Abstract
Bakgrunn
gaffelhodeboks L1 (FOXL1), regnes som en roman kandidat tumor suppressor, undertrykker spredning og invasjonen i visse kreftformer. Imidlertid er regulering og funksjon av FOXL1 i galleblærekreft (GBC) er fortsatt uklar.
Måter
FOXL1 ekspresjon på mRNA og proteinnivåene i GBC vev og cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR, immunhistokjemi og western blot analyse. FOXL1 uttrykk i GBC cellelinjer ble oppregulert ved transfeksjon med pcDNA-FOXL1. Effekten av FOXL1 overekspresjon på celle-proliferasjon, apoptose, migrering og invasjon ble evaluert in vitro eller in vivo. I tillegg ble status av mediatorer er involvert i overføringen, invasjon og apoptose undersøkt ved hjelp av Western blot etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1.
Resultatene
FOXL1 ofte ble nedregulert i GBC vev og cellelinjer. Dens høyere ekspresjon er assosiert med bedre prognose, mens dens nedre ekspresjon er korrelert med avansert stadium TNM og dårlig differensiering. FOXL1 overekspresjon i Noz celler undertrykker betydelig celleproliferasjon, migrasjon og invasjon in vitro og tumorgenisiteten i nakne mus. FOXL1 overekspresjon forstyrret mitokondrie transmembrane potensial og utløste mitokondrier-mediert apoptose i Noz celler. I tillegg FOXL1 overekspresjon trykt ZEB1 uttrykk og indusert E-cadherin uttrykk i Noz celler.
Konklusjon
Våre funn antydet at feilregulert FOXL1 er involvert i tumordannelse og progresjon av GBC og kan tjene som et prediktor for klinisk utfall eller et terapeutisk mål for pasienter med GBC
Citation. Qin Y, Gong W, Zhang M, Wang J, Tang Z, Quan Z (2014) gaffelhode Box L1 ofte nedregulert i galleblæren kreft og hemmer cellevekst gjennom apoptoseinduksjon av mitokondriell dysfunksjon. PLoS ONE 9 (7): e102084. doi: 10,1371 /journal.pone.0102084
Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Det medisinske fakultet, Chile
mottatt: 10 januar 2014; Godkjent: 14 juni 2014; Publisert: 10. juli 2014
Copyright: © 2014 Qin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 81272747 og nr 81372642). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
galleblærekreft (GBC) som representerer den mest vanlige og aggressiv type blant galleveis ondartede sykdommer er karakterisert ved ikke-spesifikke fremstillingen, sen diagnose og mangelen på effektiv behandling. Selv om de siste fremskritt har blitt gjort i diagnostisering og behandling, har resultatene av dagens behandlinger, for eksempel kirurgi, cellegift og strålebehandling (alene eller kombinert) vist seg å være sturen. Det er forbundet med en dårlig prognose med median overlevelse varighet på 4 måneder [1] og 5 års overlevelse mindre enn 10% [2]. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye og effektive behandlingsregimer for GBC pasienter. Men det begrenset kunnskap om tumorigenesis av galleblæren kreft hindrer utviklingen av diagnose og behandling for GBC. En bedre forståelse av den molekylære biologi og kreftfremkallende mekanismer som ligger til grunn for utvikling og progresjon av GBC kan bidra til å etablere mer effektive behandlinger.
gaffelhodeboks (FOX) proteiner er en superfamilie av transkripsjonsfaktorer som deler et sterkt konservert DNA-bindende domene (den gaffelhodeboks eller vinger heliks domene) styrer en rekke biologiske prosesser, inkludert metabolisme, differensiering, proliferasjon og apoptose [3]. Siden FOX proteiner regulere disse livsviktige prosesser i vekst og utvikling, en gevinst eller tap av FOX funksjon rask forårsaker menneskelige genetiske sykdommer, inkludert kreft. Den feilregulering av flere FOX underfamilier som FOXO, FOXM, FOXP, FOXC og Foxa er innblandet i tumorigenesis og progresjon av visse kreftformer [4]. Selv om FOX proteiner dele den svært konservert DNA-bindende domene, deres regulering og funksjon varierer betydelig mellom familier. FOX proteiner har ulike funksjoner og fungere som tumor suppressors eller onkogener under tumorigenesis og progresjon av ulike kreftformer. For eksempel, FOXO1 fungerer som en tumor suppressor som kan indusere apoptose og cellesyklusarrest i kreftceller [5]. I motsetning til FOXO1, viser FOXM1 onkogene aktivitet og målretting FOXM1 induserer apoptose i kreftceller [6]. En voksende mengde bevis har overbevisende måte vist at FOX proteiner kan representere attraktive mål for terapeutisk intervensjon mot mange typer kreft.
