Abstract
Selv om dagens anti-kreft-protokoller er rimelig effektive, behandling-assosiert langsiktige bivirkninger, forårsaket av manglende spesifisitet av anti-kreft prosedyrer, forblir et utfordrende problem i pediatrisk onkologi. TAT-RasGAP
317-326 er et RasGAP-avledet celle-gjennomtrengelige peptid som fungerer som en sensibilisator til forskjellige anti-kreftbehandling hos voksne tumorceller. I denne studien, vurderte vi effekten av TAT-RasGAP
317-326 i flere barndommen kreft cellelinjer. Den RasGAP-avledede peptid-indusert celledød ble analysert i flere neuroblastom, Ewings sarkom og leukemi-cellelinjer (så vel som i normale lymfocytter). Celledød ble evaluert ved hjelp av strømningscytometri metoder i fravær eller i nærvær av peptidet i kombinasjon med forskjellige genotoxins anvendt i klinikker (4-hydroperoxycyclophosphamide, etoposid, vinkristin og doksorubicin). All testet pediatriske svulster, som respons på minst ett genotoxin, ble sensibilisert av TAT-RasGAP
317-326. Den RasGAP-avledede peptid ikke økte celledød av normale lymfocytter, alene eller i kombinasjon med de fleste av de testede kjemoterapier. Følgelig TAT-RasGAP
317-326 kan ha nytte av barn med svulster ved å øke effekten av anti-cancer-terapier særlig ved å tillate reduksjoner i anti-kreft legemiddel dosering og de tilhørende legemiddelinduserte bivirkninger.
Citation: Chevalier N, Gross N, Widmann C (2015) Vurdering av kjemosensibiliserende aktivitet av TAT-RasGAP
317-326 i kreft hos barn. PLoS ONE 10 (3): e0120487. doi: 10,1371 /journal.pone.0120487
Academic Redaktør: Salvatore Papa, Institutt for Hepatology – Birkbeck, STORBRITANNIA
mottatt: 03.10.2014; Godkjent: 23 januar 2015; Publisert: 31 mars 2015
Copyright: © 2015 Chevalier et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Dataene angå CGH array-profilene til NB1 neuroblastom avledet-cellelinjer ble hentet fra en tredjepart: Dr. Aurélie Coulon ([email protected]) fra Pediatrisk Oncology Research Unit, Universitetet Hospital Center (CHUV), Lausanne, Sveits) hvor leserne kan sende forespørsler om data
Finansiering:. Funding levert av FORCE foundation – https://www.force-fondation.ch/(NC NG); MD-PhD fellesskap fra den sveitsiske National Science Foundation (n ° 158116) (NC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft representerer den andre dødsårsaken hos barn etter ulykker i industrialiserte land [1, 2]. Vår forståelse av barnekreft har dratt nytte av betydelige fremskritt i løpet av de siste fire tiårene. Standard behandlinger for å kurere pediatrisk tumor omfatter kirurgi, strålebehandling og intensiv kjemoterapi med flere stoffer slik som etoposid, vinkristin, doksorubicin, og cyklofosfamid [3].
I utviklede land, åtti prosent av barn som er diagnostisert med kreft er forventet å overleve i løpet av 5 år etter behandlingen. Imidlertid vil de fleste av dem lider av kroniske sykdommer ved 40 års alder [4]. Utvidet overvåking av pediatriske kreftoverlevere viser en høy risiko for livstruende senskader fra andre malignitet, hjerteproblemer og lungesykdommer [5, 6]. Risikoen for tidlig dødelighet for det meste bestemmes av behandlingsspesifikke faktorer slik som den kumulative dosen av kjemoterapi [7]. Derfor behandlings-assosiert langtids bivirkninger indusert av skade på ikke-tumorceller er et utfordrende problem og forblir stort sett uløst. Som barn er per definisjon langtidsoverlevende, er det et sterkt behov for å utvikle lav toksisitet, bedre målrettet og effektiv nye terapeutiske strategier for alle typer av kreft hos barn [8]. Strategier for å omgå slike hindringer omfatter forbedring av anti-kreft legemiddel sensitivitet og spesifisitet overfor kreftceller [9-11].
