Abstract
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall afflicting USA hanner. De fleste behandlinger to-date for metastatisk PCa inkluderer androgen-deprivasjon terapi og andre generasjons anti-androgener som abirateronacetat og enzalutamide. Men et flertall av pasientene etter hvert utvikle resistens mot disse terapi og tilbakefall til den dødelige, kastrering-resistent form av PCa som ingen adekvat behandlingsalternativ gjenstår. Det er derfor et umiddelbart behov for å utvikle effektive terapeutiske midler mot denne pasientgruppen. Imidazopyridiner har nylig blitt vist å ha Akt-kinase-hemmende aktivitet; derfor i denne studien undersøkte vi den hemmende effekten av nye imidazopyridine derivater HIMP, M-mei, OMP, og EtOP på ulike menneskekastreringsresistent PCA celler. Blant disse forbindelser, ble HIMP og M-Mel funnet å ha selektiv dose- og tidsavhengig vekst-inhibering: de reduserte kastrering-resistente PCa celleproliferasjon og spart godartet prostata epitelceller. Ved hjelp av LNCaP C-81-celler som modellsystemet er disse forbindelsene også redusert kolonidannelse samt celle adhesjon og migrering, og M-Mel var den mest potente i alle studier. Videre undersøkelser viste at mens HIMP primært hemmer PCa cellevekst via hemming av PI3K /Akt signalveien, kan M-Mel hemme både PI3K /Akt og androgen reseptor stier og arrestere cellevekst i G2-fasen. Således våre resultater indikerer den nye forbindelsen M-Mel for å være en lovende kandidat for kastrering-resistente PCa terapi, og fremtidige studier som undersøker mekanismen av imidazopyridin-inhibering kan bidra til utvikling av effektive anti-PCA midler.
Citation: Ingersoll MA, Lyons AS, Muniyan S, D’Cunha N, Robinson T, Hoelting K, et al. (2015) Nye imidazopyridine derivater har anti-tumor effekt på menneskers Kastrering resistent prostatakreft celler. PLoS ONE 10 (6): e0131811. doi: 10,1371 /journal.pone.0131811
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 10 februar 2015; Godkjent: 07.06.2015; Publisert: 29 juni 2015
Copyright: © 2015 Ingersoll et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Cancer Institute, National Institutes of Health [CA88184 (MFL), CA138791 (SKB)], Department of Defense PCa opplæring Grants [PC094594 (MFL), PC121645 (MFL)], og University of Nebraska Medical Center Bridge Fund (MFL). Cellesyklus analyse ble utført på UNMC flowcytometrisystemer Kjerne Facility delvis støttet av UNMC Eppley Cancer Center tilskuddet [CA036727] (Ken Cowan). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er fortsatt den vanligste diagnosen solid svulst og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA menn, opprettholde et behov for nye effektive behandlingstilbud [1]. Foreløpig androgen-deprivasjon terapi (ADT) er standard løpet av behandling for metastatisk PCA men de fleste PCA pasienter tilbakefall innen 1-3 år og utvikle kastrering-resistente (CR) PCa som ikke svarer til ADT [2,3,4 ]. I 2004 ble en kombinasjon av docetaxel og prednison vist å øke pasient median overlevelse etter 2-3 måneder, og er den standard-of-care behandling for CR PCa [5]. Nylig, FDA har godkjent ytterligere forbindelser som roman taxan kjemoterapeutisk cabazitaxel [6], androgen syntese inhibitor abirateronacetat [7], AR signale inhibitor enzalutamide [8], immunterapeutiske sipuleucel-T [9], og bein mikro-miljø-målrettede radiofarmaka Alpharadin (radium-223) for behandling av CR PCa [10]. Men disse behandlingsalternativene er bare i stand til å forlenge overlevelsen av noen få måneder og gjennomsnittlig periode på CR PCa pasient overlevelse er fortsatt mindre enn to år [11]. Til tross for fremskritt i post-ADT behandlingsstrategier, CR PCa fortsatt en uhelbredelig sykdom; derfor er det et stort behov for alternative behandlingsalternativene
