Abstract
Den aktive metabolitten av vitamin D
3, 1,25-dihydroksyvitamin D
3 (kalsitriol) har antiproliferative effekter i ikke-aggressiv prostatakreft, imidlertid dens virkninger i mer aggressive modellsystemer er fortsatt uklart. I disse studiene, virkningene av kalsitriol og en mindre-kalsemiske vitamin D analog, QW-1624F
2-2 (QW), ble testet
in vivo
, ved bruk av aggressive stedegne transgen adenokarsinom i mus prostata ( TRAMP) modell. For å studere forebygging av androgen-stimulert prostatakreft, kjøretøy, kalsitriol (20 pg /kg), eller QW (50 ug /kg) ble administrert til fire ukers gamle tramp mus intraperitoneale (ip) 3 x /uke på et MWF timeplan for 14 uker. Calcitriol og QW bremset utviklingen av prostatakreft som indikert av redusert urogenitaltractus (p = 0,0022, kalsitriol; p = 0,0009, QW) og prostata vekter (p = 0,0178, kalsitriol; p = 0,0086, QW). Det er imidlertid bare kalsitriol øket ekspresjon av det pro-differensiering markør, cadherin 1 (p = 0,0086), og redusert tumor proliferasjon (p = 0,0467). I motsetning til dette ingen vitamin D analog hadde noen effekt på kastrering motstandsdyktig prostatakreft hos mus behandlet før eller etter kastrering. Interessant, selv om vitamin D viste inhibitorisk aktivitet mot primærsvulster i hormon intakt mus, fjernt organmetastaser syntes å være forbedret etter behandling (p = 0,0823). Derfor Tramp mus ble behandlet langsiktig med kalsitriol å ytterligere undersøke effekter på metastasering. Calcitriol økt betydelig antall fjerntorganmetastaser når mus ble behandlet fra 4 uker-of-age til utvikling av palpable tumorer (20-25 uker-of-age) (p = 0,0003). Samlet sett data tyder på at tidlig intervensjon med vitamin D i TRAMP bremset androgen-stimulert tumorprogresjon, men langvarig behandling resultert i utviklingen av en motstandsdyktig og mer aggressiv sykdom forbundet med økt fjernt organ metastaser
Citation. Ajibade AA, Kirk JS, Karasik E, Gillard B, Moser MT, Johnson CS, et al. (2014) Tidlig veksthemming Fulgt av økt metastatisk sykdom med vitamin D (kalsitriol) Behandling i TRAMP Modell av prostatakreft. PLoS ONE 9 (2): e89555. doi: 10,1371 /journal.pone.0089555
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 06.09.2013; Godkjent: 21 januar 2014; Publisert: 26 februar 2014
Copyright: © 2014 Ajibade et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Roswell Park Cancer Institute og National Cancer Institute (NCI) stipend # P30 CA016056 ved NIH /NCI tilskuddet # 5R01 CA95367 (til BAF), og ved institutt for forsvars (DOD) Pre-doc stipend # W81XWH-05 -1 til 0571 (AAA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en av de viktigste årsakene til kreft og kreftrelatert dødelighet i amerikanske menn [1]. Tidlig stadium, orgel-begrenset, kan PCa bli styrt av kirurgi, strålebehandling eller vaktsom venter, mens menn med lokalavansert eller metastatisk PCa behandles primært av androgen deprivasjon terapi [2]. Men mange pasienter hvert utvikle kastrering motstandsdyktig PCA som nåværende behandlingsalternativer er kun palliativ. Prevalensen, lang ventetid, sykelighet og dødelighet forbundet med PCa har generert betydelig interesse i å utvikle agenter for chemoprevention av sykdommen [3].
Epidemiologiske assosiasjoner mellom vitamin D og PCa tyder på at vitamin D kan være en viktig regulator av PCa vekst og differensiering [4]. Men studier knytter serum nivåer av vitamin D og PCa forekomst og dødelighet er ikke sterkt korrelert (anmeldt i [5]). I motsetning til dette, prekliniske studier viser at vitamin D har potente kreft effekter i PCA-celler
in vitro
, omfattende hemning av celleproliferasjon [6] og invasivitet [7], induksjon av cellesyklus-stans [8], stimulering av apoptose [9], og fremming av differensiering [10]. Videre er tallrike
in vivo-studier med
mus xenograft systemer viser at vitamin D-forbindelser undertrykke tumorvekst og metastase [6], [11], [12]. I tillegg bruk av genmanipulerte musemodeller som spontant utvikler kreft, viser at vitamin D kan hindre progresjon av forstadier til kreft PCA lesjoner [13] og undertrykke tumorvekst i kastrering motstandsdyktig PCa [14].