I denne sammenheng har vi tidligere har rapportert at en celle-gjennomtrengelig peptid avledet fra P120 RasGAP proteinet , kalt TAT-RasGAP
317-326, er en svulst-sensitive til ulike anti-kreft narkotika. Faktisk, selv om det ikke viser noen toksisitet mot cellene på egen hånd, det effektivt og spesielt sensitizes voksne kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
til ulike anti-kreft-behandling, inkludert kjemoterapi [ ,,,0],12,13], og fotodynamisk terapi [14]. Viktigere, viser den spesifisitet overfor kreftceller som det ikke sensibiliserer ikke-tumorceller for å genotoxin-indusert apoptose [12, 14]. TAT-RasGAP
317-326 ser ut til å ha flere anti-kreft aktiviteter enn tumorcelle allergi som det har nylig blitt demonstrert at dette peptid kan hemme celle migrasjon og invasjon
in vitro product: [15, 16] og at denne aktiviteten kan hemme metastatization prosessen
in vivo product: [17]. Dette indikerer at RasGAP-avledet peptid har evnen til å virke som en anti-metastatisk forbindelse på toppen av dens tumor allergiske reaksjoner. Nylig har det blitt vist at de anti-kreft egenskaper av TAT-RasGAP
317-326 er avhengig av to tryptofanrester i posisjon 317 og 319 [16]. Imidlertid er virknings av TAT-RasGAP
317-326 ikke fullstendig karakterisert. Det har tidligere vært vist at dette peptidet ikke favoriserer død av tumorceller ved å modulere aktiviteten av Ras, MAPK signalveier, NF-kB transkripsjonen aktivitet, Akt proteinnivåer og fosforylering status [18, 19]. Videre, Bcl-2-familiemedlemmer, som regulerer mitokondrisk avhengig celledød, ble vist å være individuelt unnværlig for sensitiverende aktivitet av peptidet [20].
Effekten av dette peptid i kreft hos barn er imidlertid ikke kjent. Molekylærbiologi av pediatriske svulster er forskjellig fra kreft hos voksne på mange måter. Som genesis av de fleste barnekreft synes å komme fra forstyrrelser av normal tidlig utvikling, de samler færre mutasjoner enn voksne svulster. På den annen side ser det ut til at utviklingen av de pediatriske svulster avhengige av epigenetiske modifikasjoner [21-23]. I denne studien har vi derfor undersøkt om TAT-RasGAP
317-326 var i stand til å gjengi barndommen svulster mer sensitive for klinisk relevante anti-svulst narkotika.
Metoder
Cellelinjer og kultur celler
CCRF-CEM [24], THP-1 [25] og A673 [26] cellelinjer ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC) (referanser CRL-8436, TIB-202 , CRL-1598 henholdsvis). LAN-1 [27] og M-07E [28] cellelinjer ble hentet fra Leibniz Institute DSMZ-tysk Innsamling av mikroorganismer og cellekulturer (referanser ACC655 henholdsvis ACC104). EW-11 [29], TC252 [30] og NB1-avledede [31] cellelinjer ble beskrevet tidligere. Alle cellelinjer ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C. De neuroblastom cellelinjer (LAN-1, NB1-FBS, NB1-FBS-Re) og EW-11 Ewings sarkom-cellelinjen ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Gibco, Paisley, UK) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco). De NB1-NBM neuroblastom primære tumorceller ble opprettholdt i nevrale basisk medium fremstilt av DMEM /F12 (Gibco) supplert med 2% B27 serumfritt supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng /ml human rekombinant basisk fibroblast vekstfaktor ( bFGF) (Peprotech), og 20 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF) (Peprotech). Den CCRF-CEM og THP-1 akutt leukemi-cellelinjer, og det A673 og TC252 Ewing sarkomceller, ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco) inneholdende 10% FBS. M07e, en akutt myelogen leukemi-cellelinje, ble holdt i Minimal Essential Medium alfa (MEMα) (Gibco) supplert med 10% FBS og 5 ng /ml rekombinant, human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) (Peprotech). Humane perifere blod lymfocytter (PBL) ble isolert ved tetthetssentrifugering over en Ficoll-Paque gradient (Lymphoprep, Stemcell Technologies) fra buffy strøk med friske pasienter, hentet fra staten Vaud blodoverføring service. Giverne ga skriftlig samtykke til mulig bruk av deres blod for medisinsk forskning. PBLs ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco) supplert med 8% av sammenslått humant serum og supplert med 100 U /ml rekombinant human interleukin-2 (Proleukin, Roche Pharma AG).
