Abstract
For å generere genomiske signaler, har androgenreseptoren (AR) for å bli transportert inn i kjernen ved androgene stimuli. Det er imidlertid bevis fra
in vitro-eksperimenter som
i kastreringsresistent prostatakreft (CRPC) -celler AR er i stand til å translocate inn i kjernen i en ligand-uavhengig måte. Den nylige funn at hemming av glykogen-syntase-kinase 3β (GSK-3P) induserer en hurtig atom eksport av AR i androgen-stimulert prostatakreftceller fikk oss til å analysere effektene av en GSK-3β hemming i kastrering-resistente LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR. Begge cellelinjer som har høye nivåer av AR atom i fravær av androgene stimuli. Eksponering av disse cellene til maleimid SB216763, en potent inhibitor GSK-3β, resulterte i en hurtig atom eksport av AR, selv under androgen-belastede tilstander. Videre ble evnen til c4-2 og LNCaP-SSR-celler til å vokse i fravær av androgener avtok etter farmakologisk hemming av GSK-3β
in vitro
. Evnen til SB216763 å modulere AR signalering og funksjon i CRPC
in vivo
ble i tillegg vist i en modifisert chick chorioallantoic membran xenograft analysen etter systemisk levering av SB216763. Våre data antyder at hemmingen av GSK-3β bidrar til å målrette AR for eksport fra kjernen for derved å svekke virkningene av feilplassert AR i CRPC celler. Derfor hemming av GSK-3β kan være en interessant ny strategi for behandling av CRPC
Citation. Schütz SV, Schrader AJ, Zengerling F, Genze F, Cronauer MV, Schrader M (2011) Hemming av Glykogen syntasekinase-3β Motvirker ligand-uavhengig aktivitet av androgen Receptor i Kastrering resistent prostatakreft. PLoS ONE 6 (9): e25341. doi: 10,1371 /journal.pone.0025341
Redaktør: Vladislav V. Glinsky, University of Missouri-Columbia, USA
mottatt: 02.03.2011; Godkjent: 01.09.2011; Publisert: 29.09.2011
Copyright: © 2011 Schütz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt av Handling Lions Vaincre le Cancer, Luxembourg (til MVC). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Transkripsjonell regulering av kjernereseptorer spiller en sentral rolle i utviklingen og veksten av prostatakreft (PC) celler. Dette er godt eksemplifisert ved rollen til androgenreseptoren (AR), en ligand-aktivert transkripsjonsfaktor som tilhører steroid-reseptor superfamilien. I fravær av androgener, er det AR hovedsakelig lokalisert i cytoplasma stabilisert ved en multichaperone kompleks [1]. Ved binding av androgener, er det AR antas å gjennomgå en konformasjonsendring som fører til en homodimerization med en annen AR protein etter dissosiasjon fra deler av multichaperone-komplekset [2]. Deretter blir AR aktivt transportert inn i cellekjernen hvor det bindes til spesifikke DNA-sekvenser betegnes androgen responselementer (ER) innenfor promoter-eller forsterker regioner av AR målgener [3] for derved å aktivere den generelle transkripsjonsapparatet [4].
den første androgen avhengighet av prostata kreft celler er grunnen til at de fleste PC reagerer på androgen ablasjon terapi. Dessverre er fordelen med androgen ablasjon bare forbigående. Etter en periode på rundt to år, PC nesten alltid utvikle seg til en tilstand av sykdommen betegnes kastrering resistent prostatakreft (CRPC) hvor kreftceller kan vokse og overleve under kastrat nivåer av sirkulerende androgener. Selv om
in vitro
utvikling av en androgen-uavhengig fenotype er hovedsakelig basert på tap av AR i kreftceller, er det bevis fra flere kliniske studier at AR er sjelden tapt i CRPC celler
i vivo product: [5], [6]. Videre har disse studier tyder på at resistens overfor konvensjonelle hormonterapi er ikke på grunn av et tap av androgen følsomhet, men heller kan være en konsekvens av en deregulert AR-signale aksen [7].
