Abstract
Identifiseringen av de molekylære driverne av kreft ved sekvensering er ryggraden i presisjon medisin og grunnlaget for personlig terapi; Men biopsi av primære svulster gir bare et øyeblikksbilde av utviklingen av sykdommen og kan gå glipp av potensielle terapeutiske mål, særlig i metastatisk setting. Et flytende biopsi, i form av cellefrie DNA (cfDNA) sekvensering, har potensial for å fange opp den inter- og intra-tumoral heterogenitet til stede i metastatisk sykdom, og, gjennom serieblodprøver, sporer utviklingen av tumoren genomet.
for å bestemme den kliniske nytten av cfDNA sekvense vi fullført hele-exome sekvensering på cfDNA og svulst DNA fra to pasienter med metastatisk sykdom; bare mindre endringer i våre sekvense og analyse rørledninger var nødvendig for sekvensering og mutasjon kall cfDNA. Den første pasient hadde metastatisk sarkom og 47 av 48 mutasjoner som er tilstede i den primære svulsten ble også funnet i den celle-frie DNA. Den andre pasienten hadde metastatisk brystkreft og sekvensering identifisert en
ESR1
mutasjon i cfDNA og metastatisk området, men ikke i den primære svulsten. Dette forklarer sannsynligvis tumorprogresjon på Anastrozole. Betydelig heterogenitet mellom de primære og metastatiske tumorer, med cfDNA som gjenspeiler de metastaser, antydet atskillelse fra den primære lesjonen tidlig i tumorutvikling. Dette illustreres best ved en aktiverings
PIK3CA
mutasjon (H1047R) som var klonal i den primære tumor, men helt fraværende fra enten metastase eller cfDNA. Her viser vi at cfDNA sekvense forsyninger klinisk praktisk informasjon med minimal risiko i forhold til metastatiske biopsier. Denne studien viser anvendeligheten av hel-exome sekvensering av celle-fri DNA fra pasienter med metastatisk sykdom. cfDNA sekvense identifisert en
ESR1
mutasjon, en mulig forklaring på pasientens motstand mot aromatase hemming, og ga innsikt i hvordan metastatisk lesjoner avvike fra den primære svulsten
Citation. Butler TM, Johnson-Camacho K , Peto M, Wang NJ, Macey TA, Korkola JE, et al. (2015) Exome Sekvensering av Cell-Free DNA fra metastatisk kreft Pasienter Identifiserer Klinisk Konkrete Mutasjoner forskjellig fra primær sykdom. PLoS ONE 10 (8): e0136407. doi: 10,1371 /journal.pone.0136407
Redaktør: Kristy L. Richards, Cornell University, USA
mottatt: 17 november 2014; Godkjent: 04.08.2015; Publisert: 28 august 2015
Copyright: © 2015 Butler et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All .bam sekvense filer er tilgjengelige på det europeiske nukleotid Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena) (deponeringsnummer ERS700862, ERS700863, ERS700864, ERS700858, ERS700859, ERS700860, ERS700861)
Finansiering.: forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
Konkurrerende interesser:. Chritopher Corless mottatt honorarer og forskningsstøtte fra Ion Torrent /ThermoFisher. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Innledning
I 2014 var det være over 500.000 kreftrelaterte dødsfall i USA.; 90% av disse dødsfallene fra metastatisk sykdom. [1, 2] Mens kreft er preget av klonal progresjon, metastatiske lesjoner og tilbakevendende sykdom kan avvike vesentlig fra den primære svulsten, husing unike mutasjoner av klinisk betydning. [3] identifisere disse forskjellene som de dukke krever serie prøvetaking av svulsten genom, [4] ofte fra flere metastaser, som kan ha begrenset muligheten på grunn av tekniske utfordringer eller økonomisk byrde. Sekvensering fra blodplasma, men har potensial til å identifisere disse endringene uten invasive forbundet med solid tumor biopsier. [5-7]
Etter påvisning av mutante former av
KRAS
og
NRAS