FOXL1 protein er medlem av FOX super som først ble oppdaget i mesenchyme av mage-tarmkanalen. Hittil har forholdet mellom FOXL1 og gastrointestinal kreft, inkludert mage, tykktarm og bukspyttkjertel blitt undersøkt i flere studier [7] – [8]. Imidlertid gjenstår den biologiske funksjonen til FOXL1 i GBC ikke klarlagt. I denne studien undersøkte vi betydningen av FOXL1 uttrykk hos pasienter med GBC i forhold til kliniske funksjoner og prognose. Vi har også gjennomført funksjonelle studier for å evaluere effekten av FOXL1 overekspresjon på proliferasjon, apoptose, migrering og invasjon av GBC celler in vitro eller in vivo. I tillegg har vi foreløpig undersøkt uttrykk for E-cadherin og sink-finger E-box binding homeobox 1 (ZEB1), som kan bidra til de hemmende effekter av FOXL1 overekspresjon i GBC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
forsøkene omfatter mennesker og dyr ble godkjent av etisk komité Xinhua sykehus, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Pasienter og vev samling
35 pasienter med GBC (13 menn og 22 kvinner, i alderen 51-71 yrs, gjennomsnittsalder 61,9 ± 5,4 år ) behandlet med radikal kolecystektomi (uten forutgående strålebehandling eller cellegift) mellom 2008 og 2013 ved Institutt for generell kirurgi, Xinhua sykehus, Shanghai Jiaotong University School of Medicine ble inkludert i denne studien. Tumorprøver (n = 35) og tilstøtende nontumor prøver (n = 12) ble oppsamlet umiddelbart etter kirurgi og nedsenket i flytende nitrogen. I henhold til TNM staging system (AJCC, 7
th, 2010), ble tumorene trinnvis (4 stadium I, 12 trinn II, 14 stadium III, og 5 stadium IV). Differensieringen klasse i henhold til WHO kriterier var som følger: 13 tilfeller var godt differensiert (WD), 15 moderat differensierte (MD) og 7 dårlig differensiert (PD). Den histologiske diagnose av alle GBC ble bekreftet av to patologer.
Immunohistochemistry
Frosne vevsprøver ble forankret i optimal skjæring temperatur (OCT) compound. 5-mikrometer tykk vevssnitt av tumorer og nontumor vev ble kuttet fra vevsblokker, og deretter fiksert i kald aceton ved 4 ° C i 20 minutter. Vevssnitt ble inkubert med 3% (v /v) H
2o
2 i metanol for å fjerne endogen peroksidaseaktivitet og deretter blokkert med normalt geiteserum. Etterpå seksjoner ble behandlet for immunhistokjemi bruker antistoffer mot FOXL1 (1: 100 fortynning, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) og sekundært antistoff (1: 500 fortynning, Santa Cruz Bio). Til slutt, Snitt ble inkubert med peroksidase-komplekset og visualisert med 3,3′-diaminobenzidin-tetraklorid (DAB). Alle immunfargete snittene ble blindt vurdert av to uavhengige patologer. Intensiteten ble evaluert ved hjelp av en tre-skala system (0, negativ, 1, svak, 2, moderat, 3, sterk). Den prosentvise positivitet ble også evaluert ved bruk av en tre-skala system (0, mindre enn 5%, 1, 5% -25%, 2, 25% -50%, 3, 50%). Den samlede kvantifisering for immunhistokjemi poengsum ble beregnet ved å multiplisere poengsummen for fargeintensitet og score på andelen positive celler. FOXL1 uttrykk nivåer ble rangert som følger: – (0-1), + (skår 2-3), ++ (skår 4-6) og +++ (poengsum 6). Ifølge resultatet av FOXL1 farging, ble GBC pasienter klassifisert i to grupper: lav uttrykk (- eller +) og høy uttrykk (++ eller +++)
Cellelinjer og kulturforhold
Fire menneske GBC cellelinjer GBC-SD, SGC-996, NOZ og OCUG-en ble brukt i denne studien. GBC-SD cellelinje ble kjøpt fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina; SGC-996 cellelinje [9] ble gitt av Tumor Cell Biology Research Institute of Tongji University, Shanghai, Kina; Noz og OCUG-en cellelinjer ble kjøpt fra helsevitenskap Forskningsressurser Bank, Osaka, Japan. Celler ble dyrket enten i DMEM, eller RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplementert med 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen) og 10% (v /v) føtalt bovint serum (HyClone, Logan, UT, USA) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator.