Kjemi
Stoffet som ble brukt var vinkristin (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), etoposid (Sigma-Aldrich), 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC) (Niomech, Bielefeld, Tyskland) og doxorubicin (Pfizer AG, Zürich, Sveits). Fargingen brukes til å utføre strømningscytometri var 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) og Annexin V-FITC (Annexin V-FITC /7-AAD kit, Beckman Coulter, Miami, USA).
Peptidsyntese
TAT-RasGAP
317-326 (GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD), TAT
48-57 (fra nå av kalt TAT) (GRKKRRQRRR), TAT-egge~~POS=TRUNC (GRKKRRQRRRGGWLDMTTVNRW) og TAT-mutert (GRKKRRQRRRGGAMWVTNLRTD ) ble syntetisert ved Avdeling for biokjemi, Universitetet i Lausanne, Sveits som beskrevet tidligere [12].
cytotoksiske analysen
for celler som vokser i suspensjon (THP-1, M07e, CCRF-CEM og lymfocytter), tre hundre tusen celler ble sådd i 6-brønns plater og direkte behandlet med de angitte doser av 4-HC, etoposid, vinkristin eller doksorubicin i nærvær eller i fravær av 10 pM TAT-RasGAP
317-326, TAT, TAT-egge~~POS=TRUNC eller TAT-mutert. For tilhenger cellelinjer (NB1-NBM, NB1-FBS, NB1-FBS-Re, LAN-en, EW-11, TC252, og A673), to hundre tusen celler fikk lov til å følge i 48 timer i 6-brønners plater og ble deretter behandlet som celler som vokser i suspensjon. Tjuefire timer etter medikament inkubasjon ble cellene underkastet strømningscytometri for å evaluere celledød. Kort sagt ble adherente cellelinjer frittliggende ved trypsin-EDTA (Gibco) og enkeltcellesuspensjoner ble bearbeidet og farget med 1 pg /ml 7-AAD og 50 ng /ml Annexin V-FITC i 500 ul bindingsbuffer. Et minimum av ti tusen celler ble analysert. 7-AAD fargestoff-avledede signal kan ikke brukes når cellene ble behandlet med doksorubicin fordi 7-AAD og doxorubicin har lignende fluoriserende egenskaper (7-AAD emisjonsbølgelengde: 525 nm; doxorubicin emisjonsbølgelengde: 530 nm [32]).
Statistisk analyse
Med mindre annet er nevnt, alle eksperimenter ble avledet fra tre eller flere uavhengige eksperimenter. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± 95% konfidensintervaller. Betydning ble vurdert ved hjelp av t-tester utført med Microsoft Excel 2010 etterfulgt av Bonferroni korreksjoner (dvs. forskjeller ble betraktet som signifikant når p-verdiene 0,05 /n, der n er antall sammenligninger gjort). Stjernene representerer statistisk signifikante forskjeller. I det siste tallet, ble betydningen vurdert av enveis ANOVAs fulgt av Bonferroni (Dunn) t post-hoc tester ved hjelp av SAS 9.2-programvaren (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).
Resultater
I denne studien, tre typer barnekreft ble analysert: nevroblastom, leukemi, og Ewing sarkom. Blant barndommen maligniteter, er neuroblastom den hyppigste ekstrakraniell solid kreft. Dødsfall som følge av neuroblastom står for 15% av alle tumorrelatert død hos barn [33]. Multiresistens, ervervet under eksponering til kjemoterapi, spiller en stor rolle i dette dårlig resultat [34, 35]. Leukemi er den vanligste barndommen kreft type og representerer en tredjedel av alle pediatriske svulster [36]. Selv om mindre utbredt enn leukemi, er Ewing sarkom en aggressiv kreft med en dårlig prognose og en høy grad av tilbakefall med metastatisk sykdom [37]. De er ansatt her narkotika er alle brukt i klinikkene. Deres eiendommer er presentert i tabell 1.