i plasma hos kreftpasienter, har forskere fulgt cfDNA som en form for «flytende biopsi» av en persons kreft, ved å bruke den til å identifisere onkogene endringer i en rekke forskjellige maligniteter. [8-14] endringer i sirkulerende svulst DNA (ctDNA) i løpet av behandlingen kan måles lett gjennom serie prøvetaking på grunn av minimal invasiv natur blod uavgjorte. [15-19] Tidligere studier har fokusert på å kvantifisere ctDNA nivåer for å måle sykdomsbyrde, [15, 19, 20] søkte etter fremveksten av resistente mutasjoner til bestemte behandlinger, [18, 21-23] spores svulst evolusjon, [18] og vurderes prognose [12, 24, 25] og tilbakefall risiko. [16] påvisning av ctDNA krever spesielt følsomme metoder på grunn av sin fortynning av DNA fra ikke-kreft-celler, med varianten allel prosenter så lavt som 0,01% i tidlig sykdom. [12, 26, 27] studiet av tumorer av forskjellige typer og stadier har funnet at mens ctDNA nivåer varierer betydelig mellom prøvene, korrelerer metastatisk sykdom med høyere nivåer av cfDNA i plasma og en høyere andel av ctDNA. [6, 28] den relative overflod av cfDNA og ctDNA gjør det godt egnet for hel-exome sekvensering [18] som i motsetning til paneler med fokus på hotspot eller pasient-spesifikke mutasjoner, har potensial for å identifisere nye mutasjoner, som gir det unik verdi i studiet av terapeutisk motstand og tumorutvikling. Hel-exome sekvensering fra plasma har vist høye nivåer av samsvar mellom mutasjoner i svulstvev og cfDNA i metastatisk sykdom; Men tidligere har dette bare vært vist i prøver med eksepsjonelt høye ctDNA nivåer (33-65% av cfDNA fra tumor opprinnelse), i stor grad begrenser den kliniske nytte. [18]
I denne studien undersøkte vi om det er mulig av hel-exome sekvensering fra plasma hos to pasienter med metastatisk sykdom. Vi fant ut at med bare mindre endringer i våre eksperimentelle og analytiske metoder vi kunne nøyaktig rekapitulere svulsten genomet fra plasma, identifisere de samme klinisk relevante identifiserte mutasjoner ved sekvense tumor biopsier, og få ny informasjon om utviklingen av sykdommen. Disse metodene var følsomme i en prøve med en gjennomsnittlig ctDNA variant prosentandelen på 3,7%, noe som indikerer ca. 7,4% av cfDNA var av tumor opprinnelse (ctDNA), tilstrekkelig lav til å identifisere ctDNA for en vesentlig del av metastatiske pasienter. [6, 12, 16 ] Vi konkluderer med at cfDNA sekvensering av pasienter med metastatisk kreft gir verdifull innsikt til studiet og behandling av sykdommen.
Resultater
Pasient # 1
En 52-år- gammel kvinne ble diagnostisert med primær intimaoverflaten sarkom av lungearterien som var unresectable på presentasjonen. Pasienten ble først behandlet med stråling etterfulgt av kjemoterapi (figur 1), og på dette tidspunktet sitt tumoren ble screenet for onkogene mutasjoner ved hjelp av et multipleks-massespektroskopi-basert analyse som viste nærvær av
PIK3CA
R88Q og Q546R i primærtumor. [29] som et resultat, hun gikk inn i en fase i klinisk utprøving av en PI3 kinase inhibitor og hadde en delvis respons som varte i 12 måneder. Tjue måneder etter diagnose primærtumor DNA ble screenet igjen med en målrettet panel av en Ion Torrent PGM. Dette bekreftet de
PIK3CA
mutasjoner men også avslørt
KRAS
G12R. En blodprøvetaking ble tatt på dette tidspunkt, isolering av 1 ml buffy coat og 25mls av plasma (Tabell 1). På tidspunktet for blodprøvetaking pasienten hadde tallrike lesjoner i lungene, lungearterien, og lever (tabell 1). På grunn av den høye konsentrasjonen av cfDNA i plasma (63ng /ml), ble hel-exome sekvensering utført. Basert på
KRAS
mutasjon, ble pasienten deretter ble inkludert i en fase Ib klinisk studie som kombinerer MEK og PI3 kinase hemmere. Behandlingen ble stoppet etter åtte måneder på grunn av komplikasjoner som følge av behandling, og pasienten døde 30 måneder etter den innledende diagnose.
A) pasient diagnostisert med intimal spindel celle sarkom av lungearterien. Behandlinger og prøvetaking angitt i måneder.