Kliniske studier utført i PCA pasienter som har vært mest skuff [15], [16], [17], [18], selv om det har vært noen positive resultater [19], [20], og gevinsten er gjort i forståelsen av vitamin D farmakokinetikk og farmakodynamikk. En årsak til dårlig klinisk ytelse av vitamin D er den viktigste dosebegrensende toksisitet, hyperkalsemi. Selv om hyperkalsemi er enkel å håndtere, kan det være å hindre optimal utnyttelse av kalsitriol. Derfor har mindre kalsemiske vitamin D-analoger er utviklet med tanke på å beholde de potente kreft effekter av kalsitriol. QW-1624F
2-2 (QW) er et fluor hybrid analog av kalsitriol som er 100 ganger mindre kalsemiske, svært antiproliferativ, og utløser lignende nedstrøms effekter til kalsitriol [21], [22]. I tillegg administrering av høye doser av QW (3 mikrogram) hemme 7,12-dimetylbenz [a] antracen-initiert og TPA-forfremmet hud kreftutvikling hos mus uten hypercalcemic bivirkninger [23].
transgen adenokarsinom av mus prostata (TRAMP) modellen er en aggressiv, innfødt modell av PCa [24]. Ved 10 uker-of-age, tramp mus utvikler lav karakter, ikke-invasiv prostatakreft [25]. Som mus fortsetter å alder, utvikler svulsten fra ikke-invasiv til høy klasse, invasiv adenokarsinom, og deretter dårlig differensierte nevroendokrine svulster ved 20-25 uker-of-age. Den progressive karakter av modellen presenterer en mulighet til å undersøke effekten av kjemopreventive midler for både tidlige og sene stadier av PCa utvikling, i motsetning til bare den ene eller den andre. Hittil head-on sammenligninger av de kjemopreventive virkninger av forskjellige vitamin D-forbindelser på androgen-stimulert og kastrering bestandig PCa progresjon ennå ikke er foretatt. Siden prostatakreft dødelighet oppstår hos menn med avansert, sent stadium kreft, søkte vi å undersøke anti-kreft effekt av vitamin D-forbindelser ved hjelp av mer aggressive TRAMP modell. I disse studiene ble TRAMP modellen brukes til å undersøke om kalsitriol eller QW kan forhindre eller treg androgen-stimulert og kastrering-resistente PCa initiering, progresjon og metastasering.
Materialer og metoder
Etikk Statement
Eksperimentell bruk av forsøksdyr ble utført i henhold til National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og protokollen ble godkjent av Roswell Park Cancer Institute (RPCI) Animal Care og bruk Committee (Assurance # A3143-01). RPCI er en AALAC International akkreditert dyr forskning anlegget. Alle operasjoner ble utført ved hjelp av isofluran for inhalasjonsanestesi og alle anstrengelser ble gjort for å minimalisere dyrs lidelse.
Dyr
hekkekolonier ble opprettholdt ved Institutt for laboratorie og Animal Resource (DLAR) kjernefasilitet på Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, New York). Homozygot mannlige Tramp mus ble avlet med villtype FVB hunnmus (Taconic, Germantown, NY) for å få C57BL /6 × FVB 50:50 mannlige Tramp mus. Mus ble genotypet for å bekrefte bakterie-line overføring av transgenet [24]. Alle forsøksdyr var heterozygote for transgenet, og vedlikeholdes på Harlan Teklan Diet S2335 som inneholder 2,980 IE /kg av vitamin D3.