TAT-RasGAP
317-326 sensitizes akutt lymfatisk og myelogen leukemi celler til ulike cytostatika uten å vise noen effekt mot kreftceller av seg selv
for å undersøke effekten av sensibilisering TAT-RasGAP
317-326 i leukemiceller, ble tre forskjellige cellelinjer utsettes for økende konsentrasjoner av cytostatiske midler i fravær eller i nærvær av 10 pM TAT-RasGAP
317 -326. Etoposid, vinkristin, doksorubicin, og 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC), den aktive formen av cyklofosfamid, var de stoffer som brukes her og er hver for tiden benyttes i klinikken. Celledød ble vurdert ved hjelp av 7-AAD at etiketter døde celler som har permeabilized plasmamembranen og med Annexin V som binder seg til fosfatidylserin eksponert på døde celler. Noen av de anti-kreft legemidler som brukes her induserte en samtidig opptreden av de 7-AAD og Annexin V-signaler (Fig 1A viser representative tilfellet med 4-HC). Med andre ord, så snart en celle ble Annexin V-positive det også plukket opp 7-AAD fargestoff. Derfor, i våre hender, anti-kreft medikamenter slik som 4-HC induserte en nekrose-lignende type død. I de neste figurer, blir de 7-AAD data rapportert som vi har funnet dem til å være assosiert med en lavere varians enn de som oppnås med Annexin V-farging (figur 1B). Det eneste unntaket var da doksorubicin ble brukt. Faktisk fluoresces dette fargestoffet på lignende bølgelengder som 7-ADD. I dette tilfellet derfor blir de Annexin V-dataene presentert. Disse forsøkene viste at TAT-RasGAP
317-326 sensitizes betydelig leukemicellene til nesten alle testede legemidler (Fig 2A). Men i enkelte forhold (for eksempel når THP-1 celler blir behandlet med vinkristin) tumorceller ikke svarer godt til TAT-RasGAP
317-326. En begrenset sensibilisering effekt av RasGAP-avledet peptid er ikke nødvendigvis er en følge av iboende resistens mot et medikament som CCRF-CEM-cellelinjen, som er vincristin-resistent, effektivt ble sensibilisert ved TAT-RasGAP
317-326. Dette punktet er spesielt klinisk relevans som det indikerer at TAT-RasGAP
317-326 kan utøve en allergi effekt i chemo-resistente celler.
A. Tre hundre tusen CCRF-CEM-celler ble sådd ut i 6-brønns plater og direkte behandlet med 50 uM 4-HC. Celledød ble evaluert etter flere tidspunkter (0, 3, 6, 12 og 24 timer) ved bruk av 7-AAD og Annexin V-FITC farging. B. CCRF-CEM-celler ble sådd ut i 6-brønns plater og direkte behandlet med de angitte doser av 4-HC, etoposid eller vincristin i nærvær eller i fravær av 10 pM TAT-RasGAP
317-326. Etter 24 timers inkubering medikament, 7-AAD og Annexin V-FITC-farging ble gjennomført for å evaluere celledød. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide.
A. To akutt myelogen leukemi-cellelinjer (THP-1 og M-07N) og én T-akutt lymfatisk leukemi cellelinje (CCRF-CEM) ble sådd ut i 6-brønns plater og behandles direkte med 4-HC, etoposid, vinkristin eller doksorubicin ved indikerte konsentrasjoner i nærvær eller i fravær av 10 pM TAT-RasGAP
317-326. Etter 24 timers inkubering medikament, 7-AAD eller Annexin V-FITC-farging ble gjennomført for å evaluere celledød (siste fire kolonner). Alternativt kan (første kolonne), ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av TAT eller TAT-RasGAP
317-326 alene. Etter 24 timer ble evalueringen av celledød utført ved bruk av 7-AAD farging. B. Isolerte lymfocytter fra tre forskjellige friske forsøkspersoner ble behandlet som beskrevet i fig. 2A. De doser av kjemoterapeutiske midler anvendt for å behandle friske lymfocytter fra de tre fagene er lik de som brukes for å behandle T-ALL CCRF-CEM-celler. Legg merke til at grafene er avledet fra enkle forsøk hvor lymfocyttene er umiddelbart anvendt etter deres isolering (hvis dyrket
in vitro
, de ville oppleve høye nivåer av spontan apoptose som ville hindre nøyaktig måling av anti-kreft narkotika- og peptid indusert død). T-ALL, T-akutt lymfatisk leukemi; AML, akutt myelogen leukemi; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P. 0,05 t-test etter Bonferroni korreksjon
TAT-RasGAP
317-326 av seg selv ikke indusere celledød i de testede leukemi cellelinjer, selv på en to ganger høyere konsentrasjon (20 pM) enn det som blir brukt for å indusere en sensibilisering effekt (10 pM) (figur 2A).