For å generere signaler i genomisk hormonavhengige PC-celler AR må transporteres inn i kjernen ved androgene stimuli. Det er overbevisende bevis fra
in vitro
eksperimenter som i en undergruppe av CRPC celler, overtar AR muligheten til å gjennomgå ligand-uavhengig skytteltrafikk fra cytoplasma til kjernen [8]. Mest interessant, i disse celler AR viser et høyt nivå av konstitutiv, androgen-uavhengig aktivitet [9]. Som atom nærvær av reseptoren er en forutsetning for AR-signalering, kan regulering av nukleær translokasjon avdekke nye strategier for behandling av androgen-avhengige både PC så vel som CRPC.
Forskjellige studier har tilbudt innsikt i atom import av AR. En todelt kjernelokaliseringssekvensen (NLS) er blitt identifisert i det DNA-bindende domene (DBD) og hengsel-regionen til AR [10]. Dette NLS benytter det klassiske importin svei for transport gjennom den atom pore-komplekset [11], [12]. I tillegg er en mindre definert NLS til stede i den ligandbindende domene (LBD) av AR [13], [14]. I motsetning til den kjernefysiske innførsel av AR, er involvert i AR atom eksport mekanismer dårlig forstått. DNA-bindende domener (DBD) av ulike steroidreseptorer har blitt foreslått å fungere som kjernefysiske eksport signaler (NES) for en calreticulin mediert atom eksport [15]. Men for den AR disse dataene har blitt diskutert controversially [16], [17]. Nylig, Saporita et al. rapporterte identifisering av en ny NES (aminosyrene 743-817) befinner seg i LBD av AR [18]. Identifiseringen av en NES i LBD av AR er i overensstemmelse med tidligere funn av vår gruppe å studere kjernefysiske eksport av AR i androgen-stimulert PC celler etter hemming av glykogen-syntase-kinase 3β (GSK-3β) [19 ].
Oppdagelsen av at hemming av GSK-3β induserer en rask atom eksport av AR i androgen-stimulert PC celler bedt oss om å analysere virkningene av GSK-3β hemming i kastrering-resistente LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR [20], [21], som begge er kjent for å oppvise høye nivåer av AR atom i fravær av androgene stimuli. Begge
in vitro
samt
in vivo
data som presenteres i denne studien tyder på at induksjon av nucleocytoplasmic AR eksport kan være en nyttig strategi for å redusere AR signalering, spesielt i avansert CRPC.
Resultater
AR og GSK-3β er oppregulert i CRPC cellelinjer
for å analysere virkningene av GSK-3P-hemmere på AR-aktivitet i CRPC celler vi først bestemmes endogene AR eller GSK-3P nivåer i hele celleekstrakter av PC celler dyrket i fravær av DHT. AR-positive LnCap underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR, kjent for å proliferere i fravær av androgener, tjente som modeller for CRPC [20], [21]. Androgen-følsomme LNCaP samt AR-negative PC3-celler tjente som kontroller. Som vist i figur 1 A, AR var påvisbare i alle LnCap linjer dyrket i fravær av det AR-stabiliserende androgen DHT. Intracellulær AR nivåene var signifikant økt i de AR-positive celler (CRPC c4-2 + 177%, LNCaP-SSR + 126%) (Tabell 1). Økningen av AR-protein i kastrerings-resistente underlinjer LnCap ble stadig av en økning i PSA (c4-2 + 337% og LNCaP-SSR + 110%, henholdsvis), idet sistnevnte antyder at AR er spesielt aktive i disse cellene ( Figur 1A, B, tabell 1). Western blot-analyse av intracellulær GSK-3β protein avslørte betydelig høyere intracellulære GSK-3P nivået i c4-2 (+ 361%) og LNCaP-SSR (+ 150%) celler i forhold til de paren LNCaP-celler (figur 1 A, tabell 1) .