transfections
for å oppregulere uttrykk for FOXL1, pcDNA-FOXL1 (koder FOXL1 cDNA) ble konstruert og transfektert inn GBC celler. Den tomme vektoren pcDNA3.1 (Invitrogen) ble anvendt som kontroll. Kloningsstrategien og restriksjonskart av rekombinante plasmider er vist i Figur S1. Transfeksjon reagens Lipofectamine 2000 ble brukt under transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). For å oppnå stabile transfektanter, ble mediet erstattet med friskt komplett medium supplert med 300 ug /ml geneticin (G418) etter 48 timer med transfeksjon. Den selektive Mediet ble fornyet hver 3-4 dager inntil G418-resistente kloner kan identifiseres. FOXL1 ekspresjonsnivåene i cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR og western blot-analyse.
RNA isolering og RT-PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert fra frosne vevsprøver og GBC cellelinjer under anvendelse av Trizol reagenser kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp av en Takara RNA PCR kit (Takara Bio Inc, Dalian, Kina). Det oppnådde cDNA ble amplifisert ved bruk av følgende prosedyre: 94 ° C (5 min), og deretter 30 sykluser ved 94 ° C (30 sek), 59 ° C (45 e), 72 ° C (45 s). Sekvensene til primerne for FOXL1 var som følger: Sense: cacggtactccacttccagt; Anti-sense. Aacacttccctgaacccaca
Celleviabilitet og kolonidannelse analyser
Vann løselig tetrazolium (WST) -1 analysen ble utført for å måle celleviabilitet etter transfeksjon. 5 x 10
3 av transfekterte celler per brønn ble sådd ut på 96-brønners plater og dyrket i 24, 48, 72 eller 96 timer. Etterpå ble cellene deretter inkubert med WST-1 reagens i 2 timer ved 37 ° C. Absorbansen ved 450 nm ble målt ved bruk av en automatisert mikroplateleser (Bio-Rad 5 Modell 550, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ble og vekstkurven beregnes.
For kolonidannelsesbestemmelsen , 1 x 10
3 av transfekterte celler per brønn ble sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i fullstendig medium ved 37 ° C. Etter 14 dager for kultur, ble kolonier farget med krystallfiolett og antall kolonier ble talt av automatiserte koloniteller (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).
xenograft tumor eksperimenter
subkutane transplantater i nakne mus ble utført for å evaluere effektene av FOXL1 overekspresjon på cellevekst og tumorigenisitet in vivo. Mann og Kvinne Atymiske (nu /nu) naken mus 6-8 ukers alder ble hentet fra Shanghai Laboratory Animal Center of kinesiske Academy Sciences og plassert i henhold til spesifikke patogen-fri (SPF) tilstand. Noz celler ble stabilt transfektert med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1. Omtrent 1 x 10
7 av FOXL1-overuttrykkende celler eller kontrollcellene ble suspendert i et totalvolum på 200 ul av 1/1 (v /v) PBS /Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) og deretter subkutant injisert inn i flankene av mus. Ca. 4 uker etter injeksjon av tumorceller, ble synlige subkutane tumor-volum målt ukentlig med calipers og tumorvolumer i hver gruppe ble beregnet ved anvendelse av formelen: volum = lengde x bredde
2/2. Alle mus ble avlivet etter 6 ukers observasjon. Xenografttumorer ble fiksert i formalin og deretter innstøpt i parafin. Tumorvekt ble målt og registrert.