TAT-RasGAP
317-326 viser ikke toksisitet mot ikke-tumor-lymfocytter fra friske forsøkspersoner .
Det ble vist tidligere ved hjelp av ikke-tumor udødelig humane keratinocytter (HaCaT) og navle vaskulær endotel (HUV-EC-C) celler som TAT-RasGAP
317-326, i kombinasjon med ulike genotoxins, ikke sensibilisere ikke-tumorceller [12]. I den foreliggende undersøkelse har vi brukt isolerte lymfocytter fra helblod fra friske pasienter for å undersøke selektiviteten av RasGAP-avledet peptid mot kreftceller. Vi brukte de samme doser av kjemoterapeutiske midler til å behandle friske lymfocytter som de som brukes til å behandle CCRF-CEM T-akutt lymfatisk leukemi (T-ALL) cellelinje (Fig 2A). Fig 2B viser responsen av lymfocytter fra perifert blod (PBL) stammer fra tre forskjellige friske forsøkspersoner (fag A-C) til RasGAP-avledet peptid i kombinasjon eller ikke med genotoxins som benyttes i fig 2A. Den RasGAP-avledet peptid i seg selv ikke viser noen toksisitet mot PBLs. Følsomheten av de ikke-tumor-lymfocytter for de testede kjemoterapi alene var lik følsomheten til CCRF-CEM-cellelinjen (til og med noe økt i tilfelle av doksorubicin for de friske forsøks A og C). Observasjonen at kreft og normale lymfocytter var tilsvarende følsom for genotoxins var noe overraskende fordi begrunnelsen for å bruke et gitt kjemoterapi er at det vil være rettet fortrinnsvis de ondartede cellene. Likevel, den viktige informasjonen hentet fra figur 2B er at TAT-RasGAP
317-326 ikke bevisst PBLs å etoposide-, vinkristin- og doxorubicin-mediert død. Peptid men gjorde noen ganger bevisst PBLs til 4-HC (Fig 2B), noe som tyder på at TAT-RasGAP
317-326 kan påvirke levedyktigheten til normale celler i enkelte behandlingskombinasjoner.
TAT-RasGAP
317-326 kan potensere genotoxin-indusert celledød i Ewing sarkom
for å utvide etterforskningen på TAT-RasGAP
317-326 i ikke-leukemi barndommen kreft, effekten av TAT-RasGAP
317-326 ble også testet i Ewing sarkom celler. Resultatene viser at den RasGAP-avledet peptid er også i stand til å sensibilisere disse cellene til forskjellige genotoxins, men i en lavere grad enn i leukemier (figur 3). I noen tilfeller ble det ikke observert sensitivisering (for eksempel når vinkristin ble brukt i A673 og TC252 cellelinjer). Her igjen, TAT-RasGAP
317-326 alene ikke viser noen toksisitet mot Ewing sarkom celler (fig 3).
Tre Ewing sarkom cellelinjer (EW-11, A673 og TC252) ble sådd i 6-brønns plater og etter 24 timer ble behandlet med 4-HC, etoposid, vinkristin eller doksorubicin ved de angitte konsentrasjoner i nærvær eller i fravær av 10 pM TAT-RasGAP
317-326. En dag senere ble celledød evaluert. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P. 0,05 t-test etter Bonferroni korreksjon
De NB1 neuroblastom avledet-cellelinjer er direkte drept av TAT-RasGAP
317-326
Ervervet chemoresistance er en viktig årsak til svikt i behandling av nevroblastom. For å vurdere effekten av TAT-RasGAP
317-326 i celler som ble eksponert for høye doser av kjemoterapi og derfor som potensielt har ervervet resistens mot disse cytotoksiske midler, vi valgte primærtumorceller av en enkelt pasient på ulike stadier av sykdom. De NB1 cellene er høy risiko stadium 4 primære neuroblastom celler avledet fra benmarg prøvene som ble etablert ved førstegangsdiagnose (NB1-NBM og NB1-FBS) og ved senere tilbakefall etter kjemoterapi med flere stoffer (NB1-FBS-Re) (fig 4A ). NB1-FBS og NB1-FBS-Re-cellelinjer ble dyrket i 10% føtalt bovint serum (FBS) -inneholdende DMEM-medium, mens NB1-NBM celler ble etablert i neural basisk medium (NBM). NBM er en stamcellegivende serumfritt, bFGF-, EGF- og B27-supplementert medium for å støtte vekst av neural crest-celler, vev av opprinnelsen til neuroblastom [38, 39].