Vitamin D chemoprevention studier
1α-hydroksymetyl-16-en -24,24-fluor-25-hydroxy-26,27-bis-homovitamin D
3 (QW-1624F
2-2, QW) ble oppnådd fra Dr. Gary Posner (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Calcitriol og QW stocks ble oppløst i 100% etanol, og ble resuspendert i ferskt saltvann før hver injeksjon. Dyrene ble veid, overvåkes med hensyn til toksisitet, og palpasjon å vurdere tumorbyrde på en ukentlig basis. Studier ble vanligvis avsluttet 72 timer etter den siste behandling ble administrert. Ved tidspunktet for avliving ble det endelige kroppsvekt målt, og det urogenitale (UG) kanalen (blære, sædblæren og prostata) ble skåret ut og veiet. Rygg, laterale og ventral prostata lapper ble microdissected fra UG kanalen og veid for å få prostata vekter. Metastatisk forekomsten ble fastsatt basert på brutto undersøkelse av bekken lymfeknuter, lever, nyrer og lunger, og ved immunhistokjemisk farging av vev med SV40 T antigen spesifikt antistoff. Følgende vev ble samlet i ni-kammer kassetter for histologi: dorsal, lateral, ventral og fremre prostata, sædvæske, peri-aorta lymfeknuter, nyre, tarm og lever. Innsamling av vev for histologi ble prioritert, og dermed bare left vev fra store prostatakreft var snap-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C i Western blot analyse.
For å studere effekten av kalsitriol eller QW på utviklingen av androgen-stimulert PCA ble tre årskull av fire uker gamle tramp mus behandlet med kjøretøyet (n = 40), kalsitriol (n = 41) eller QW (n = 42) ip 3 × /uke mandag, onsdag og fredag (MWF) i 14 uker (figur 1A). Studien ble avsluttet når musene var 18 uker gamle, og vevene ble høstet som beskrevet ovenfor. Noen prøver var i stand til å bli analysert, eller ikke evaluert basert på oppgitt eksklusjonskriteriene. En annen studie ble gjennomført for å undersøke effekten av
langsiktig
administrasjon av kalsitriol på androgen-stimulert PCa progresjon. To kohorter av fire uker gamle tramp mus ble behandlet
langsiktig
med kjøretøy (n = 47) eller kalsitriol (n = 49) i.p. 3 × /uke MWF, inntil håndgripelig svulster utvikles (figur 1A). Svulster ble høstet når påvises ved abdominal palpasjon.
(A) Skjematisk av tidsforløpet av chemoprevention studier. Alle mus ble kastrert på 12 uker i hormon ildfaste studier. (B-C) Fire uker gamle tramp-mus ble behandlet med bærer (kontroll), kalsitriol (20 ug /kg) eller QW (50 ug /kg) i.p. 3 × /uke i 14 uker. (B) Avsluttende kroppsvekt (g) kontroll (n = 40), kalsitriol (n = 41) og QW (n = 42) mus målt 72 timer etter siste behandling. (C) Serum kalsium (mg /dl) nivåene for kontroll (n = 39), kalsitriol (n = 40) og QW (n = 42) mus målt 72 timer etter siste behandling. Alle data er representert som boksplott med median, og værhår som representerer 5
th og 95
th persentiler. • (prikker), representerer punkter utenfor 5
th og 95
th persentil. Alle p-verdier ble generert ved hjelp av Mann-Whitney test.
To studier ble utformet for å evaluere effekten av kalsitriol eller QW på forebygging av kastrering motstandsdyktig PCa i kirurgisk kastrerte Tramp mus. I
etter kastrering
studere, ble behandling startes umiddelbart etter kastrering av TRAMP mus i 12 uker-of-age. Tre årskull av 12 uker gamle kastrerte mus ble behandlet med kjøretøy (n = 33), kalsitriol (n = 31) eller QW (n = 30) i.p. 3 × /uke MWF i 12 uker (Figur 1a). Mus ble avlivet etter 24 uker-of-alder og vevsprøver ble fremskaffet som beskrevet ovenfor.
før kastrering
studie, 4 ukers gammel tramp mus ble behandlet med kjøretøy (n = 29) eller kalsitriol (n = 34) i.p. 3 × /uke MWF i 8 uker. Ved 12 uker-of-age, ble alle mus kastrert og behandling ble fortsatt i ytterligere 12 uker (Figur 1a). Musene ble avlivet ved 24 uker-of-age og vevsprøver ble anskaffet som beskrevet ovenfor.