(A) Intracellulær AR og GSK-3β-proteinnivåer i PC-cellelinjer dyrket i fravær av androgener. AR-positive LNCaP, LNCaP-SSR og c4-2-celler, så vel som AR-negative PC3-celler ble dyrket i 48 timer under androgen-belastede tilstander. Deretter ble cellene lysert og cellelysatene ble analysert ved Western blotting for AR og GSK-3β. p-aktin band tjente som lasting kontroll. (B) Intracellulær PSA nivåer i CpRC celler dyrket under androgen-belastede forhold. AR-positive LNCaP, LNCaP-SSR og c4-2-celler ble dyrket og behandlet som beskrevet. Relative PSA nivåer ble bestemt i de tilsvarende cellelysatene ved Western blotting som beskrevet i Materiale og metode. β-actin band tjente som lasting kontroll.
Maleimidet SB216763 reduserer GSK-3β aktiverende fosforylering på tyrosin 216
Flere studier rapporterte at flertallet av GSK- 3P-molekyler er inaktive i LNCaP-celler som et resultat av en fosforylering ved serin 9 (S9) [26], [27]. Det er imidlertid eksperimentelle bevis for at GSK-3β aktivitet det er ikke fullt ut hemmet i LNCaP-celler [28], [29], [30], [31], [32]. Etter DHT behandling, fosforylering av GSK-3β ved tyrosin 216 (GSK-3β
Y216), en GSK-3β aktiverende fosforyleringssetet, ble øket i LNCaP og c4-2-celler (fig. 2). For å hindre gjenværende GSK-3β aktivitet i LNCaP og c4-2-celler, ble cellene behandlet med den maleimid SB216763, en GSK-3β inhibitor nylig vist å inhibere fosforylering av GSK-3β
Y216 [33]. Videre ble evnen til SB216763 til å hemme GSK-3β aktivitet i c4-2 celler bekreftet ved endringer i status fosforylering av β-catenin, en prototypiske nedstrøms mål for GSK-3β (figur S1).
LNCaP celler og c4-2 celler ble sådd på T25 kolber og lov til å følge over natten. Etter dette ble mediet erstattet med steroid-fritt medium og cellene ble dyrket i ytterligere 24 timer. Deretter SB216763 (sluttkonsentrasjon 5 mM) ble tilsatt 30 minutter før DHT (10 nM) behandling. Etter 4 timer ble cellelysater analysert for GSK-3β
Y216 og GSK-3β
S9 fosforylering som beskrevet i Materiale og metode.
Som forventet, inkubasjon med SB216763 hemmet fosforylering av GSK-3β
Y216 i begge cellelinjene, blir størst i androgen-uavhengig c4-2 celler (fig. 2). Mest interessant, en SB216763 indusert reduksjon av GSK-3
Y216 fosforylering i DHT-behandlede c4-2 celler ble stadig av en økning i S9 fosforylering (fig. 2).
Unliganded AR er lokalisert til kjernen i CRPC LNCaP-underlinjer
Nuclear lokalisering av AR er en forutsetning for genomisk signalering. Som vist i figur 3, er CRPC underlinjer LNCaP-SSR og c4-2 oppviser høy atom AR i fravær av androgene stimuli. Når behandlet med DHT, ble atom AR dramatisk økt i de hormonavhengige LNCaP celler, mens økningen i kjernefysiske AR i LNCaP-SSR og c4-2 forble marginal (Fig. 3, tabell 2). For ytterligere å analysere den ligand-uavhengige kjernefysiske innførsel av AR i LNCaP og kastrering-resistente c4-2, ble celler transfektert med et ekspresjonskonstrukt som koder for grønt fluorescerende AR villtype-EOS-fusjonsprotein (AR-EosFP) [19]. I motsetning til LNCaP-celler hvori AR-EosFP var bare atom i nærvær av DHT, AR-EosFP kunne påvises i kjernen av c4-2 celler i fravær av androgener (fig. 4). Dette funn tyder på at den dominerende nukleær lokalisering av AR i c4-2-celler ikke skyldes en autonom funksjon av reseptormolekylet, men er avhengig av en deregulering av cellulære faktorer i c4-2-celler.
Celler ble dyrket i henhold til steroid frie betingelser i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med 10 nM DHT og inkubert i ytterligere 30 minutter. Deretter SB216763 ble tilsatt (sluttkonsentrasjon 5 mM) og cellene ble tillatt å vokse i en annen 210 min. Etter denne behandling ble nukleære ekstrakter fremstilt og analysert for AR og lamin A som beskrevet i Materialer og Metoder. AR og Lamin A nivåer ble kvantifisert ved densitometri. AR nivåene ble uttrykt i fold-endring AR /Lamin av celler dyrket i fravær av DHT og SB216763, som ble satt til 1.