Mens androgen insensitivitet kan manifesteres på flere måter.; en foreslått alternativ mekanisme er den økte aktivering av Akt signalering i henhold til androgen belastede betingelser. Akt er kjent for å regulere cellesyklus, metabolisme, angiogenese, og celleoverlevelse i PCa og dens aktivering kan bidra til tumorresistens til ADT og anti-androgener [12,13]. En mekanisme gjennom hvilken Akt kan bidra til PCa overlevelsesevne er via modulering av androgenreseptoren (AR) signalering. I tillegg til å indusere cellevekst, har AR også en rolle i regulering av apoptose. Ved fosforylering av AR i Ser-210 og Ser-790 av Akt, AR-mediert apoptose undertrykket. Gjennom denne mekanismen, kan forbedret Akt-aktivitet ved PCA bidra til PCa overlevelsesevne på ADT [13]. Faktisk kan genetiske tap og /eller mutasjoner i den fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) /Akt vei som fører til signal deregulering stede i opp til 42% av primære prostatakreft og over 90% av metastatiske tumorer, noe som gjør det til en prioritet neste -in-line terapeutisk mål [14]. Nylig har undersøkelser i imidazopyridiner, en ny klasse av forbindelser som inneholder aromatiske aldehyder og en pyridin-gruppe, har vist disse forbindelser utviser potent Akt-kinase-hemmende aktivitet [15-17]. Dataene viser disse forbindelser har en anti-proliferativ effekt mot CR PCA-celler med evnen til samtidig å hemme AR og PI3K /Akt /mTOR signalveier, noe som gjør dem lovende terapeutiske midler [18].
For å undersøke effekten imidazopyridiner « for PCa terapi, den LNCaP progressive celle modell, opprinnelig karakterisert Lin et. al.
JBC
1998, ble brukt som den primære cellemodellen i denne studien. LNCaP C-81 celler er androgen-uavhengig (AI), uttrykker prostataspesifikt antigen (PSA) i fravær av androgener, og få muligheten til å syntetisere testosteron fra kolesterol i henhold steroid-redusert (SR) forhold [19-22]. C-81 cellene også har forbedret spredning, evne til å danne kolonier, og vandrende potensielle [21,23]. Viktigst, LNCaP C-81 celler beholde AR uttrykk og tilsvarer uttrykk for AR i de fleste PCa samt avanserte CR PCa [19]. Dette gjør dem til et overordnet celle modell for terapeutiske studier sammenlignet med mange andre PCA cellelinjer. Andre cellelinjer som er valgt for denne studien omfatter MDA PCa2b-AI, PC-3, og RWPE1. Ved passering, MDA PCa2b cellene oppfører seg på samme måte som LNCaP celler og skifte fra androgen-sensitive (AS) ved lav passasje til AI på høy passering. MDA PCa2b-AI (MDA-AI) celler også beholde AR uttrykk og ha forbedret tumorgenicity; dette gjør MDA-AI og LNCaP C-81 foretcellemodeller for å studere prostata adenokarsinom. Videre, på grunn av evnen til imidazopyridin-derivater for påvirkning både Akt og AR veier, er det klokt å undersøke forbindelsene «virkninger på AR-negative PC-3-celler for å bestemme deres effekt på celler som mangler klassiske androgen signaleringsmekanismer. I tillegg, PC-3 cellelinjer er mer representative for små-celle nevroendokrine carcinom enn mer klinisk dominerende adenokarsinom [24]; derfor denne cellelinjen skal brukes i forbindelse med modeller som LnCap og MDA PCa2b cellelinjer for å utvide klinisk anvendelighet. Til slutt, udødelig godartet prostata epitel-celler RWPE1 fungere som en kontroll for å måle selektiviteten av imidazopyridin avledede forbindelser. Således våre cellemodeller representerer tydelig de fleste molekylære hendelser som ble observert i kliniske implementeringer av moderne PCA terapi.