Histopatologisk analyse
vev ble høstet, faste, bearbeidede, parafin-embedded og vevssnitt (5 mikrometer ) ble kuttet for histologisk analyse. Hematoxylin og eosin (H E) farging av vevssnitt ble utført og tumor karakterer ble tildelt av blindet evaluering av A.A.A. og B.A.F. ved hjelp av en standard histopatologisk graderingssystem utviklet for TRAMP modell [25]. I dette karaktersystemet, normal prostata (klasse 1) gradvis utvikler prostata lesjoner inkludert lav grad av prostata intraepitelial neoplasi (PIN) (klasse 2), karsinom
in situ product: (klasse 3), invasiv kreft (karakterer 4 og 5) og dårlig differensiert sent stadium kreft (klasse 6) [25]. Terminologier som brukes til å beskrive prostata lesjoner i nåværende studier ble tilpasset fra de nevnte karaktersystemet, der
lavgradig plakater (LG) lesjoner er tilsvarende svulst grad 1 og 2,
middels klasse
(IG) lesjoner representerer grad 3 og
kreft
tilsvarer karakterene 4, 5 og 6. rygg~~POS=TRUNC, lateral og ventral prostata lapper ble individuelt gradert og tildeles en samlet karakter og verste klasse. Den samlede karakteren fastsettes ved å vurdere den dominerende svulst grad til stede i hver prostata lapp. Metastatisk forekomsten ble bekreftet ved å undersøke lymfeknuter, lever, nyrer og lunger under et lys mikroskop etter immunhistokjemisk farging for SV40 stor T antigen. Representative mikrofotografier ble tatt ved hjelp av en KP-D50 farge digitalt kamera (Hitachi, Brisbane, CA).
Immunohistochemistry
Tissue seksjoner ble de-paraffinized hjelp xylen og rehydrert med graderte alkoholer. Antigen henting ble utført ved koking med 1 × Citrate Buffer, pH 6,0 (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) i 20 min. Endogen peroksidase ble blokkert ved å dyppe lysbilder i 3% H
2o
2 i metanol i 15 min. Lysbilder ble inkubert med følgende primære antistoffer: SV40 stor T antigen (Tag) (1:400, BD Pharmingen, San Diego, CA), MKI67 (1:1000, Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK), cadherin 1 (CDH1 ) (1:500, BD Pharmingen), androgen reseptor (AR) (1:200, Upstate, Lake Placid, New York) og synaptophysin (SYP) (1:400, Zymed). Sekundære antistoff bare ble anvendt som negativ kontroll for alle antistoffer. Objektglassene ble vasket med 1 x Tris-fosfatbuffer, pH 7,8 (8,4 mM Na
2HPO
4, 3,5 mM KH
2PO
4, 10 mM Tris, 120 mM NaCl), etterfulgt av inkubering med følgende sekundære antistoff: HRP-konjugert kanin-anti-mus (DakoCytomation, Carpinteria, CA), HRP-konjugert svin-anti-kanin (DakoCytomation) og biotinylert geit-anti-kanin (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Immunoreaktivitets ble oppdaget ved hjelp Vectastain ABC reagens (Vector Laboratories) og 3,3′-diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB, Sigma, St. Louis, MO). Vev ble kontra med hematoxylin, dehydrert med graderte alkoholer, ryddet med xylen og montert ved hjelp av dekkglass.
CDH1 score på ventrale lapp ble beregnet ved å telle antall CDH1 positive kjertler per 15 kjertler i en 10 × feltet. Den proliferative indeks av den ventrale lapp ble bestemt ved telling av antallet positive celler MKI67 i tre felt (40 x forstørrelse) som var representative for områder med den verste tumor karakter, dividert med det totale antall kjerner i hvert felt.