LNCaP celler og c4-2 celler ble transfektert med par-t1EosFP og dyrket i 24 timer i fravær av androgener. Deretter ble cellene behandlet med /uten DHT (sluttkonsentrasjon 10 nM). Etter 4 timer atom eller cytoplasma lokalisering av AR-EosFP ble overvåket av fluorescens mikroskopi.
Behandling av kastreringsresistent LNCaP underlinjer med SB216763 utløser en CRM1-mediert atom eksport av AR i fravær av androgener
i androgen-stimulert PC celler, kortsiktig hemming av GSK-3β aktivitet med ulike lite molekyl hemmere ble vist å indusere en rask CRM1 avhengig nucleocytoplasmic skyt av AR. Den kjernefysiske eksport var uavhengig av den virkemåte av inhibitoren anvendes i forskjellige studier [32], [19]. For å analysere virkningene av en GSK-3β-inhibering på androgen-uavhengig atom akkumulering av AR, ble CRPC cellelinjer LNCaP-SSR og c4-2 behandlet med GSK-3β inhibitor SB216763. Foreldre androgen-avhengige LNCaP celler fungerte som kontroller (figur 3). Behandling av c4-2 celler med SB216763 indusert en rask atom eksport av AR i fravær /nærvær av androgener, som vist ved densitometri av tre uavhengige Western blot (AR-eksport rate i fravær av DHT = 64%, i nærvær av DHT = 75%) (tabell 2). Androgen-uavhengig atom opphopning av AR i kastrering-resistente LNCaP-SSR underlinjen ble også svekket etter SB216763 behandling: Men effekten var mindre tydelig enn i c4-2 celler (41% i fravær av DHT, 46% i nærvær av DHT) (tabell 2). Den kjernefysiske eksport av AR i LNCaP-celler dyrket i fravær av androgener forble marginal, men var fremdeles påvisbar (17% i fravær av DHT, 7% i nærvær av DHT) (tabell 3). Interessant nok, kan den kjernefysiske eksport av AR-protein i c4-2-celler dyrket i fravær av DHT etter SB216763 behandling hemmes av leptomycin B bekrefter en CRM1 avhengig eksport mekanisme (fig. 5).
C4- 2-celler dyrket i fravær av androgener ble inkubert med /uten inhibitor CRM1 leptomycin B (LMB) 30 min før SB216763 behandling. Etter 4 timer ble atom ekstrakter forberedt og analysert for AR og Lamin A som beskrevet i Materiale og metode.
lyddemping og lang sikt hemming av GSK-3β i c4-2 celler
Ved hjelp av en kommersiell validert shRNA rettet mot GSK-3β (32), var vi i stand til å dramatisk redusere intracellulære GSK-3P nivåer i c4-2 celler (fig. 6A). Denne nedregule Parallelt med en utarming av kjernefysisk AR protein i c4-2 celler. Nuclear uttømming av AR-protein var mindre fremtredende når c4-2-celler ble dyrket i nærvær av det AR-stabiliserende hormonet DHT (Fig. 6A). Langtidsbehandling av androgen-stimulert LNCaP og 22Rv1 celler med forskjellige farmakologiske GSK-3P-hemmere har gjentatte ganger vist at GSK-3β er involvert i AR stabilitet [27], [32]. Det faktum at c4-2-celler uttrykker høye nivåer av cytoplasmisk samt atom AR i fravær av androgener fikk oss til å analysere effektene av SB216763 for intracellulære AR nivåer. Som vist i fig. 6B, langtidsbehandling med SB216763 fører til en nedregulering av det AR-protein i c4-2-celler dyrket i fravær av androgener.