Volum av plasma samlet inn fra enkelt blod uavgjort. cfDNA kvantifisert ved hjelp av Quan-iT HS pico grønn kit.
Hel-exome sekvensering av primærformalinfiksert parafin-embedded (FFPE) svulst avslørte 48 somatiske, exonic mutasjoner (Fig 2A, tabell 2. Vi har utført hel-exome sekvensering av cfDNA (524X gjennomsnittlig dybde) og med en terskelverdi på 1,5% variant allel prosent vi identifisert 47 av de 48 somatiske mutasjoner som er tilstede i den primære. på disse 48 områdene den midlere sekvense dybde i cfDNA var 561X (181-1,197X). den gjennomsnittlige variant allelet prosent over disse 47 mutasjoner var 3,7%, noe som indikerer at ca 7,4% av plasma DNA var svulst opprinnelse. Viktigere, vi identifisert fra plasma aktiverings
KRAS
G12R mutasjon og begge aktive mutasjoner i
PIK3CA plakater (R88Q og Q546R). Kontrollere for sekvense dybde, antall cfDNA mutant leser, eller variant allel prosentandel i primær vev ikke signifikant bedre korrelasjon.
A) ved hjelp av en cut-off på 1,5% variant allele prosent, 46 av de 47 mutasjoner som er tilstede i tumoren ble identifisert i cfDNA. Estimering fra den gjennomsnittlige variant allelet andel av 3,8%, ble 7,5% av den cfDNA avledet fra tumor. B) Femten flere mutasjoner ble kalt i cfDNA som ikke ble kalt inn svulsten prøven. Fire av disse er til stede i tumoren, men under vår ringer cutoff på 10% for svulsten. Gener uthevet i rødt ble vellykket validert via sekvense på Ion Torrent PGM. Omtrent 4000 genomene til cfDNA ble brukt som innspill til valideringer, noe som gir oss en lavere følsomhet bundet av 0,025 til 0,5% avhengig av stedsspesifikke bakgrunn feilrate.
Oppsummering av sekvense info for alle ti sekvense går. Alle leser er oppført i millioner. Deponeringsnummer for.bam filer lastet opp til europeiske Nukleotid Arkiv gitt, for sarkom pasienten alle 3 cfDNA går ble kombinert i en single.bam fil skilt med lesegruppe.
Femten flere mutasjoner ble identifisert i cfDNA . Blant disse er 11 ikke var til stede i den primære nummer og fire var til stede i den primære tumor (figur 2B), men ved allel frekvenser under vårt 10% terskel for å kalle dem i den primære tumor. Disse mutasjonene ble valgt for validering av sekvensering på Ion Torrent PGM hvor seks av dem ble bekreftet, åtte unnlot å validere, og gjorde ikke sekvens (Fig 2B). Valideringen sats på 43% understreker nødvendigheten av å bruke ortologe sekvenseringsmetoder i å bekrefte tilstedeværelse av lavfrekvente mutasjoner i cfDNA. cfDNA variant allel prosent korrelert dårlig med den primære svulsten (fig 3).
A) cfDNA variant allel prosent er dårlig korrelert med primær tumor variant allel prosent.
Pasient # 2
En 41 år gammel kvinne ble diagnostisert med eR + HER2 + brystkreft, som hadde spredt seg til lymfeknuter. Pasienten gjennomgikk neoadjuvant kjemoterapi (TAC), etterfulgt av en bilateral mastektomi og ooforektomi (fig 4A). Etter operasjonen, pasienten gjennomgikk strålebehandling og ble behandlet med trastuzumab i ett år og Anastrozole for 33 måneder, før oppdagelsen av en 4cm leveren lesjon og skjelettmetastaser ved 11
th thorax vertebra (T11). Tilleggs cellegift og Herceptin ble administrert, men behandlingen ble stoppet etter identifikasjon av levermetastaser. På denne tiden samlet vi en blod trekke ca 30 minutter før en leverbiopsi ble tatt og fikk en arkivert FFPE prøve av primærtumor. Blodet trekningen ga 15mls av plasma til en gjennomsnittlig cfDNA konsentrasjon av 98ng /ml (tabell 1). Etter den første plasmaprøve pasienten gjennomgikk behandling med anti-Her2 narkotika TDM1 men etter en innledende delvis respons døde 62 måneder etter første diagnosen.
a) behandlinger og prøvetaking angitt i måneder. B) 48 totalt somatiske mutasjoner ble kalt i den primære svulst bryst og /eller levermetastaser. 38 mutasjoner ble kalt i cfDNA bruker en variant allel prosent cutoff på 1,5%. Gener i rødt ble vellykket validert på Ion Torrent PGM, gener i blå klarte å validere, gener var svart ble ikke validert.