A. Den lysegrå tykk pil øverst på figuren representerer behandlingsregime administreres til pasienten fra hvem de tre NB1-avledede cellelinjer ble etablert. De NB1 cellene er avledet fra primær høy risiko neuroblastom beinmargsprøver. NB1-NBM og NB1-FBS ble etablert ved førstegangsdiagnose og dyrket i NBM og DMEM media, henholdsvis. NB1-NBM-Re ble etablert på et senere tilbakefall og dyrket i DMEM. De tre NB1-avledede cellelinjer ble behandlet som beskrevet i figur 3. B. LAN-1 cellelinjen er avledet fra en høy risiko neuroblastom. LAN-1-cellene ble behandlet som beskrevet i figur 3. M, måned; BM, benmarg; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P. 0,05 t-test etter Bonferroni korreksjon
Figur 4A viser at NB1-NBM og NB1-FBS cellelinjer ikke viser samme følsomhet mot de testede chemotherapies. Dessuten, til effekten av TAT-RasGAP
317-326 forbedre den drepende virkning av 4-HC varierer mellom disse to cellelinjene: den NB1-FBS-celler ble funnet å være meget følsom for sensibilisering effekten av peptidet, mens de NB1-NBM celler ble ikke påvirket av tilstedeværelsen av TAT-RasGAP
317-326. Som den eneste forskjellen mellom de NB1-NBM og NB1-FBS cellelinjer er det medium i hvilket de blir dyrket, kan en hypotese at metabolismen av de NB1 cellene varierer fra en kultur tilstand til den andre, og at dette differensielt modulerer følsomheten tumorceller til TAT-RasGAP
317-326.
for å undersøke om allergi effekten av TAT-RasGAP
317-326 var fortsatt effektiv på tilbakefall neuroblastom celler, sammenlignet vi dens effekt mellom NB1-FBS celler og NB1-FBS-Re celler. Begge cellelinjene blir dyrket i det samme dyrkningsmedium. Behandlingsregimet som ble brukt til å behandle pasienten er vist på fig 4A. Pasienten de tilbakefall cellene som ble avledet, ble utsatt for de fire stoffer (4-HC, etoposid, vinkristin og doksorubicin) ble testet i denne undersøkelsen. Imidlertid, med unntak av 4-HC-behandlede forhold der vi kan observere en svak motstand mot dette stoffet i den NB1-FBS-Re-celler, de tilbakefall cellene ikke er mer motstandsdyktig mot etoposid, vinkristin og doksorubicin enn de celler avledet fra innledende diagnose (fig 4A). Tvert imot, NB1-FBS-Re-celler viser en økt følsomhet for doksorubicin i forhold til de NB1-FBS-celler. Ikke desto mindre TAT-RasGAP
317-326 sensitizes de tre primær NB1-avledede cellelinjer, men i et annet nivå av effektivitet i henhold til cellelinjen og den testede kjemoterapi (figur 4A).
I de fleste tilfeller har TAT-RasGAP
317-326 ikke indusere tumor celledød av seg selv. Men vi fant ut at de tre NB1 avledet-cellelinjer kan være direkte drept av RasGAP-avledet peptid (figur 4A). Dosen som trengs for å indusere celledød (20 mm) er likevel høyere enn dosen som brukes for å bevisstgjøre cellene til genotoxins (10 mm).