(A) stanse av GSK-3β i c4-2-celler. C4-2 celler ble transient transfektert med PKD-GSK-3β-v1 eller PKD-NegCon-v1. 48 timer etter transfeksjon, ble 10 nM DHT lagt der det er angitt. Etter ytterligere 24 timer, ble atom ekstrakter fremstilt som beskrevet i Materiale og metode. (B) Langsiktig hemming av GSK-3β hjelp SB216763. AR-positive c4-2-celler ble behandlet med økende mengder av SB216763 i 48 timer i fravær av androgener. Celler ble lysert og cellelysatene ble analysert ved Western blotting for AR. p-aktin band tjente som lasting kontroll.
AR-positive CRPC celler c4-2 og LNCaP-SSR er mer utsatt for veksthemmende effekten av GSK-3β hemmer SB21676 enn LNCaP celler eller AR -negative PC3-celler
Inhibering av GSK-3β har blitt vist å hemme proliferasjonen av AR-positive celler dyrket i nærvær av fysiologiske nivåer av androgener [27], [32]. Med fokus på CRPC celler, undersøkte vi effekten av SB216763 på spredning av PC cellelinjer dyrket under androgen-belastede forhold. Som det fremgår av figur 7A, AR-positive CRPC celler dyrket i fravær av androgener var mer følsomme overfor veksthemmende virkninger av SB216763 (c4-2 LNCaP-SSR LNCaP). I et tidsforløp eksperiment (Fig. 7B), spredning av AR-positive cellelinjer CRPC LNCaP-SSR og c4-2 dyrket i 96 timer i nærvær av 1 uM SB216763 ble inhibert med 26% og 35% henholdsvis. I motsetning til dette ble den formeringshastigheten av den paren LNCaP og AR-negative PC3 bare redusert med 19% og 8% når de dyrkes under de samme betingelser. Oppsummert AR-positive LNCaP-celler var mer utsatt for SB216763 behandling enn de AR-negative PC3-celler. Effekten av SB216763 på mobilnettet spredning av PC celler dyrket under androgen-belastede forhold var den mest uttalt i AR-positive CRPC celler (c4-2 LNCaP-SSR LNCaP PC3). (Fig. 7A, B)
AR-positive LNCaP, LNCaP-SSR og c4-2-celler så vel som AR-negative PC3-celler, ble behandlet med økende mengder SB216763 i 48 timer (A) eller med /uten 1 mM SB216763 for 0, 24 og 96 timer (B). Proliferasjon ble målt ved anvendelse av en MTT-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene som er vist under (A) er uttrykt i% av ubehandlede kontroller ± standardavvik. Resultatene som er vist under (B) er uttrykt i prosent av SB216763-behandlede /ubehandlede kontroll som ble satt til 100% for tidspunktet null ± standardavvik.
Inhibering av GSK-3β regulerer AR-signale ved å modulere intracellulær lokalisering av AR
in vivo
for å simulere effekten av en GSK-3β hemming
in vivo
, vi brukte en modifisert chick chorioallantoic membran ( CAM) modell [25]. SB216763 ble injisert inn i en CAM-vene tillater systemisk spredning av forbindelsen i kylling embryo-CAM-system. Effektene av SB216763 på innpodet tumornoduler ble overvåket etter 48 timer med immunhistokjemi. I motsetning til de
in vitro
observasjoner ikke bare c4-2 men også LNCaP uttrykte høye nivåer av atom AR
in vivo plakater (nuclear AR: LNCaP: 74,6 ± 25,8%, c4-2: 63,4 ± 10%). Følgende SB216763 behandling atom AR nivåer i c4-2 celler ble redusert med 57% 63,3 til 27,1% etter 48 timer (fig. 8, Tabell 1). Nuclear AR-nivåer i LNCaP forble nesten upåvirket av SB216763 (LNCaP: ubehandlet 74,6 ± 25,8%, SB216763-behandlet 76,5 ± 18%) (Tabell 3). Prosentandelen av PSA-positive celler var høyere i c4-2-cellelinje sammenlignet med foreldre LNCaP-cellelinjen (% av cellene farging for PSA: LNCaP 3 ± 3,3% vs. c4-2 16,8 ± 10,6%), noe som tyder på at den AR i c4-2 er aktiv. Parallelt reduksjon av atom AR i c4-2 Etter SB216763 behandling av en nedgang i PSA-positive celler (ubehandlet c4-2: 16,8 ± 10,6% versus 3,8 ± 4,7% i SB216763 behandlet c4-2). (Fig 8, Tabell 3).