flowcytometrisk analyse av apoptose
celle apoptose in vitro ble bestemt ved flowcytometri hjelp Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (BD Biovitenskap) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1, ble cellene høstet, vasket med PBS og resuspendert i 1 x bindingsbuffer. Etterpå ble cellene farget med FITC-Annexin V og PI i 15 minutter og analysert ved strømningscytometri.
TUNEL assay
apoptose i vevssnitt fra xenograft tumorer ble vurdert ved terminal deoksynukleotidyl-transferase dUTP nick end merking (TUNEL) flekker ved hjelp av In situ celledød deteksjon kit, fluorescein (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) etter produsentens protokoll. Kort sagt ble xenograft tumorprøver deparaffinized ved hjelp av xylen og etanol. Vevssnitt ble inkubert med proteinase K-løsning i 15 minutter, etterfulgt av inkubasjon med TUNEL reaksjonsblandingen. Etterpå vevssnitt ble inkubert med konverter-POD og motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Fluorescens ble sett av fluorescens mikroskopi ved hjelp av egnede eksitasjon og emisjonsfiltre.
Flowcytometrisk analyse av mitokondriemembranen potensial
Endringen i mitokondrie trans potensiale ble bestemt ved flyt cytomery hjelp av mitokondriemembranen potensial sensitive fluorochrome fargestoff JC-1. Kort sagt ble cellene høstet NOZ 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1 og vasket med PBS. Celler ble inkubert med JC-1 (10 ug /ml i PBS) ved 37 ° C i 10 min. Fargede celler ble vasket med PBS to ganger og analysert ved flowcytometri.
mitokondrie og cytosolic ekstrakt forberedelse
De mengder av mitokondrie cytokrom c og cytosolic cytokrom c ble bestemt med mitokondrie-ekstrakt og cytosolic ekstrakt hhv. Mitokondrie og cytosoliske fraksjoner ble hentet fra dyrkede celler ved Mitokondrier /cytosol Fraksjone Kit (Abcam, Cambridge, UK) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, etter vasket med iskald PBS, ble transfekterte celler inkubert med cytosol ekstraksjonsbuffer blanding inneholdende ditiotreitol (DTT) og proteaseinhibitorer på is i 10 min. Celler ble homogenisert forsiktig ved anvendelse av en is-kald glass homogenisator. Cellesuspensjonen ble sentrifugert ved 3000 rpm ved 4 ° C i 10 min. Supernatantene ble sentrifugert på nytt ved 13.000 rpm i 30 minutter for å separere intakt mitokondriene (kuler) og cytosoliske fraksjon (supernatantene). Pelletene ble resuspender med 100 ul av mitokondriell ekstraksjonsbuffer blanding inneholdende DTT og proteasehemmere og vortex-blandet i 10 sekunder. Blandingen ble lagret som mitokondrie fraksjonen.
Western blot analyse
Totalt proteiner ble hentet fra Noz cellene 48 timer etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 eller pcDNA3.1. Proteininnholdet ble kvantifisert ved Bradford proteinanalyse. 40 ug protein ble separert ved 10-12% SDS-PAGE og elektrooverført til PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranen ble blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk, og probet med tilsvarende primære antistoffer (Santa Cruz Bio) over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med pepperrotperoksidase-koplet sekundære antistoffer (Santa Cruz Bio). Pepperrotperoksydasekonjugat aktivitet ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) kit (Pierce, Rockford, IL, USA) og utsatt for X-OMAT-Blue film (Kodak, Rochester, NY, USA).