Våre resultater viser disse imidazopyridin-derivater er i stand til å undertrykke human PCa celleproliferasjon i en dose- og tidsavhengig måte. Viktigere, forbindelse M-MeI viste selektiv effekt mot CR PCa celleproliferasjon sammenlignet med benigne prostata epitelceller. Videre er denne forbindelse ble også funnet å hemme cellemigrering, adhesjon, og
in vitro
tumorgenisitet. Våre data er den første til å demonstrere anti-tumor effekt av romanen imidazopyridine derivater HIMP, M-mei, OMP, og EtOP på CR PCA celler og indikerer M-mei å være en lovende føre terapeutisk middel for fremtidige studier.
Materialer og metoder
Material
RPMI 1640 medium, keratinocyte SFM medium, gentamicin, og L-glutamin ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Føtalt bovint serum (FBS) og kull-behandlet FBS ble hentet fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Molecular biology-grade agarose ble anskaffet fra Fisher Biotech (Fair Lawn, NJ). Proteinmolekylvektstandard markører, akrylamid, og Bradford proteinanalysesett ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Polyklonale antistoffer (ABS) som gjenkjenner alle tre isoformer av SHC protein (# 29 807, 1: 4000) ble innkjøpt fra Upstate (Lake Placid, NY). Anti-AR (# C1411, 1: 400), anti-cyclin B
1 (# K1907, 1: 1000), anti-cyclin D
1 (# A2712, 1: 1000), anti-Bcl
XL (# F111, 1: 1000), anti-Bax (# G241, 1: 1000), anti-PCNA (# G261, 1: 3000), anti-p53 (# K2607, 1: 1000), anti- PSA (# E1812, 1: 2000), anti-survivin (# C271, 1: 2000), og pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus (# C2011, 1: 5000), anti-kanin (# D2910, 1: 5000) , anti-geit (# J0608, 1: 5000) IgG Abs ble alle oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-fosfo-Akt (Ser473) (# GA160, 1: 1000), anti-Akt (# C1411, 1: 2000), anti-fosfo-Stat5 (Y694) (# 9351S, 1: 4000), og anti-Stat5 (# 9363, 1: 2000) Abs var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-β-aktin (# 99H4842, 1: 10000) Abs og 5α-dihydrotestosteron (DHT) ble anskaffet fra Sigma (St. Louis, MO). Imidazopyridin-derivater HIMP (3-fenyl-1- (pyridin-2-yl) imidazo [1,5-
en
] pyridin), M-Mel (1- (pyridin-2-yl) -3- (
m
tolyl) imidazo [1,5-
en
] pyridin), OMP (1- (pyridin-2-yl) -3 – (
o
-tolyl) imidazo [1,5-
en
] pyridin), og EtOP (3- (4-etoksyfenyl) -1- (pyridin-2-yl) imidazo [1,5-
en
] pyridin) ble syntetisert og tilveiebragt av dr Xiu Bu, som tidligere beskrevet [18,25], og deres strukturer er vist i figur 1. for å lette lesing, kjemiske forkortelser er brukt gjennom hele teksten.
HIMP, 3-fenyl-1- (pyridin-2-yl) imidazo [1,5-
en
] pyridin; M-Mei, 1- (pyridin-2-yl) -3 – (
m
tolyl) imidazo [1,5-
en
] pyridin; OMP, 1- (pyridin-2-yl) -3 – (
o
-tolyl) -imidazo [1,5-
en
] pyridin; EtOP, 3- (4-etoksyfenyl) -1- (pyridin-2-yl) imidazo [1,5-
en
] pyridin.