Western blot-analyse
Immunoblotting ble utført som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt ble snap-frosne vev homogenisert med Triton-X /SDS lysis buffer som inneholder 1 x proteasehemmer Cocktail (BD PharMingen) og fosfatase hemmere. Prøvene ble oppløst ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membranene over natten ved 4 ° C ved elektroforese. Membranene ble blokkert ved romtemperatur i minst 1 time ved bruk av 5% (w /v) melk i en x TBST. Etter inkubering over natten med primære antistoffer for SV40 stort T-antigen (1:250, BD Pharmingen) og aktin (CP01, Calbiochem, San Diego, CA), ble membranene vasket med TBST, inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer i minst ett h og protein-ekspresjon ble påvist ved kjemiluminescens.
serum analyse
blod ble erholdt ved terminal hjertepunktur ved nekropsi og serum ble oppsamlet fra blodprøver ved sentrifugering. Kalsiumnivåene ble målt ved Roswell Park Cancer Institute Clinical Laboratories.
Statistisk analyse
Alle grafer og statistiske analysen ble generert ved hjelp GraphPad Prism versjon 5.0d for Mac OS X, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com. Den parametriske Mann-Whitney testen ble utført for å sammenligne mellom kvantitative resultater, mens kategorisk analyse ble utført ved å utvikle krysstabeller og bruk av Chi-Square eller Fishers eksakte tester. Kvantitative resultater er representert som boksplott som viser at 5
th, 25
th, 50
th, 75
th og 95
th persentiler av datasett i hver behandlingsgruppe, og kategoriske resultatene er representert i prosent av hver behandlingsgruppe.
resultater
vitamin D-forbindelser er ikke giftig og ikke forstyrre med SV40 stor T antigen uttrykk
effekten av vitamin D-forbindelser på progresjon av androgen-stimulert PCa ble evaluert i mus ved kjønnsmodning, som begynner ca. 4 uker-of-age i TRAMP. Tre kullene av 4 uker gamle tramp-mus ble behandlet med kalsitriol (20 ug /kg), QW (50 ug /kg) eller bærer i 14 uker på et MWF plan (figur 1A). Mus behandlet med vitamin D-forbindelser ikke oppleve noen vekttap etter behandling (figur 1B). Endelige kroppsvekt var 31,5 ± 2,1 g for kjøretøy, 31,5 ± 2,5 g for den kalsitriol, og 30,7 ± 2,7 g for QW-behandlede mus. Videre kalsiumnivå var uendret etter 14 ukers behandling med kjøretøy (8,6 ± 1,0 mg /dL), kalsitriol (8,5 ± 1,4 mg /dL, p = 0,3334), eller QW (8,5 ± 0,9 mg /dL, p = 0,9096) , noe som tyder forlenget hyperkalsemi er ikke et problem (figur 1C). Kalsium nivåer ble forhøyet i noen få tumorbærende mus (bærerkontroll, n = 2/39, kalsitriol, n = 1/40, og QW, n = 1/42), men dette er sannsynligvis relatert til tumor fenotype og uavhengig av behandlingen. Fordi prostataspesifikt uttrykk for SV40 tidlige gener (T og T-antigener, Tag) er nødvendig for tumorprogresjon hos TRAMP [24], var det viktig å finne ut om terapeutiske midler endre transgene uttrykk. På samme måte som kontrollgruppen (figur 2A, D, G), Tag ble uttrykt i dorsal (figur 2B-C), laterale (figur 2E-F) og ventral (fig 2H-I) prostata fliker etter behandling med calcitriol eller QW henholdsvis. Western blot analyse ytterligere bekreftet at vitamin D-forbindelser ikke forstyrre Tag uttrykk (figur 2L).
Tramp mus ble behandlet med kjøretøy (kontroll), kalsitriol (20 mikrogram /kg) eller QW (50 mikrogram /kg ) ip 3 × /uke i 14 uker. Immunhistokjemisk analyse av Tag ekspresjon i dorsal (A-C), laterale (D-F), og ventral (G-I) fliker av 18 uker gamle mus. (J) SV40 Tag-farging av den ventrale lapp av alderstilpassede ikke-transgene mus. (K) Ingen antistoffarging negativ kontroll. Mikrofotografiene ble tatt ved 20 x forstørrelse. (L) Western blot analyse av Tag uttrykk i dårlig differensierte prostata kreftprøver av kontroll, calcitriol- og QW-behandlede mus. Actin ble brukt som lasting kontroll. WT, Wild-type og alder-matchet ikke-transgene prostata vev. Prøven som er brukt for immunoblotting varierer (kontroll = 5, kalsitriol = 2, QW = 5) fordi prioritet ble gitt til innsamling av vev for histologi. Bare left vev fra store prostatakreft var tilgjengelige for immunoblotting.
