PGF2a, TXN2 og 6ketoPGF1. 11-HETE, TxB2; 12- og 5- HETE; EPA, DHA), 8-hode, LTB4, 12 (5) TETE, PGB2 og 13 (5) hode ble ikke identifisert. Basert på tilstedeværelsen av PGE2 vi deretter undersøkt effektene av COX-inhibitoren, indometacin, på efferocytosis.
PGE-2 inhiberer efferocytosis
Eksponering av U937-celler til PGE2 doseavhengig redusert efferocytosis evne i en doseavhengig måte, med maksimalt og signifikant inhibering forekommer i nærvær av 10 pM PGE2 (figur 3). For å undersøke mulige effekter av PGE2 produsert av lungekreftceller (via COX-2 /PGE-2 pathway) på efferocytosis, vi deretter behandlet SBC1 celler med COX-hemmer indometacin. SBC1 celler ble valgt for disse eksperimentene som de hadde størst effekt på efferocytosis. Indometacin hadde ingen negative virkninger på celleveksten eller levedyktigheten av de SBC-1-celler ved de konsentrasjoner som benyttes (data ikke vist). Vi har fastslått at virkningen av SBC-1 celle supernatant på PMA-differensierte U937-makrofager. Supernatant fra SBC-1 celler dyrket i fravær av indometacin i betydelig grad reduserte efferocytosis evne til U937-celler med 36% (figur 4). Denne reduksjonen ble delvis hemmet av indometacin (1 mikrometer: 21,3% økning vs. kreft celle supernatant, 10 mm: 25,74% økning)
Prostaglandiner hemme efferocytosis og minst delvis formidle den hemmende effekten av kreftcellelinje supernatanter. på fagocytose av apoptotiske bronkial epitelceller av U937 celler. U937-celler ble inkubert med varierende konsentrasjoner av PGE2 i 18 timer og efferocytosis vurdert (n = 3 triplikate eksperimenter, en-veis ANOVA, Dunnetts test)
U937-celler ble inkubert i RPMI-medium normale eller SBC. -1 supernatant som var blitt behandlet med indometacin. Etter 24 timer inkubasjon ble en efferocytosis analyse utført. (N = 5 eksperimenter utført in triplo). Data presentert som boksplott som beskrevet i Figur 1. Verdier er presentert som prosentandel av makrofager inntak apoptotiske celler *, p. 0,05 sammenlignet med RPMI media behandling (enveis ANOVA, Dunnetts test)
diskusjon
En bedre forståelse av sammenhengen mellom KOLS og lungekreft er avgjørende for å gi råd til nye terapeutiske eller forebyggende strategier. Vi rapporterer at efferocytosis evne til både alveolære og lungevev makrofager er mangelfull hos pasienter med lungekreft med eller uten KOLS (i KOLS, uavhengig av røykestatus og lungekreft). I KOLS, ble efferocytosis redusert til en lignende grad i vev makrofager ved siden av svulsten og uberørte områder, mens hos kreftpasienter uten KOLS, ble feilen funnet kun hos tumorassosierte makrofager, noe som tyder på at kols og kreft både resultat i svekket efferocytosis, med delvis uavhengige mekanismer. Un-erte apoptotisk materiale er sannsynlig å være viktig i utviklingen av lunge cancer, da dette materiale har vist seg å ha pro-inflammatorisk virkning [19] og bidra til en svulst evne til å unnslippe utrydding av flere mekanismer, inkludert stimulerende av en strøm av regulerings T-lymfocytter [12]. Pasienter som behandles med rituximab, et medikament som virker delvis av opsonizing celler og øker fagocytose hadde en positiv prognostisk verdi til tross for det høye antall tumor-assosierte makrofager [20], [21].
Fagocytose kan undertrykkes via frigjøring av løselige mediatorer inkludert PGE-2 av lunge kreftceller. I mesothelioma; kreft celler ko-dyrket med makrofager induserte en nedgang i fagocytose, men en økning av PGE-2 meldingen [22]. I denne studien vi derfor brukt LC-ESI-MSMS å avgjøre om lungekreftceller produsert ulike prostaglandiner som kan direkte hemme efferocytosis. Alle tre lunge kreft cellelinjer produsert påvisbare nivåer av AA metabolitter inkludert PGE-2, i samsvar med en annen studie [23] av NSCLC cellelinjer A549 og H1299. Inhibering av COX med indometacin i det minste delvis eliminert de undertrykkende virkninger på efferocytosis, impliserer en effekt av COX-2 /PGE-2 pathway selv om det er klart andre flere faktorer involvert.
Interessant nok var mest signifikante undertrykkende virkning ble funnet ved hjelp av SCLC-cellelinjen, SBC-1, og vi kan hypotese at det kan være representative for den mer aggressive natur av denne lungekreft typen. En tidligere studie av COX-2-ekspresjon i primære NSCLC viste de høyeste nivåene av både mRNA og protein i adenokarsinomceller sammenlignet med stor celle og karsinomer [24]. De gjorde imidlertid ikke undersøke SCLC. Det vil være av interesse å bestemme hvorvidt AA metabolitter inhiberer efferocytosis funksjon av luftveiene og tumor-assosierte makrofager til en tilsvarende grad, da vi har funnet at lungekreft cellesupernatanten hadde en signifikant undertrykkende effekt på efferocytic evnen til makrofager fra kontrollpersoner, men gjorde ikke påvirke (allerede betydelig redusert) efferocytic evne til makrofager fra pasienter med lungekreft
Ulempene ved studien er at vi ikke var i stand til å sammenligne BAL og lungevev avdelinger for enkeltpasienter.; vi imidlertid vurdere dette i vår murine emfysem modell i pågående studier. Det er også åpenbare etiske ulempene med å skaffe frisk «normalt» lunge. Selv om vi samlet våre «kontroll» lungevev ved biopsi tatt godt unna området av kreft hos pasienter uten KOLS, gjenstår muligheten for fortsatt at tilstedeværelsen av kreft kan ha påvirket noen av våre funn og murine kreft modeller er nødvendig for å avklare dette. Antallet NSCLC pasienter uten KOLS var relativt lav (BAL fra 8 pasienter med NSCLC og paret kreft og kreft-fri vev fra 13 pasienter ble oppnådd i løpet av en to års periode) som utelukker bastante konklusjoner basert på analyse av data fra denne gruppen av pasienter . Av de om lag 200 pasienter med NSCLC, som vår enhet ser årlig bare en liten prosentandel (~15%) anses for kirurgi (stadium I og II), og av disse mange er medisinsk ubrukelig. I våre operable pasienter med NSCLC andelen pasienter uten KOLS er svært lav, ca 10%.
I konklusjonen vi har vist redusert efferocytosis i luftveier og lungevevet i både kols og lungekreft, og hemming av efferocytosis via frigjøring av løselige prostaglandiner av lungekreftceller. Disse feilene kan være en potensiell immune evasion mekanisme i lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Støtte Informasjon S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0061573.s001 plakater (DOC)
bekreftelser
Forfatternes takket Enzo Raineri, Department of Genetic Medicine, Neonatal Screening Lab, SA Pathology , for hans hjelp med kvalitativ electrospray ionisering tandem massespektrometri og Ms Slavica Miskovich for teknisk assistanse.