Cell Culture
human prostata carcinoma-cellelinjer LnCap, MDA PCa2b, PC-3, og udødeliggjorte benign prostata epitelceller RWPE1 celler ble opprinnelig erholdt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). LnCap og PC-3-celler ble rutinemessig holdt i RPMI 1640 medium inneholdende 5% FBS, 2 mM glutamin og 50 ug /ml gentamicin [19,21]. MDA PCa2b celler ble opprettholdt i BRFF-HPC1 medium inneholdende 20% FBS, 2 mM glutamin og 50 ug /ml gentamicin [26,27]. Som rapportert tidligere, ble LNCaP progressive cellemodell etablert der LNCaP celler ved eller under passasjen 33 er utpekt som C-33 og de på eller større enn passasje 81 som C-81. Mens C-33-celler er sensitive overfor androgen-indusert vekst, C-81 celler er AI, uttrykker høyere basalnivåer av PSA, og få muligheten til å syntetisere testosteron fra kolesterol [19-22]. Ligner på LNCaP modellen, ved passering, MDAPCa2b celler blir AI og har mange biokjemiske egenskaper av klinisk CR PCA inkludert uttrykk for funksjonell AR, PSA sekresjon, og rask celledeling i androgen-belastede forhold [19,21,22,27 , 28]. RWPE1 celler ble dyrket i keratinocytt-SFM supplert med bovint hypofyseekstrakt (25 ug /ml) og rekombinant epidermal vekstfaktor (0,15 ng /ml) sammen med 50 ug /ml gentamicin.
For å etterligne betingelsene for klinisk ADT ble cellene opprettholdt i SR forhold, dvs., fenolrødt-fritt RPMI 1640-medium inneholdende 5% trekull /dekstran-behandlede FBS, 2 mM glutamin og 50 ug /ml gentamicin plus 1 nM DHT. Imidazopyridin-derivater HIMP, M-mei, OMP, og EtOP ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved 20 mM stamkonsentrasjoner, lagret ved -20 ° C og fortynnet etter behov for eksperimentelle betingelsene i det respektive medium.
celle proliferasjonsanalyser
for celleproliferasjonsprosesser forsøk i henhold til vanlige forhold, ble LnCap C-81 og MDA PCa2b-AI-celler sådd i vanlig kulturmedium og tillatt å vokse i 3 dager, deretter forandret til medium inneholdende den respektive forbindelse, og dyrket i ytterligere 3 dager. For å bestemme celle-proliferasjon i henhold SR betingelser, LNCaP C-81, MDA PCa2b-AI, PC-3, og RWPE1 celler ble sådd i vanlige forhold, og tillatt å vokse i 3 dager. Cellene ble deretter steroid sultet i 48 timer i SR medium og endret til friskt medium inneholdende SR den respektive forbindelse, og deretter dyrket i ytterligere 3 dager. Kontrollgrupper fikk løsemiddel DMSO alene. På det angitte tidspunktet, ble cellene trypsinert og levende celle tall ble talt opp via trypanblått Utelukkelse analyse ved hjelp av en Cellometer Auto T4 bildebasert celleteller (Nexcelom, MA, USA).
Cell Vekst Kinetic og Dosering avgjørelser
doseavhengig analyser ble utført på LNCaP C-81-celler på samme måte som cellen proliferasjonsanalyser og brukt medium inneholdende 0, 1, 5, eller 10 uM av angitte forbindelse. For å bestemme de kinetiske effekten av HIMP og M-Mel på veksten av LNCaP C-81-celler, ble cellene sådd ut i seks-brønners kulturplater ved en tetthet på 2 x 10
3 celler /cm
2 og opprettholdt i vanlige dyrkingsbetingelser i 3 dager. Cellene ble deretter endret til SR medium og holdes i 2 dager. En plate av festede celler ble høstet og tellet som dag 0, og de gjenværende celler ble endret til deres respektive behandlingsmediet: kontroll (DMSO), HIMP, og M-Mel (10 uM). På hvert tidspunkt ble cellene høstet for telling celle nummer, og de gjenværende celler ble matet med friskt medium inneholdende respektive behandlingsforbindelsen. Etter celle nummer telling, ble cellelysater forberedt for Western blot analyse.