CAM-testen ble utført med c4-2 celler. Deretter ble nukleær lokalisering av AR og intracellulære PSA fordeling i ubehandlede og SB216763-behandlede tumorknuter (forstørrelse 400x) utført som beskrevet i Materialer og Metoder. AR-positive celler er merket med stjerner.
Diskusjoner
I vestlige industrialiserte land, presenterer PC et alvorlig helseproblem og er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos eldre menn. Selv om PC-en er svært heterogen i sin etiologi, er androgen signale et sentralt element i utvikling og progresjon av PC. I første omgang PC cellene er i stor grad avhengig androgener for vekst og overlevelse. Som en konsekvens, endokrin terapi som involverer androgen uttømming av kirurgisk eller medisinsk kastrering, samt blokade av androgen-reseptoren med anti-androgener, har blitt en standard behandling for fremskreden eller metastatisk sykdom. Imidlertid er fordelen fra endokrine behandling av avansert PC bare forbigående. Innenfor en periode på rundt to år, nesten alle prostatakreft utvikle seg til en kastrering-resistent tilstand av sykdommen der de ikke lenger svare på vanlige endokrine terapi. I det siste har det vært en teori om at staten CRPC skyldtes en klonal utvalg av AR-negative celler. Denne antakelsen ble i hovedsak basert på Dunning rottetumormodell hvor utviklingen av en androgen-ufølsom tilstand er knyttet til tapet av AR i tumorceller i løpet av androgen tilbaketrekning. Imidlertid kliniske studier viste at AR er sjeldent tapt, men blir ofte økt i CRPC tumorprøver og deres metastaser [5], [6], [34], [35]. Det faktum at ved fravær av androgene stimuli mange av de samme genene som er økt med androgener i androgen-avhengige PC bli forhøyet i CRPC støtter oppfatningen av konstitutivt aktive AR-proteiner i CRPC celler [36]. Denne hypotesen støttes også av den observasjon at en forstyrrelse av AR funksjon hemmer spredning av CRPC celler dyrket i fravær av androgener [37].
I denne rapporten har vi brukt AR-positive LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR som begge er kjent for å vokse og overleve under androgen-belastede forhold som
in vitro
tumormodell for CRPC [21], [20]. Vi var i stand til å vise at, i motsetning til androgen-avhengige paren LNCaP-celler, kastrerings-resistente underlinjer LnCap c4-2 og LNCaR-SSR viste høye nivåer av AR og PSA når dyrket i fravær av androgener. Mest interessant, var økningen i intracellulær AR protein nivåer Parallelt med en økning i GSK-3β, en allestedsnærværende serin treonin kinase vist seg å være en viktig modulator av AR stabilitet
in vitro product: [32], [27]. Selv i øyeblikket kan vi ikke si at feilregulering av GSK-3P nivåer er ansvarlig for tendensen til PC celler til å øke intracellulære AR-nivåer samtidig blir kastrering motstandsdyktig, vår
in vitro
observasjoner er i tråd med en fersk klinisk studie som viser en opphopning av GSK-3β i celler i kastreringsresistent svulster [38]. Påvisningen av høye intracellulære PSA-nivåer i c4-2 og LNCaP-SSR blottet for androgene stimuli antyder at AR er funksjonelt aktiv i disse celler, selv under androgen- belastede betingelser.