Cell migrasjon og invasjon analysen
Cell migrering og invasjon-analyse ble utført ved anvendelse av en 24-brønners transwell kammer (Corning Inc, Corning, NY, USA) med 8 um porer i henhold til produsentens protokoll. De transfekterte celler ble sådd i ubestrøket (migrasjon analyse) eller matrigel belagt (invasjonen assay) øvre kammer compartement med serumfritt RPMI 1640. RPMI1640 supplementert med 10% føtalt bovint serum ble plassert i de nedre kamre som kjemotiltrekkende. 24 timer etter inkubering ble cellene på den øvre side av filtermembranen fjernes med en bomullsdott. Celler som festes til den nedre overflate av membranen ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter og deretter farget med krystallfiolett i 20 min.
Statistisk analyse
Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD . Statistisk analyse ble utført med SPSS 11.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Forskjellene mellom gruppene ble evaluert ved hjelp av Student t test eller One-Way ANOVA eller Kaplan-Meier log-rank eller chi-sqaured test. Den statistiske signifikans ble definert som P . 0,05
Resultater
FOXL1 uttrykk i GBC og dens forhold til clinicopathological variabler
FOXL1 mRNA og protein ble undersøkt i tumorvev og nontumor vev ved RT-PCR, western blot analyse og immunhistokjemi, henholdsvis. Som vist i figur 1A og B, FOXL1 mRNA og proteinnivåer ble redusert i kreftvev, sammenlignet med matchede nontumor vev. Videre to av tumorprøver mangler FOXL1 mRNA uttrykk og tre av tumorprøver mangler protein uttrykk.
(A) FOXL1 mRNA uttrykk i GBC vev og matchet nontumor vev. T: GBC vev; N, matchet nontumor vev. (B) FOXL1 protein uttrykk i GBC vev og matchet nontumor vev. (C) Immunohistochemistry analyse av FOXL1 i GBC vev og matchet nontumor vev. Forstørrelsen er 200 × og målestokken er 50 mikrometer. en: Positiv farging av FOXL1 i nontumor vev; b: Positiv farging av FOXL1 i godt differensiert (WD) svulster; c: Positiv farging av FOXL1 i moderat differensiert (MD) svulster; d: Positiv farging av FOXL1 i fattige differensiert (PD) svulster; (D) IHC score på GBC vev og nontumor vev (P 0,05). (E) IHC Resultatet tidlig TNM trinn (I og II) tumorer og sen TNM trinn (III og IV) tumorer (P 0,05). (F) IHC score på WD svulster og MD + PD tumorer (P 0,05). (G) Kaplan-Meier-kurver basert på FOXL1 uttrykk nivåer av immunhistokjemi i GBC. Pasientene med høy uttrykk for FOXL1 har bedre resultat i forhold til de med lav uttrykk for FOXL1 (P 0,05). (H) Den mRNA og protein uttrykk for FOXL1 i GBC-SD, SGC996, NOZ og OCUG-1 cellelinjer. (I) Transfeksjon med pcDNA-FOXL1 restaurert uttrykk for FOXL1 i Noz celler. * Indikerer signifikant forskjell.
Immunhistokjemisk analyse viste at FOXL1 protein ble hovedsakelig lokalisert i atom av kreftceller og normale epitelceller (figur 1C). FOXL1 protein ble rikelig uttrykt i normalt vev, men er forholdsvis mindre uttrykt i kreftvevet. At resultatet av FOXL1-positiv farging i GBC vev var mye lavere enn i normalt vev (P 0,05, figur 1D). FOXL1 ekspresjon var signifikant høyere i svulster med tidligere stadium (I og II) sammenlignet med de med sent stadium (III og IV) (P 0,05, figur 1E). Forskjell i score på FOXL1-positiv farging ble også målt mellom tumor karakterer (WD vs PD + MD) og ble funnet å være signifikant (P 0,05, figur 1F), med høyere FOXL1 score i WD grupper. I tillegg ble et høyere nivå av FOXL1 genekspresjon assosiert med bedre prognose. (P 0,05, figur 1G)
Den endogene FOXL1 mRNA og protein var påvises i GBC-SD, SGC996 og OCUG-1 cellelinjer , men ikke i NOZ cellelinje som blir derfor valgt for de påfølgende eksperimenter (figur 1 H). Transfeksjon med pcDNA-FOXL1 restaurert mRNA og proteinnivåer FOXL1 i NOZ cellelinje (figur 1i).