flowcytometrisystemer Analysis
For å bestemme forbindelsens effekt på cellesyklus, LNCaP C-81 celler ble sådd i T25 kolber på en tetthet på 2 x 10
3 celler /cm
2 i vanlig medium i 3 dager, ble endret til SR medium i 48 timer, og deretter matet med friskt SR medium inneholdende 10 uM av angitte forbindelse. Ett sett av celler ble høstet etter 3, 5 og 7 dager etter henholdsvis behandling, ved trypsinering. Etter celleantall telling, ble en aliquot av celler pelletert ved sentrifugering, resuspendert i 70% etanol, og inkubert ved 4 ° C i 30 minutter, deretter vasket med PBS og spunnet ned igjen ved sentrifugering. DNA fra etanol-fikserte celler ble farget ved bruk av Telford Reagent (PBS, pH 7,4, inneholdende 0,1% Triton X-100, 0,1 mM EDTA dinatriumsalt, 0,05 mg /ml RNase A (50 U /mg), og 50 mg /ml propidiumiodid) ved 4 ° C i 4 timer [29]. Bestemmelse av cellesyklus distribusjon ble utført ved hjelp av en Becton Dickinson fluorescens-aktivert celle sorter (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ved UNMC flowcytometrisystemer Kjerne Facility.
celleadhesjonsanalyse
for å bestemme effekten av imidazopyridin-derivater på PCa celle adhesjon til plastikk-ware flater, ble LNCaP C-81-celler suspendert i 5% FBS 1640 RPMI-medium inneholdende 10 uM av respektive forbindelser og inkubert i 30 minutter. Cellene ble deretter sådd ut i 6-brønns plater in triplo i en tetthet på 3×10
3 celler /cm
2 i respektive behandlingsmedium og inkubert i en ytterligere time. Ikke-festede celler ble omhyggelig vasket vekk, og de gjenværende festede celler ble farget med 0,2% krystallfiolett oppløsning inneholdende 50% metanol. Det totale antall celler i fem felt på 40x forstørrelse per brønn ble talt opp.
klonogene og Soft Agar kolonidannelse Analyser
klonogene cellevekst analyse på overflaten av plast-varer ble gjennomført som beskrevet tidligere [23,26]. Kort sagt ble LNCaP C-81-celler sådd ut i 6-brønns plater i henhold til vanlige kulturbetingelser ved tre densiteter: 20, 200, og 2000 celler per brønn. Celler ble inkubert over natten, hvoretter ufestede celler ble fjernet og de tilknyttede celler ble matet med friskt vanlig medium inneholdende 10 uM av behandlingsforbindelsen. Celler ble dyrket i 9 dager ved en endring av friskt medium hver tredje dag. På 10
th dag ble mediet fjernet og cellene ble vasket med is-kald HEPES-bufret saltvann, ble deretter festet celler farget med en 0,2% krystallfiolett oppløsning inneholdende 50% metanol. Forsøket ble utført i duplikat.
Effekten av imidazopyridin-derivater på forankrings-uavhengig vekst av LNCaP C-81-celler ble bestemt ved soft agar assay. I korthet, 5×10
4 celler ble sådd inn i en 0,25% agarose topplaget med et basislag inneholdende 0,3% agarose i 6-brønns plater. Dagen etter såing, ble cellegrupper som inneholder mer enn en celle ekskludert fra studien. Cellene ble deretter matet med 0,5 ml friskt medium inneholdende vanlige den respektive forbindelse hver 3. dag i 4 uker. Etter forsøksperioden, ble kolonier farget med en 0,2% krystallfiolett løsning som inneholder 50% metanol og telles.
Cell Migration analysen
For å bestemme effekten av imidazopyridine derivater på PCa celle mobilitet, LNCaP C-81 cellemigrasjon ble vurdert gjennom Boyden kammeret analysen. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler inn i det øvre kammer av 24-brønners plate Transwell innsatser. Medium inneholdende 10 uM av behandlingsforbindelsen (løsningsmiddel alene for kontroll) ble plassert i både øvre og nedre kammere for transwells. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer, hvoretter de ble farget med 0,2% krystallfiolett oppløsning i 50% metanol, og celler som er igjen i det øvre kammer ble fjernet via bomullspinne. Cellene som hadde migrert inn i det nedre kammer ble tellet ved 40 gangers forstørrelse under et mikroskop.