For å generere genomiske signalene, blir AR har til å bli transportert inn i kjernen. I denne studien ble AR funnet å være overveiende atom i LNCaP-SSR celler og c4-2 celler i fravær av androgener. Årsaken til androgen-uavhengig atom opphopning av full-lengde AR i CRPC celler forblir i stor grad ukjent. Under normale forhold atomtrans av AR øker dramatisk på hormone binding som demonstrerte for LNCaP. Nyere funn tyder på at, for å trenge inn i kjernen, har AR til å gjennomgå en intra-molekylær konformasjon endring som bringer den N- og C-termini av molekylet inn i tett nærhet. Denne intramolekylære konformasjonsendring som tillater aktivering og nukleær translokasjon av en AR-monomer, før AR dimerisasjon, vanligvis indusert av ligandbinding og bare forekommer i levende celler, ikke i cellelysater [39], [40], som tyder på at denne intra-molekylær omorganisering av AR er ikke protein-autonome, men er avhengig av cellulære faktorer. For å teste denne hypotese, vi deretter transfektert c4-2 og LNCaP-celler med en ekspresjonskonstruksjon som koder for en villtype AR kondensert til en grønn Eos fluorescerende protein (EosFP) [41]. I nærvær av DHT AR-EosFP kunne påvises i kjernen av både LNCaP og c4-2. Når dyrket i fravær av DHT, AR-EosFP var bare påvises i kjernen av kastrerings-resistente c4-2-celler, men ikke i kjernen av androgen-avhengige LNCaP-celler. Denne observasjonen er i overensstemmelse med et tilsvarende eksperiment som viser en robust nukleær lokalisering av et GFP-merket AR transfektert inn i c4-2-celler [42]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at den kjernefysiske lokalisering av full-lengde AR i CRPC ikke nødvendigvis krever hormone binding og kan i stedet reguleres av andre faktorer.
Som nylig vist av vår gruppe, kortsiktige hemming av serin /treonin kinase GSK-3β av små molekyl hemmere induserte en rask, CRM1 avhengig nucleocytoplasmic skyt av AR i androgen-behandlede celler [19]. Som GSK-3β er overuttrykt i CRPC celler
in vivo og in vitro
, vi antatt at enzymet kan også være en del av en antatt proteinkompleks som er involvert i den kjernefysiske akkumulering av AR. Denne hypotese støttes av en tidligere funn som viser at GSK-3β er sterkt fosforylert på tyrosin 216 (Y216), aktivering funksjon av enzymet, i c4-2-celler [30]. Økningen av GSK-3β
Y216 fosforylering i LNCaP-celler etter behandling DHT (fig. 2) antyder dessuten en viktig rolle for GSK-3β i AR-signalering under normale forhold. I et forsøk på å forstyrre den dominerende nukleær lokalisering av AR i CRPC celler, vi behandlet kastrering bestandig c4-2 og LNCaP-SSR, så vel som den paren LNCaP med maleimid SB216763. Denne svært potent forbindelsen er kjent for å inhibere intramolekylær tyrosinkinase-aktivitet av GSK-3β molekyl, hvor sistnevnte er ansvarlig for dens autofosforylering ved Y216 [33]. Som vist i figur 2, er GSK-3β inhibitor SB216763 stand til å redusere Y216-fosforylering av GSK-3β i LNCaP så vel som i c4-2 celler. Etter behandling med SB216763, atom opphopning av AR i castration- resistente LNCaP underlinjer c4-2 og LNCaP-SSR ble dramatisk redusert i nærvær, og viktigst i fravær, av DHT, som er størst i c4-2 celler (Tabell 2). Nucleocytoplasmic skyt av AR etter GSK-3β-inhibering i c4-2-celler dyrket i fravær av DHT kan bli reversert ved leptomycin B (LMB), noe som tyder på en CRM1 avhengig eksport mekanisme (fig. 5). I en tidligere studie identifiserte vi en CRM1 bindingssete i C-enden av AR [19]. På grunn av sin nærhet til ligand binding domene, hypotese vi at hormone binding kunne regulere tilgjengeligheten av CRM1 bindingssetet, og dermed moduleratom eksport av AR. Observasjonen at AR kan eksporteres fra kjernen av CRPC celler som vokser i fravær av androgener er et viktig nytt funn, tydelig viser at den kjernefysiske eksport av AR følgende GSK-3β hemming er ikke på grunn av en modulering av hormonbindende egenskaper av reseptoren.