Effekt av vitamin D-forbindelser på tumor forekomst og progresjon
Muligheten av kalsitriol eller QW å hemme eller forsinke tumordannelse i TRAMP ble analysert etter behandling av androgen-stimulert og kastrering motstandsdyktig PCa (figur 1A). I androgen-stimulert mus behandlet med kjøretøyet, kalsitriol, eller QW, fra 4 uker-of-age inntil 18 uker-of-age, tumor forekomst var tydelig i 35,0% av bilens kontrollmusene (n = 14/40), 26,8% av kalsitriol behandlede mus (n = 11/41) og 35,6% av QW-behandlede mus (n = 15/42) (fig S1). Selv om det var en 8,2% reduksjon i tumortilfeller med kalsitriol behandling, denne nedgangen var ikke signifikant (p = 0,6337, Chi-Square test).
Etter kastrering ved 12 ukers-of-age, tramp mus utvikler kastrering resistente svulster ved 24 uker-of-age [25], [26]. For å avgjøre om vitamin D-forbindelser kan bremse eller hindre PCa gjentakelse, ble tre årskull av kastrat Tramp mus behandlet med kjøretøyet, kalsitriol (20 mikrogram /kg), eller QW (50 mikrogram /kg) i 12 uker
etter kastrering
(figur 1A). Omtrent 64% (21/33) av kjøretøykontrollmusene utviklet kastrering resistente svulster, sammenlignet med henholdsvis 68% (21/31) og 57% (17/30) av mus i kalsitriol og QW grupper (figur S1). Men disse endringene var ikke signifikant (p = 0,6648, Chi-Square test). Vi undersøkte også om intervensjon med vitamin D behandling
før kastrering
kan endre kastrering gjentakelse. To kullene av 4 uker gamle tramp-mus ble behandlet med enten bærer eller kalsitriol (20 ug /kg) ved å starte ved 4 uker-of-alder. Ved 12 uker-of-age mus ble kastrert og vedvarende behandling inntil mus var 24 uker-of-age (figur 1A). Omtrent 62% (18/29) av kjøretøy behandlet mus og 74% (25/34) av kalsitriol-behandlede musene kastrering resistent sykdom (figur S1), men ingen signifikant forskjell ble observert (p = 0,4184, Fishers Exact test). Samlet er disse resultatene tyder på at vitamin D-forbindelser ikke var i stand til å redusere tilbakefall av kastrering motstandsdyktig PCa i TRAMP.
Effekt av vitamin D-forbindelser på tumorgrad og sykdomsbyrde
For å vurdere virkningene av ytterligere vitamin D-forbindelser på androgen-stimulert PCa progresjon i mus etter 14 ukers behandling, ble prostatasykdommer scoret av standard histologisk evaluering (se
Materialer og metoder
). Totalt tumor karakterer ble tildelt følgende blindet undersøkelse av H E-farget lysbilder. Tidligere rapporter viser at den ventrale fliken er mest følsom for terapeutisk intervensjon [27], [28], derfor totale tumor graderinger av den ventrale prostata ble sammenlignet mellom behandlingsgrupper (figur 3). Lav grad (LG) lesjoner var ikke-invasiv og ble karakterisert ved økte epithelial lagdeling med intakt kjertel-arkitektur (figur 3A). Intermediate grade (IG) lesjoner var også ikke-invasiv, men vises fremtredende nucleoli, epitel tufting, micropapillary strukturer, cribriform arkitektur, og en intakt kjertel arkitektur (Figur 3B). Til slutt, sent stadium kreft fremtredende besto av plater av anaplastiske celler med tap av kjertel arkitektur (Figur 3C). Forekomsten av LG lesjoner var 40% i bilen behandlet, 54% i kalsitriol behandlet, og 39% i QW behandlet mus (Figur 3D). I motsetning til dette, IG lesjoner og sent stadium kreft utvikles oftere i styringen (60%) og QW (61%)-grupper sammenlignet med Calcitriol-behandlede mus (46%) (Figur 3D). Dessuten var forekomsten av cancerøse lesjoner var 25% i kontrollgruppen, 34% i QW gruppe, og 20% i calcitriol gruppen (figur 3D), men disse forandringene var ikke signifikant (p = 0,4699, Chi-square test). Intervensjon også hadde ingen effekt på tumor karakter i rygg-og side fliker av prostata (data ikke vist)
H E farging ble utført på vevssnitt fra tramp mus behandlet med bærer (kontroll), kalsitriol (20 ug /kg) eller QW (50 ug /kg) i.p. 3 × /uke i 14 uker. Prostata vev ble gradert på grunnlag av en histopatologisk karaktersystemet diskutert i
Materialer og metoder
delen. Representative mikrofotografier (20 × forstørrelse) fra H E farging av ventral lapper som viser (A) Lav grad (LG) prostatahyperplasi lesjon fra kalsitriol gruppen, (B) middels grad (IG) lesjon, og (C) sent stadium kreft i kontrollgruppen. (D) Forekomst (%) av LG lesjoner, IG-lesjoner, og kreft i ventrale fliker av kontroll (n = 40), kalsitriol (n = 41) og QW (n = 41) grupper. En Chi-Square test ble utført for å finne ut om det var noen sammenheng mellom behandling og sykdomsstadiet.