FOXL1 overekspresjon undertrykker spredning av NOZ cellelinje in vitro og in vivo
in vitro effekten av FOXL1 overekspresjon på proliferasjonen og veksten av NOZ celler ble bedømt ved WST-1-assay. Overekspresjon av FOXL1 signifikant hemmet celleproliferasjon i NOZ celler (P 0,05, figur 2A). Og dette veksthemming var tidsavhengig
(A) Veksten av Noz celler ble betydelig hemmet etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 (P 0,05).. (B) Colony dannelsen av Noz celler. Resultatene som er vist er representative for tre eksperimenter. (C) Transfeksjon med pcDNA-FOXL1 betydelig redusert antall kolonien i Noz celler (P 0,05). (D og E) FOXL1 overekspresjon redusert volum og vekt av tumor xenograft (P 0,05). * Indikerer signifikant forskjell.
De mer langsiktige hemmende effekter av FOXL1 overekspresjon på celleproliferasjon ble vurdert ved kolonidannelse analysen. En betydelig reduksjon i kolonien nummer ble observert i FOXL1-overuttrykkende celler sammenlignet med kontrollceller (P 0,05, Fig 2B og C).
For å undersøke rollen til FOXL1 i tumordannelse og vekst av GBC in vivo ytterligere, xenotransplantater i nakne mus ble etablert ved subkutan implantasjon av FOXL1 overekspresjon og kontrollceller. Xenografter dannet av FOXL1 overekspresjon cellene vokste mye langsommere enn de som dannes ved kontrollceller. FOXL1 overekspresjon in vivo induserte en signifikant reduksjon i både tumorvolum (P 0,05, figur 2D) og tumorvekt (P 0,05, figur 2E). Disse funnene antydet at FOXL1 undertrykker vekst av GBC celler både in vitro og in vivo.
FOXL1 overekspresjon fremmet apoptose i NOZ cellelinje in vitro og in vivo
Induksjon av apoptose ved FOXL1 overekspresjon i vitro og in vivo ble undersøkt ved bruk av Annexin V /PI analyse og TUNEL assay, respektivt. Som vist i figur 3A og B, en betydelig økning i andelen av apoptotiske celler (NOZ tidlig apoptose pluss sen apoptose) ble observert etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 (P 0,05). Og andelen av sen apoptotiske eller nekrotiske celler økte på en tidsavhengig måte (startet fra 24 timer og nådde toppen ved 72 timer).
(A) Apoptose av NOZ celler in vitro ble undersøkt ved Annexin V /PI dobbel farging. Celler som flekker negative for både Annexin V og PI er levedyktige celler (nederst til venstre). Celler som flekker positivt for Annexin V og negative for PI gjennomgår tidlig apoptose (nederst til høyre). Celler som flekker positivt for både Annexin V og PI er enten i sluttfasen av apoptose, eller gjennomgår nekrose (øverst til høyre). Resultatene som er vist er representative for tre eksperimenter. (B) Antallet av apoptotiske celler NOZ (inkludert tidlig apoptose, sen apoptose og nekrose) ble signifikant økt etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) Apoptose av NOZ celler in vivo ble bestemt ved anvendelse TUNEL assay. Apoptotiske celler er visualisert som intenst grønne fluorescerende celler. Antallet apoptotiske celler var tatt opp under høy effekt felt (400 ×). Lokalisering i atomkjerner ble visualisert ved kontra med DAPI (blå). (D) FOXL1 overekspresjon betydelig fremmet apoptose av Noz celler in vivo (P 0,05). * Indikerer signifikant forskjell.