For å fullføre etterforskningen av effekten av TAT-RasGAP
317 -326 i neuroblastom tumor type, vi også testet peptid på LAN-en, en annen neuroblastom cellelinje avledet fra en aggressiv stadium 4 neuroblastom. Figur 4B viser at RasGAP-avledet peptid viser en svak sensibilisering effekt mot denne cellelinjen. I motsetning til de NB1 avledet-cellelinjer, TAT-RasGAP
317-326 alene var ikke i stand til å drepe LAN-1 celler (figur 4B), noe som betyr at TAT-RasGAP
317-326-indusert celledød er ikke en spesifisitet deles av alle neuroblastomer.
den sensibiliserende aktivitet av TAT-RasGAP
317-326 bæres av RasGAP-avledet sekvens
for å vurdere spesifisiteten av chemo-sensibiliserende aktivitet TAT-RasGAP
317-326, tre forskjellige styre peptider ble testet: et peptid sammensatt av TAT-sekvensen bare (TAT), et peptid hvori RasGAP sekvensen var egge (TAT-egge), og et peptid i hvilken første tryptofan av RasGAP sekvensen ble byttet inn i en alaninresiduum (TAT-mutert). Dette tryptofan ble nylig vist seg å være avgjørende for sensibiliserende aktivitet av TAT-RasGAP
317-326 hos voksne svulster [16]. Effekten av TAT-RasGAP
317-326 og de tre kontroll peptider ble testet i CCRF-CEM-celler i kombinasjon med forskjellige anti-kreft medikamenter ved doser som tillot den største sensibilisering aktivitet som skal påvises. CCRF-CEM-celler ble brukt fordi dette leukemicellelinje var det en mest effektiv måte sensibilisert ved RasGAP-avledet peptid. Figur 5A viser at alle tre kontroll peptider hadde en tendens til lett å favorisere død CCRF-CEM-celler når de kombineres med forskjellige anti-kreft medikamenter, men i de fleste tilfeller er dette ikke nådde statistisk signifikans. I motsetning til TAT-RasGAP
317-326 markert, og alltid betydelig, sensitiv for disse cellene til narkotika. Den liten sensibilisering virkning av styre peptidene er mest sannsynlig på grunn av den celle penetrerende aktiviteten av TAT del, som har potensiale til å negativt påvirke cellulær homeostase [40]. Lignende resultater ble oppnådd når den TC252 Ewings sarkom-cellelinje og den NB1-FBS neuroblastom-cellelinje ble benyttet: TAT-RasGAP
317-326 betydelig økt følsomhet for 4-HC, mens de tre kontroll peptidene ikke, eller bare minimalt (fig 5B og 5C). Disse data indikerer at tumoren sensitiverende aktivitet av TAT-RasGAP
317-326 bare svakt avhengig av sin evne til å trenge inn i cellene via TAT celle-gjennomtrengelige sekvens. Derfor kan det konkluderes med at den sensitiverende aktivitet av TAT-RasGAP
317-326 er hovedsakelig bæres av RasGAP-avledet sekvens.
A. CCRF-CEM-celler ble sådd ut i 6-brønns plater og direkte behandlet med 10 uM TAT-RasGAP
317-326, TAT, TAT-kodet eller TAT-Mutert i fravær eller i nærvær av 4-HC, etoposid, vinkristin eller doksorubicin ved de angitte konsentrasjoner. Etter 24 timers inkubering medikament, 7-AAD eller Annexin V-FITC-farging ble gjennomført for å evaluere celledød. B-C. De TC252 (B) og NB1-FBS (C) cellelinjer ble behandlet på samme måte, men i kombinasjon med bare 4-HC. P10, TAT-RasGAP
317-326; TAT-S, TAT-Egge; TAT-M, TAT-mutert; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. Betyr med samme bokstav er ikke signifikant forskjellig.
Diskusjoner
tiden søkt terapi for å behandle barndommen solide kreftformer, som neuroblastom og Ewing sarkom, må være mer effektiv og spesifikk for å bedre klinisk resultat. Leukemi har vanligvis en bedre 5-års overlevelse enn pediatriske solide tumorer, men langtidseffekter av behandlingen fortsatt være en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Videre har ervervet resistens mot konvensjonelle behandlinger er ansvarlig for tilbakefall og dårlig prognose. Følgelig finne mindre giftige og mer effektive terapeutiske midler til behandling av pediatriske kreftformer er en nødvendighet for å redusere narkotikainduserte skadelige bivirkninger og tilhørende dødelighet [3].