sykdomsbyrden i TRAMP kan være direkte knyttet til prostata og urogenitaltractus (UG) vekt [25]. Effekten av vitamin D-forbindelser på sykdomsbyrde ble først undersøkt i alle prøvene, inkludert LG, IG, og sene stadier av kreft. Ingen signifikante forskjeller ble observert, sannsynligvis som følge av utviklingen av store svulster i sene stadier av kreft. Når store svulster har utviklet, kan vektene fra disse svulstene maskere noen effekt vitamin D har på LG og IG lesjoner. Derfor er alle etterfølgende analyser utført for androgen-stimulert PCa ble gjort på ikke-invasive LG og IG prostata lesjoner. Kalsitriol (p = 0,0022) og QW (p = 0,0009) betydelig redusert UG vekt i forhold til kjøretøyet i androgen-stimulert sykdom (figur 4A). I tillegg kalsitriol (p = 0,0178) og QW (0,0086) begge redusert prostatavekt (figur 4B). Men i kastreringsresistent Tramp svulster histologisk sammenlign sent stadium kreft, vitamin D-forbindelser ikke statistisk endre sykdomsbyrde når de behandles etter kastrering (figur 4C) eller pre-kastrering (figur 4D). Total, resultater tyder på at vitamin D-forbindelser var effektive til å bremse veksten av tidlig stadium androgen-stimulert PCa, men ineffektive i sent stadium kastrering motstandsdyktig TRAMP sykdom.
(A-B) Mus ble behandlet med bærer (kontroll) , kalsitriol (20 ug /kg) eller QW (50 ug /kg) ip 3 × /uke i 14 uker. Bare prøver med generelle ikke-invasiv lav karakter (LG) og middels klasse (IG) prostata lesjoner i rygg ble laterale og ventral fliker analysert, mens alle krefttilfeller ble ekskludert fra analysene. (A) Urogenital (UG) vekt (mg) kontroll (n = 30), kalsitriol (n = 32) og QW (n = 28) mus. (B) Prostata vekter (mg) av kontroll (n = 29), kalsitriol (n = 32) og QW (n = 28) grupper. (C) UG vekter (mg) av 24 uker gamle kastrering tramp mus behandlet med vehikkel-kontroll (n = 33), kalsitriol (n = 30) eller QW (n = 30)
etter kastrering
. (D) UG vekt (mg) av 24 uker gamle kastrering tramp mus behandlet med kjøretøykontroll (n = 29) eller kalsitriol (n = 34)
før kastrering
. Alle data er representert som boksplott med median, og værhår som representerer 5
th og 95
th persentiler. • (prikker), representerer punkter utenfor 5
th og 95
th persentil. Alle p-verdier ble generert ved hjelp av Mann-Whitney test.