immunoblotanalyse
Alle celler ble skylt med iskald HEPES-bufret saltvann, pH 7,0, høstes via skraping, og lysert i iskald lyseringsbuffer inneholdende protease og fosfatase-inhibitorer. Totale cellulære lysater ble fremstilt som tidligere beskrevet [19,30]. Proteinkonsentrasjonen til supernatanten ble bestemt ved anvendelse av en Bio-Rad Bradford proteinanalyse. For immunoblotting ble en aliquot av den totale cellelysat elektroforese på SDS-polyakrylamidgeler (7,5% -12%). Etter å ha blitt overført til nitrocellulosemembran, ble membranene blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween-20 i 30 minutter ved romtemperatur. Membraner ble inkubert med den tilsvarende primær Ab over natten ved 4 ° C. Membranene ble deretter renset og inkubert med de passende sekundære Ab i 60 minutter ved romtemperatur. Proteiner av interesse ble påvist ved en forsterket kjemiluminescens (ECL) reagenssett og β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
Statistical Analysis
Hvert sett av eksperimenter ble utført i duplikat eller triplikat så er angitt i figuren sagn, og forsøkene ble gjentatt uavhengig av hverandre minst to eller tre ganger. De midlere og standard-feilverdiene for alle resultatene ble beregnet og to-halet Student-t-test ble anvendt for å bestemme signifikans av resultater.
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
doseavhengig effekt av imidazopyridine Derivater på CR PCa celleproliferasjon
LNCaP C-81. cellene oppviser mange biokjemiske egenskaper som vist i klinisk CR PCa, inkludert funksjonell AR uttrykk, AI PSA sekresjon, og proliferasjon med vekstregulering intracrine [19,21-23] og derved ble brukt som den primære celle modellsystem for å teste imidazopyridiner Imidazopyridinforbindelser. I første omgang ble de doseavhengige effekter av HIMP, M-Mei, OMP, og EtOP på LNCaP C-81 celler testet under vanlige dyrkningsforhold. Celler ble behandlet med 0-10 pM av hver forbindelse i 72 timer og cellevekst ble analysert via trypanblått eksklusjon assay. Under vanlige dyrkningsbetingelser, ble dose-avhengig inhibering av cellevekst observert for alle forbindelser med beregnede IC
50 verdier på 6,1 pM (M-Mei), 6.6 um (EtOP), 7,3 mM (OMP) og 9,3 um ( HIMP) (figur 2A).
(A) Dosering effekt av imidazopyridine derivater på LNCaP C-81 celler. Celler ble sådd ut i seks-brønners plater ved 2 x 10
3 celler /cm
2 i vanlig medium og dyrket i 72 timer. Ett sett av celler ble deretter matet med friskt medium inneholdende vanlige 0,1,5, eller 10 uM imidazopyridin-derivater med løsningsmiddel alene for kontroll og dyrkes i ytterligere 72 timer. Et annet sett av celler ble først steroid sultet i SR medium i 48 timer og deretter behandlet med respektive forbindelser i friske SR medium inneholdende 1 nM DHT i 72 timer. Alle celler ble trypsinert og levende celle tall ble talt opp. Forsøket ble gjennomført i to brønner med 3 sett av uavhengige eksperimenter. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SE; n = 2×3. *
p
0,05 **
p
0,005 ***
p
0,0005. (B) Effekten av imidazopyridin-derivater på veksten av forskjellige PCA-celler og udødelig prostata epitelceller. Alle celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved den kjente tetthet i sitt respektive medium i tre dager, steroid-sultet i to dager, deretter matet med friskt SR medium med 1 nM DHT inneholdende 10 pM imidazopyridin-derivater og dyrket i ytterligere tre dager. Cellene ble trypsinert og levende celle nummer ble regnet. LNCaP C-81-2 x 10
3 celler /cm
2, MDA PCab2b AI-3 x 10
3 celler /cm
2, PC-3-2 x 10
3 celler /cm
2, RWPEI- 7.5 x10
3 celler /cm
2. Alle forsøkene ble utført på triplikate brønner med 3 sett av uavhengige eksperimenter. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SE; n = 3×3. *
p
0,05; **
p
0,001; ***
p
. 0,0001
Vi undersøkte deretter effekten av forbindelsene i SR forhold, hermet ADT forhold. Forbindelsene hemmet cellevekst følger doseringen respons med anslått IC
50 verdier av 10,2 um (M-mei), 10,5 um (OMP), 11,6 um (HIMP) og 16,0 um (EtOP) (figur 2A). Interessant, M-Mel hadde den største inhibitoriske aktivitet under begge vekstbetingelser. Selv EtOP hadde sammenlignbare hemming til M-mei i vanlige forhold, det hadde minst effekt under SR forhold. HIMP og OMP ble også vist seg å være mindre effektive enn M-mei under begge behandlingsforhold.