I denne studien, vurderte vi effekten av TAT -RasGAP
317-326 i flere barndommen kreft cellelinjer. Dette RasGAP-avledet peptid var allerede kjent for å bevisstgjøre voksne kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
til ulike anti-kreft terapi [12]. Våre resultater viser at TAT-RasGAP
317-326 sensitizes betydelig barndommen kreftceller i de fleste av de testede forholdene. Men i noen tilfeller, tumorceller ikke, eller minimalt, svare på peptidet. Den pediatriske tumor-sensibiliserende virkning illustrert i denne studien ble nådd ved hjelp av halvparten av peptid konsentrasjon brukt tidligere for å bevisstgjøre voksne kreftceller (10 mm TAT-RasGAP
317-326 i denne studien i stedet for 20 mikrometer i papir av Michod et al. [12]). Muligens, dosen av TAT-RasGAP
317-326 kan fordobles for å øke den sensibiliserende effekt av peptidet i forhold der det var mindre effektiv. Siden primærtumorceller representerer en mer klinisk relevant tilstand, vi også testet peptidet i primær neuroblastom-celler avledet fra benmarg prøver fra en enkelt pasient (de tre NB1-avledede cellelinjer som vist i figur 4). Resultatene viser at den RasGAP-avledet peptid sensitizes primærtumorceller, noe som tyder på at det kan utøve sin anti-kreft-aktivitet på tumorer i en
in vivo
sammenheng.
Virkningsmekanismen av TAT -RasGAP
317-326 gjenstår å være nøyaktig bestemt [18-20]. Vi først antatt at det å arbeide med et stort panel av cellelinjer og cytotoksiske midler som vil tillate oss å tegne et mønster som kan brukes til å forutsi hvilken type barndommen svulster viser følsomhet overfor TAT-RasGAP
317-326 som reaksjon på en gitt legemiddel. Slik informasjon vil være nyttig å dechiffrere virknings av TAT-RasGAP
317-326. For dette formål, analyserte vi hvordan halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) for hver kjemoterapeutisk middel ble modifisert ved nærværet av tat-RasGAP
317-326 for en gitt cellelinje (tabell 2). Den RasGAP-avledede peptid ble redusert IC
50 for de fleste genotoxins i de fleste cellelinjer. Imidlertid kan ingen bestemt mønster basert på tumor opprinnelse eller type narkotika utledes fra dataene som er presentert i tabell 2. Vi har også sett på om det var noen felles spesifikke mutasjoner i kjente onkogener eller tumorsuppressorgener (f.eks HRAS, KRAS, NRAS, HDM2, N-MYC, C-MYC, TAL1, FLI-1, MLL, p53 og RB1) i de analyserte cellelinjer. Igjen kunne ingen sammenheng funnet mellom tilstedeværelsen av spesifikke mutasjoner i en kreftcellelinje og dens evne til å bli sensibilisert ved RasGAP-avledet peptid.
Et interessant aspekt ved denne forskningen er at sensibilisering effekten av TAT-RasGAP
317-326 kan forskjellig modulert av cellekultur forholdene. Dette trekk er illustrert ved det faktum at NB1-FBS-celler, men ikke den NB1-NBM celler, er følsomme overfor effekten av peptidet. Disse to cellelinjer er avledet fra den samme neuroblastom tumoren ved innledende diagnose (se figur 4), men de ble dyrket i ulike medier. Disse to cellelinjer synes å ha de samme genomiske forandringer. Faktisk har de samme matrise-CGH profiler med de samme typiske neuroblastom-forbundet segment chromosomic endringer (upubliserte data). Så hvis disse to cellelinjer har identisk utvalg-CGH profiler, hva kan forklare deres ulike følsomhet for TAT-RasGAP
317-326? En mulighet er at det medium hvori de er dyrket modulere deres metabolisme differensielt. Dette kan i sin tur påvirke deres følsomhet overfor anti-kreft-behandling. Det er faktisk akkumulerende bevis for at den metabolske tilstand av kreftceller spiller en viktig rolle i den måte de reagerer på anti-kreft legemidler [41]. En annen hypotese er at ulike cellepopulasjoner blir valgt på passasjer i ulike medium.