TUNEL analysen viste at FOXL1 overekspresjon fremmet apoptose av Noz celler i xenografttumorer. Det var færre tunel-positive celler i xenografttumorer dannet av kontrollceller. I motsetning til det gjennomsnittlige antall TUNEL-positive celler signifikant økt i xenograft tumorer dannet av FOXL1 overekspresjon celler (P 0,05, figur 3 C og D)
FOXL1 overekspresjon indusert mitokondrie transmembrane depolarisering og cytochromec-mediert apoptose
Tap av mitokondriemembranen potensial (ΔΨm) viser initiering og aktivering av noen apoptotiske kaskader. I denne studien ble ΔΨm undersøkt av JC-1 farging. Tap av ΔΨm ble bestemt ved endringen i JC-1 fluorescens fra rød til grønn. Som vist på figur 4A og B, andelen av rød fluorescens-positive celler ble redusert mens andelen av grønn fluorescens-positive celler økte etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 (P 0,05), noe som tyder på FOXL1 overekspresjon induserte en tydelig reduksjon i mitokondriemembranen potensiale .
(A) tapet av mitokondriemembranpotensialet (ΔΨm) er indikert ved en reduksjon i den rød /grønn fluorescens intensitet forhold. X-aksen viser grønn fluorescens intensitet; Y-aksen viser rød fluorescens intensitet. Resultatene som er vist er representative for tre eksperimenter. (B) Andelen av rød fluorescens-positive celler ble redusert mens andelen av grønn fluorescens-positive celler økte etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) Western blot analyse viste at nivået av cytosolisk cytokrom c markert øket, mens nivået av mitokondriell cytokrom c markert redusert. (D) Konsentrasjonene av spaltet kaspase-9, 3 og PARP og Bax ble forhøyet, mens nivået av bcl-2 ble redusert. * Indikerer signifikant forskjell.
mitokondrie og cytosolic cytokrom c ble undersøkt av western blot analyse. Nivået på cytosoliske cytokrom c ble markert forhøyet, mens nivået av mitokondrie cytokrom c ble markert redusert 48 timer etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1, noe som tyder på at FOXL1 overekspresjon fremmet cytokrom c utgivelse fra mitokondriene til cytosol (figur 4C). Cytokrom c oksidase subenheten IV (Cox IV) og β-aktin ble benyttet som kontroll for mitokondrie protein og cytosolisk protein, respektivt. Videre fant vi pcDNA-FOXL1 induserte en økning i forholdet Bax /BCL-2, som kan utløse frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene til cytosol.
Effektene av FOXL1 overekspresjon på caspases aktivering i Noz celler var videre undersøkt med Western blot. Vi har funnet at spaltning av caspase-9 og -3 var betydelig økt 48 timer etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1. I tillegg ble spaltingen av poly (ADP) -ribose polymerase (PARP) som er kjennetegn på apoptose også øket bemerkelsesverdig etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1 (figur 4D). Disse funnene antydet at FOXL1 overekspresjon aktivert caspase kaskader i Noz celler.
FOXL1 trykkes migrasjon og invasjon av Noz celler og indusert E-cadherin uttrykk
Gitt at foreningen av FOXL1 uttrykk med klinisk stadium og lymfeknutemetastase av GBC var blitt demonstrert ovenfor, er det ventelig at FOXL1 kan spille en rolle i migrering og invasjon av GBC. Derfor vurderte vi neste rolle FOXL1 i migrasjon og invasjon av GBC. Som vist i figur 5A-C, transfeksjon med pcDNA-FOXL1 induserte en signifikant reduksjon i antallet av trekk og invasive NOZ celler sammenlignet med kontrollgrupper (P 0,05), noe som tyder på FOXL1 overekspresjon svekket trekk og invasive egenskaper av NOZ cellene . Videre har vi funnet E-cadherin proteinnivå var signifikant forhøyet i 48 timer etter transfeksjon med pcDNA-FOXL1, mens nivået av ZEB1 protein ble signifikant redusert (figur 5D).