Selektiv Anti-proliferativ effekt av forbindelser på PCa vs. udødelig Normal Prostata Epitelceller
undertrykkende effekt av hver inhibitor av proliferasjon ble undersøkt ved anvendelse av et panel av cancerøse og benigne epiteliale prostatacellelinjer. AI PCA celler inkludert AR-positive LNCaP C-81 og MDA PCa2b-AI samt AR-negative PC-3 celler ble valgt som representanter for avansert CR PCa. RWPE1-celler, en udødeliggjort godartet prostata epitel cellelinje, ble benyttet for å bestemme forbindelsens selektivitet. Etter tre dager med 10 uM behandling i henhold til SR tilstander, HIMP, M-Mel, og EtOP alle viste selektiv hemming av proliferasjon av kreftceller med vesentlig mindre effekt på ikke-kreft RWPE1 celler (figur 2B). Selv om OMP var effektive mot C-81 og PC-3-celler, var det forholdsvis kraftig mot RWPE1 celler. Samlet viser resultatene HIMP og M-Mel var den mest selektive, begrenser PCa cellevekst betydelig mer enn RWPE1 celler med M-mei vise større hemming i alle cellelinjer analysert.
Undertrykkelse av PCa tumorigenitet av imidazopyridine Derivater
forbindelsene enes evne til å undertrykke kolonidannelse i LNCaP C-81-celler ble opprinnelig vist ved in vitro klonogene analyser for forankringsavhengig cellevekst. LNCaP C-81-celler ble sådd med 20, 200, og 2000 celler per brønn i 6-brønners plater, og deretter behandlet med 10 uM av hver forbindelse. Ved 10-dagers behandling, alle forbindelser som i betydelig grad hemmet klonogene vekst ved 2000 celler per brønn, som vist i figur 3A for 2000 celler per brønn. Mens M-Mel og EtOP sterkt hemmet kolonivekst, HIMP og OMP var relativt mindre potent. Minimal kolonidannelse ble observert med en tetthet på 20 og 200 celler per brønn.
(A) klonogene analyse på og plast. LNCaP C-81-celler ble sådd ut i seks-brønns plater i tettheter på 20, 200, og 2000 celler /brønn. Etter 24 timer ble festet celler behandlet med respektive forbindelser 10 pM konsentrasjoner av imidazopyridin-derivater eller oppløsningsmiddel alene som kontroll. Celler ble tilført på dagene 3, 6 og 9 med friskt kulturmedium inneholdende respektive inhibitorer. På dag 10 ble cellene farget og antall kolonier telles. Bildene av representative koloni platene ble tatt fra platene seeded med 2,000cells /brønn, og antall kolonier vist ble regnet også fra plater sådd med 2,000cells /brønn. Minimal kolonidannelse ble observert ved tettheter på 20 og 200 celler /brønn. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SE; n = 2×3. ***
p
0,0001. (B) krings-uavhengig soft agar assay. LNCaP C-81-celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /35 mm tallerken i 0,25% myk agar-plater. Dagen etter ble cellene i dubletter eller større merket og ekskludert fra studien. Media ble tilsatt hver tredje dag, og på slutten av 5 uker ble kolonier dannet farget og tellet. Representative bilder av kolonier vises (over) og kolonien nummer ble regnet (nedenfor). Forsøkene ble utført i duplikat med 3 sett av uavhengige eksperimenter. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SE; n = 2×3. *** P 0,0001. (C). Celle adhesjon analysen på og plast. Cellene ble suspendert i media behandling i 30 minutter før de ble sådd ut i 6-brønners plater ved 3 x 10
3 celler /cm
2 ved hjelp av samme behandling media. Celler ble tillatt å holde seg i en time, fiksert og farget med 0,2% krystallfiolett-oppløsning (50:50 vann: MeOH). Det totale antall celler i fem felter ved 40 gangers forstørrelse for hver brønn ble telt. Forsøkene ble utført in triplo med 3 sett av uavhengige eksperimenter. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SE; n = 3×3. *