Hel-exome sekvensering av primærtumor og levermetastaser avdekket totalt 48 nonsynonymous somatiske mutasjoner (fig 4B, tabell 2). Sekvensering av cfDNA til en gjennomsnittlig dybde på 309X identifiserte 38 av disse mutasjoner med en gjennomsnittlig variant allel prosentandel på 14%, noe som indikerer omtrent 28% av cfDNA var av tumor opprinnelse. cfDNA VAP korrelert godt med VAP i levermetastaser (fig 5A og 5B), men dårlig korrelert med den primære tumor (data ikke vist). Ekstra dyp sekvensering bekreftet at en aktiverende
PIK3CA plakater (H1047R) mutasjon var til stede bare i den primære tumor, ikke i levermetastaser eller cfDNA, noe som indikerer at enten mutasjon fremkom etter metastase, eller var ikke til stede i en undergruppe at seeded metastasering. Sytten flere somatiske nonsynonymous mutasjoner ble kalt fra plasmaprøven. Nærmere undersøkelser viste at åtte av disse (47%) var unik for plasma, potensielt stammer fra metastaser ikke samplet (Fig 5C). To av disse mutasjonene ble valgt for validering via Ion Torrent PGM, både av dem lykkes validert (Fig 5C).
A) cfDNA variant allel prosent er korrelert med levermetastaser variant allel prosent B) Maksimal parsimony treet viser slektskap av prøver, gren lengde er antall somatiske, nonsynonymous mutasjoner C) Sytten flere mutasjoner ble identifisert unikt i cfDNA, hvorav 9 har leser støtte dem i den primære og /eller oppfylt, men hvor ikke kalt på grunn av utilstrekkelig sekvense dybde eller variant allelet prosentdel. Gener i rødt ble vellykket validert på Ion Torrent PGM, gener i blå klarte å validere, gener var svart ble ikke validert.
Ved å sekvensere cfDNA fra plasma vi er i stand til å få et øyeblikksbilde av svulsten , trolig fra flere metastaser. Her er den høye korrelasjonen mellom de levermetastaser, og indikerer at cfDNA betydelig informasjon om den aktuelle tumor-genomet kan oppnås uten behov for en biopsi. En mutasjon i
ESR1 plakater (D538G), som har vist seg å gi resistens mot østrogenmangel terapi, ble funnet i begge biopsier av metastaser og cfDNA. [30, 31] Denne mutasjonen var ikke til stede i initial exome sekvens av primærtumor og dens fravær ble bekreftet ved etterfølgende validering sekvensering av
ESR1
til en dybde på 4,272X (figur 6A). Det er sannsynlig at motstanden av svulsten til aromatasehemmer Anastrozole kan forklares med det muterte
ESR1
. Denne mutasjonen ble bekreftet i en CLIA laboratorium og anti-østrogen reseptor behandlinger ble ansett mellom cfDNA sekvensering og pasient død. I alt 15 mutasjoner ble valgt for validering på Ion Torrent PGM, 13 av disse ble validert (figur 4B og 5C). En andre plasmaprøve ble tatt under respons til TDM1 behandling (som bestemt ved CT-scanning) og åtte mutasjoner som er tilstede i den pre-treatment cfDNA prøven ble kvantifisert i løpet av behandlings prøve (Fig 6B). Forbehandlingen cfDNA prøve hadde en midlere variant allel prosentandel på 13% på tvers av disse åtte områder mens den under-behandling prøve hadde en midlere variant allel prosentdel av bare 0,04% i de fire områder inneholdende mutant leser og ingen påvisbar mutant leser i fire mutasjonene testet.
A)
ESR1
mutasjon ble sekvensert i større dybde på Ion Torrent PGM. B) Sammenligning av allelfrekvenser mellom pre- og under-TDM1 behandling cfDNA prøver for åtte mutasjoner stede i forbehandlingen prøven.