faktum at korttids hemming av GSK-3β (maks. 4 timer) fører til en hurtig eksport av AR fikk oss til å analysere effektene av en langvarig inhibering av enzymet i AR -positive CRPC-celler. Stanse av GSK-3β med bestemte shRNA førte til en utarming av atom AR i c4-2 celler. Nuclear uttømming av AR-protein var mindre uttalt i c4-2-celler dyrket i nærvær av det AR-stabiliserende hormonet DHT. Selv om disse funnene støtter antagelsen om at hemming av GSK-3β utløser nucleocytoplasmic skyt av AR, må dataene stammer fra de langsiktige shRNA-eksperimenter tolkes med forsiktighet. Kortsiktig hemming av GSK-3β aktivitet av små molekyler som SB216763 ble gjentatte ganger vist seg å indusere en rask, CRM1 avhengig atom eksport av AR i PC-celler [19], [32]. I motsetning til disse resultatene, den langsiktige hemming av GSK-3β forårsaket en proteasomal nedbrytning av AR-protein [32]. Fordi GSK-3β utløser AR lokalisering samt AR stabilitet, hypoteser vi at den dramatiske uttømming av atom AR i c4-2 celler etter GSK-3β lyddemping er på grunn av en kombinasjon av kjernefysisk eksport og proteasomal nedbrytning av reseptormolekylet.
det faktum at hemming av GSK-3β påvirker AR funksjon samt AR stabilitet bedt oss om å analysere virkningene av en GSK-3β hemming på spredning av PC celler
in vitro
. Respons på behandling av PC-celler med SB216763 var sterkest i AR-positive CRPC celler (hemming av cellevekst: c4-2 LNCaP-SSR LNCaP PC3). Evnen til SB216763 til å inhibere cellulær proliferasjon ble stadig av dets evne til å indusere en CRM1 avhengig eksport av AR i PC-celler.
For å teste effekten av GSK-3P-inhibitorer som potensielle terapeutiske midler, vi utvidet våre studier til en CAM-xenograft modell. Til vår overraskelse AR var overveiende atom i LNCaP xenografter samt i c4-2 xenografter. En mulig forklaring på dette kan være produksjonen av androgener hos vertsorganismen. Videre er AR av LNCaP og dets derivater som bærer en punktmutasjon (T877A) som fører til en promiskuøse AR som kan, i det minste delvis, bli aktivert av en rekke ikke-androgene steroider [43], [44]. Likevel, AR av c4-2 i forhold til AR av foreldre LNCaP er mer aktiv i CAM-Xenotransplantat modell, som dokumentert av intracellulære PSA nivåer (celler positive for PSA: LNCaP 3,1% og c4-2 16,8% ). Etter en 48-timers behandling med SB216763, ble atom AR nivåer av c4-2 celler betydelig redusert, noe som ble parallelt med en betydelig reduksjon i intracellulære PSA nivåer. I motsetning til resultatene i c4-2 celler effektene på AR og PSA i LNCaP cellene forble ubetydelig.
Til sammen vår studie viser at (1) overekspresjon av AR i CpRC celler er parallell med en økning i intracellulær GSK-3β, (2) effektene av GSK-3β for AR-signalering er ikke skyldes en modulasjon av DHT binding til AR, (3) kjerne akkumulering av AR i CRPC celler er ikke en autonom funksjon av en mutert AR reseptor men er mediert av deregulerte cellulære faktorer, slik som GSK-3β, (4) GSK-3β og CRM1 er en del av en antatt kompleks regulering av nukleære lokaliserings av AR i CRPC celler, og (5) hemming av GSK-3β aktivitet etter lavmolekylære inhibitorer induserer en rask atom eksport av AR i CRPC celler
in vitro Hotell og
in vivo
dermed moduler AR signalering.
avhengigheten av CRPC på transkripsjonelt aktiv AR har resurged interesse i å utvikle hemmere rettet mot AR eller androgen aksen. Neste generasjon hormonterapier erkjenner det faktum at i CRPC AR kan aktiveres ved iboende produksjon av vev androgener, så vel som ved peptid vekstfaktorer. Blant hormonelle midler nå testes er CYP17 hemmere som abirateron, TAK-700 og TOK-001 eller andre generasjon anti-androgen MDV-3100 [45]. Lavmolekylære inhibitorer som EPI-001 og sintokamide målrettet mot trans domene ved N-terminalen av AR har vist oppmuntrende resultater in vitro, så vel som i eksperimentelle dyremodeller [46], [47].