(A) Et antall trekk og invasive celler farget med krystallfiolett reflekterte deres trekkfugl og invasive kapasitet. Antallet trekkende eller invasive Noz celler per synsfelt ble tellet under mikroskopi etter krystallfiolett farging (× 100). (B og C) Transfeksjon med pcDNA-FOXL1 betydelig hemmet migrasjon og invasjon av Noz celler (P 0,05). (D) ZEB1 uttrykk ble undertrykt og E-cadherin uttrykk ble indusert av FOXL1 overekspresjon. * Indikerer signifikant forskjell.
Diskusjoner
Rollene til gaffelhodefamiliemedlemmer som FOXOs, FOXMs og FOXPs i kreft har vært mye undersøkt. Men det er få forskere på regulering og funksjon av FOXL1 i kreft. I denne studien, ble rollen som FOXL1 i vekst, apoptose, migrasjon og invasjon av GBC celle foreløpig studert. Vi fant nivåene av FOXL1 mRNA og protein ble betydelig redusert i GBC vev sammenlignet med matchede nontumor vev. Foruten GBC, ble en nedgang i uttrykk for FOXL1 også observert av andre forskere i pankreastumorer [10], [11]. I tillegg ble FOXL1 uttrykk negativt korrelert med avansert stadium TNM og dårlig differensiering av GBC. Videre ble en høyere FOXL1 uttrykk assosiert med bedre prognose hos pasienter som gjennomgår kirurgi for GBC. Disse funnene antydet at downexpression av FOXL1 kan være involvert i tumordannelse og progresjon av GBC og FOXL1 kan tjene som en nyttig prediktor for prognosen for de pasienter som gjennomgår kirurgi. Lignende resultater ble også observert i myeloma og kreft i bukspyttkjertelen [8], [12]. Imidlertid har mekanismer for downexpression av FOXL1 uttrykk i disse kreftformene ikke klarlagt ennå. Flere mekanismer som for eksempel kromosomal delesjon [13], kromosomtranslokasjoner [14], [15], promoter metylering [16], endring i oppstrøms regulatorer [17], [18] og post-translasjonelle modifikasjoner [4] er blitt vist å bidra dereguleringen av Fox faktorer. Basert på dagens resultater, er det vanskelig å si hvilken mekanisme var ansvarlig for nedregulering av FOXL1 i GBC. Videre undersøkelser på genetiske og epigenetiske mekanismer for deregulert FOXL1 genuttrykk bør gjennomføres for å avklare saken.
Korrelasjonen av høyere FOXL1 uttrykk med tidlig stadium og bedre prognose foreslo sitt potensial undertrykkende rolle i GBC cellevekst og progresjon. Derav vi utført en rekke funksjonelle studier for å evaluere effekten av FOXL1 på veksten, apoptose, migrering og invasjon av GBC cellelinje.
Overekspresjon av FOXL1 signifikant hemmet veksten av NOZ celler in vitro og in vivo, og denne veksthemming kan tilbakeføres til induksjonen av apoptose ved overekspresjon FOXL1. Apoptose er en biologisk prosess som involverer en genetisk programmert serie av hendelser som fører til døden av en celle. I løpet av denne prosessen, flere viktige hendelser inntreffer i mitokondriene, inkludert frigjøring av cytokrom c fra mitokondrier til cytoplasma og tap av mitokondriell transmembrane potensial (ΔΨm) [19], [20]. ΔΨm er en viktig parameter av mitokondriell funksjon, og har blitt brukt som en indikator på levedyktige celler. Bcl-2-familien bestående av pro- apoptotiske og anti-apoptotiske medlemmer regulerer den mitokondrielle vei av apoptose ved å styre permeabiliseringen av den ytre mitokondriemembranen og åpning av spenningsavhengige anion kanal (VDAC). Pro-apoptotiske protein slik som Bax akselererer åpning av VDAC, mens anti-apoptotiske protein Bcl-x (L) lukkes VDAC ved å binde seg direkte til den. Økningen i forholdet Bax /Bcl-2 kan føre til avbrudd i ΔΨm og åpning av VDAC. Deretter kan mitokondriell cytokrom c translocate til cytosol gjennom VDAC og starte prosessen av apoptose [21].