Diskusjoner
I denne studien har vi demonstrert som hel-exome sekvensering av cfDNA fra pasienter med metastatisk kreft nøyaktig kan identifisere klinisk handlings mutasjoner, og krever bare minimale endringer i veletablerte sekvense protokoller. Vi var i stand til å sekvensere og få verdifulle data fra en plasmaprøve med en midlere variant allel andel av 3,7%, mye lavere enn verdiene vist i tidligere studier og godt under frekvensene av en vesentlig del av metastatiske kreftpasienter. [12, 15, 16, 18, 19] Innføring av denne tilnærmingen har potensial til å sterkt utvide nytten av sekvensering versus biopsiavhengige tilnærminger som for tiden er standard vare. Mutasjoner som er tilstede i cfDNA tett korrelert med mutasjoner som er tilstede i en synkron metastase prøve, som indikerer at sekvense cfDNA kan generere et mer nøyaktig bilde av en pasients metastatisk tumor genom enn å stole på en biopsi av den primære tumor. Den cfDNA tett korrelerer med tumorvev tatt på tidspunktet for plasma anskaffelse og kan derfor anvendes for å ta «snapshots» av kreft genomet. I tillegg ble mutasjoner som er unike for cfDNA funnet i både pasienter, potensielt representerer lesjoner ikke samplet ved biopsi. Validering via ortologe sekvenseringsmetoder bekreftet at disse mutasjonene ikke var fra normal vev eller resultatet av sekvenseringsfeil og var sannsynligvis fra områder som ikke er til stede i biopsi. Manglende evne til å prøve alle metastaser i en kreftpasient er en alvorlig begrensning av dagens sekvense teknikker, og kan løses med minimale endringer i standardsekvense prosedyrer ved hjelp cfDNA.
De to pasientene i denne studien hadde høye nivåer av cfDNA i deres plasma (tabell 1), som tillater oss å bruke over 100 ng av cfDNA å konstruere våre sekvense biblioteker. Imidlertid, for mange pasienter en konsentrasjon på 10 ng av cfDNA per ml plasma er mer typisk, noe som indikerer at multiple blod trekker er nødvendig for å få tilstrekkelig materiale for sekvensering. Realisere dette, vedtok vi metodene skissert i Capp-Seq papir fra Diehn lab [19] som gjør at bibliotekene skal gjøres mer effektivt, krever mindre innledende innspill DNA. Ved hjelp av disse fremgangsmåter vi med hell fremstilt komplekse biblioteker fra mindre enn 40ng av cfDNA og vellykket sekvensert ~ 25% av inngangs DNA-molekyler (i motsetning til den ~ 1% effektivitet oppnådd i vårt studium). Denne forbedringen har tillatt oss å sekvensere tilstrekkelig cfDNA for nesten alle våre fag.
En annen fordel med sekvense cfDNA er evnen til å sekvensere serielt oppsamlede og minimalt invasive plasmaprøver, noe som åpner for nær sanntids overvåking av svulst genom under behandlingen. Identifiseringen av nye mutasjoner kan tillate behandling startes eller stoppes så snart svulsten miljø gjør dette en fordel. Når det gjelder pasient # 2, er det mulig at serie cfDNA sekvense ville ha identifisert fremveksten av
kan ESR1
mutasjon og behandling er justert fra østrogenmangel terapi (anastrozol) til en målgruppe østrogen reseptor selv (
e
g
Fulvestrant..): dette skiftet, og potensielt andre, kan ha forsinket progresjon av sykdommen. I tillegg til å se etter kjente resistensmekanismer, arten av hel-exome sekvensering gir mulighet for identifisering av nye vendende resistensmekanismer i en kohort av pasienter som gjennomgår samme behandling, som ikke kan inngå i en målrettet panel. Spesielt, i løpet av responsen hos pasienten # 2 til TDM1 var det en dramatisk reduksjon i nivået av ctDNA, slik at det nesten umulig å oppdage ved vår tilnærming sekvensering. Overvåking via exome sekvens i slike perioder vil kreve ekstremt høy sekvense dybde, noe som ville være uoverkommelig dyrt med dagens sekvense kostnader.
En betydelig fokus har blitt plassert på sekvensering av primære svulster og massive sekvense prosjekter (TCGA
m.fl.
.