Calcitriol fremmer differensiering og hemmer spredning i androgen-stimulert tramp mus
Basert på observasjoner som kalsitriol hemmet UG og prostata vekt i ventral lobe (figur 4), ble ytterligere analyser utført i ikke-invasive LG og IG lesjoner. Tap av cadherin 1 (CDH1) ekspresjon er assosiert med PCa progresjon og redusert differensiering i TRAMP [25], [29]. CDH1 uttrykk er hovedsakelig lokalisert til plasmamembranen. Men når kreftceller mister differensiering status, regulering av CDH1 kan bli forstyrret resulterer i cytosol og kjernefysiske uttrykk mønstre [30]. Videre økning i uttrykk for CDH1 korrelerer med induksjon av differensiering indusert av vitamin D-analoger i PCA cellelinjer [31]. Derfor ekspresjon av CDH1 ble vurdert for å bestemme virkningen av kalsitriol på differensiering. I motsetning til kontroll mus (figur 5A-B), ble CDH1 sterkt uttrykt i det ventrale lobene av kalsitriol-behandlede mus (figur 5C-D). Mens noen cytoplasma farging av CDH1 ble observert i begge behandlingsgruppene, de fleste av CDH1 flekker forble membran bundet. Påfølgende kvantifisering bekreftet at kalsitriol betydelig økt antall av CDH1 positive kjertler i forhold til kjøretøyet (figur 5G) (p = 0,0086). I tillegg til CDH1 ble androgen reseptor (AR) uttrykk også undersøkt i ventrale prostata av kjøretøy og Calcitriol behandlet mus (figur 5E og 5F). Selv om det ble ikke observert noen forskjell i AR uttrykk, er det viktig å merke seg at AR-ekspresjon ble opprettholdt. Til slutt er det en stokastisk veksten av nevroendokrine kreft i TRAMP modell som er preget av økt uttrykk av synaptophysin under tumorprogresjon [25]. Undersøkelse av synaptophysin uttrykk indikerte at calcitriol og QW behandling endret ikke forekomsten av det nevroendokrine fenotype (data ikke vist).
Immunhistokjemi ble utført med anti-CDH1, anti-AR og anti-MKI67 antistoffer på vevssnitt fra kontroll, kalsitriol og QW behandlingsgruppene. (A-D, G) CDH1 uttrykk i ikke-invasiv lav karakter (LG) og middels klasse (IG) ventrale prostata vev. Representative mikrofotografier av CDH1 flekker i kontroll (A-B) og Calcitriol (C-D) grupper. Innsatt i (A) representerer positiv CDH1 farging av normale tykktarm epitelceller. Mikrofotografiene ble tatt ved 40 x forstørrelse (A, C) og eske områdene utgjør 100 x forstørrelse (B, D). Representative mikrofotografier (40 × forstørrelse) av AR uttrykk i ikke-invasive prostata lesjoner fra ventral fliker av (E) kontroll og (F) kalsitriol gruppe. (G) CDH1 score på ikke-invasive ventral lobe lesjoner fra kontroll (n = 25) og kalsitriol (n = 27) grupper ble beregnet ved å tallfeste antall E-cadherin positive kjertler som beskrevet i
Materialer og metoder
seksjon. (H) Proliferativ indeks av LG og IG ventral lobe lesjoner av kontroll (n = 30), kalsitriol (n = 33) og QW (n = 27) gruppene ble bestemt ved å kvantifisere MKI67 flekker som beskrevet i
Materialer og metoder
-delen. Bare LG og IG prostata lesjoner ble analysert, mens sent stadium kreften ble ekskludert for både CDH1 scoring og MKI67 farging. Alle data er representert som boksplott med median, og værhår som representerer 5
th og 95
th persentiler. • (prikker), representerer punkter utenfor 5
th og 95
th persentil. Alle p-verdier ble generert ved hjelp av Mann-Whitney test.
I tillegg til å undersøke differensiering status for LG og IG ventral lapper, ble immunhistokjemisk farging utført med en MKI67 antistoff å undersøke effekten av kalsitriol og QW på spredning av ventral lobe. I forhold til kjøretøyet, kalsitriol betydelig redusert spredning i den ventrale lapp (p = 0,0467), mens QW var ineffektiv (p = 0,2667) (figur 5H). Analyse av apoptose viste at den totale ekspresjon av pro-apoptotiske kaspase 3 var meget lav (data ikke vist).