)
har avdekket en betydelig mengde informasjon om driver mutasjoner i en rekke kreftformer. Men metastatiske svulster, som er ansvarlig for de fleste pasientdødsfall, er relativt studerte. Ved sekvensering av primære svulster sammen med seriemessig innsamlede plasmaprøvene er det mulig å overvåke progresjon metastatisk på et genomisk nivå. I pasient # 2 observerte vi en aktive
PIK3CA
mutasjon i den primære svulst som ikke ble sett i enten levermetastaser eller cfDNA. Det er sannsynlig at enten
PIK3CA
mutasjon ble klonal etter metastatisk prosess eller at mutasjonen var ikke til stede i metastatisk klone; uavhengig, behandling med et PI3K-inhibitor kan ha vært effektivt i synkende primær lesjon, men ville ha vært ineffektive mot noen av de fjernmetastaser. I motsetning til dette, sekvensering av pasient # 1 viste at cfDNA delte inneholdt nesten alle av de mutasjoner som er identifisert i den primære tumor. Mens vi var i stand til å få en prøve av metastaser, lavt antall mutasjoner unike for cfDNA betyr at det er ikke urimelig å antyde at det var relativt få forskjeller mellom metastase og primærtumor. Sekvense cfDNA fra større kohort av pasienter kan hjelpe oss å forstå hvordan metastatisk progresjon varierer i ulike krefttyper og kan identifisere terapeutisk relevante mønstre. Den kliniske nytten av denne metoden vil i stor grad avhenge systematisk tildeling av målrettet terapi til identifiserte cfDNA mutasjoner.
Spesielt tjenester for cfDNA sekvense blir kommersielt tilgjengelig, men er basert på paneler og derfor har begrenset nytte i en forskning setting. Vi viser her at det er betydelige verdier av hel-exome sekvensering fra cfDNA.
Materialer og metoder
Pasient innmelding
Skriftlig samtykke ble innhentet fra to pasienter med metastatisk kreft for innmelding i denne studien. Studien og samtykkeprosedyrer ble godkjent av Oregon Health Science University Institutional Review Board og i samsvar med statlige og institusjonelle retningslinjer. Opp til 40mls av blod ble oppsamlet i EDTA-rør. Plasma ble isolert som tidligere beskrevet [16] og lagret ved -80 ° C inntil cfDNA ble ekstrahert ved hjelp av QIAamp Circulating Nucleic Acid kit (Qiagen). Buffy coat ble isolert fra den samme blodprøven, og DNA ble ekstrahert ved bruk av DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Som en del av nevnte studien og samtykke prosedyre, ble FFPE vev fra pasientens primære svulster kjøpt fra arkivpatologiprøver. Pasient # 1 prøve ble kjøpt fra University of Washington Pathology avdeling i Seattle, WA (https://www.pathology.washington.edu/clinical/dermpath/contactinfo). Pasient # 2 prøve ble kjøpt fra Compass Oncology i Vancouver, Washington (https://compassoncology.com). FFPE vev ble ekstrahert ved bruk av DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen). Den samme pasientens levermetastaser ble tatt fra en frossen biopsi og ekstrahert med DNeasy Blood en leser som støtter mutasjonen eller den mutasjonen var bare til stede i en kjede av den cfDNA. Impact varianter ble kontrollert ved hjelp av Mutation Assessor v2 (www.mutationassessor.org).
Mutation validering
Primere ble utviklet for å dekke et utvalg av identifiserte mutasjoner i hver pasient og deretter brukt til PCR forsterke buffy coat, plasma, og svulst DNA-prøver fra både pasienter. For hver prøve ble amplikonene slått sammen i ekvimolare mengder og 10-100 ng ble anvendt for bibliotek oppretting ved hjelp av Ion Xpress Plus Fragment Library Kit. Sekvense maler ble generert ved hjelp av emulsjon PCR på Ion OneTouch 2 bruker Ion PGM Mal OT2 200 kit. Opptil seks strekkode prøver ble multiplekset på Ion 316 v2 chips. Sekvensering ble utført på en Personal Genome Machine (PGM) sequencer (Ion Torrent) ved hjelp av Ion PGM 200 v2 sekvense kit. Torrent Suite programvareversjon 4.0.2 ble ansatt for å justere leser til hg19. Leser ble visualisert ved hjelp av IGV v 2.2.32 (Broad Institute) og variant allelfrekvenser ble bestemt for områder som tidligere er identifisert via Illumina sekvensering.