p
0,05; **
p
0,01. (D). Celle migrasjon Transwell analysen. Cellemigrasjon ble vurdert gjennom Boyden kammer. En alikvot av 5 x 10
4 C-81-celler ble podet i innsatsen av 24-brønners plater i medium som inneholdt 10 uM respektive forbindelser med løsningsmiddel alene for kontroll både i øvre og nedre kamre. Etter 24 timers inkubasjon ble de migrerte cellene farget og de celler som er igjen i det øvre kammer ble fjernet via bomullspinne. Cellene som hadde migrert inn i det nedre kammer ble tellet. Representative bilder vises på 40x forstørrelse. Forsøkene ble utført in triplo med 3 sett av uavhengige eksperimenter, og resultatene presentert er gjennomsnitt ± SE; n = 3×3 *
p
0,05; **
p
. 0,005
Den myke agar-kolonidannelse analysen ble deretter utført for å bestemme forbindelsens effekt på forankringsuavhengig vekst i en 3-dimensjonal miljø. Som vist i figur 3B, celler dyrket ved en tetthet på 5000 celler pr 35 mm skål i fire uker fremstilt langt færre kolonier med mindre kolonistørrelse når de behandles med de imidazopyridin-derivater. Sammenlignet med kontrollceller behandlet med løsningsmiddel alene, M-Mel trykkes kolonivekst i størst grad, å redusere antall kolonier med 90 prosent med knapt synlig kolonistørrelse (figur 3B). Til sammenligning EtOP og OMP redusert kolonivekst med 80 og 70 prosent hemming, henholdsvis, og HIMP hadde minst effekt på om lag 50 prosent hemming.
For å avklare om disse forbindelsene «effekt på kolonidannelse er delvis på grunn til hemming av celleadhesjon, kapasiteten på HIMP, M-Mel, OMP, og EtOP å påvirke PCa celleadhesjon på plastoverflaten av 6-brønns plater ble deretter undersøkt. Selv om disse forbindelser har varierende grad av undertrykkelse av evnen til LnCap C-81-celler til å overholde ved en tetthet på 50.000 celler per brønn, ble en tilsvarende inhiberende tendens observert med den i klonogene og myk-agar-analyser (figur 3C vs 3A 3B). M-Mel hadde størst effekt, og var i stand til å redusere cellebinding med om lag 40 prosent. Mens HIMP og EtOP var også i stand til å hemme celle tilslutning, gjorde de det i mindre grad; OMP ble funnet å ha en minimal effekt på C-81 cellenes evne til å feste seg til plastoverflaten. Derfor, selv om alle forbindelser som hører til den samme klasse av molekyler, de påvirker PCa celle kolonidannelse og adhesjon på en annen måte.
For å undersøke den hemmende evnen til disse forbindelsene på tumormetastase, ble deres aktivitet på cellemigrering analysert ved transwell migrasjon analysen. Interessant nok ble disse forbindelser funnet å ha varierende grad av undertrykkelse av PCa cellemigrering. Figur 3D viser at både M-Mel og EtOP var i stand til å redusere LNCaP C-81 cellemigrering via Boyden kammer analyse i løpet av en periode på 24 timer ved omtrent 30 prosent. Relativt, HIMP og OMP mislyktes i å redusere celle migrasjon. Total, M-Mel ble funnet å vise de mest potent inhibitorisk aktivitet på CR PCa celle tumorgenicity.
Effekt av imidazopyridiner Imidazopyridinforbindelser på proliferativ og apoptotisk signale i CR PCA Celler
Det er vel etablert at flertallet av CR PCA celler uttrykker funksjonell AR som er fortsatt nødvendig for deres vekst og overlevelse [22,31,32]. For å finne ut hvordan de forbindelser undertrykke PCa celleproliferasjon, analyserte vi deres virkninger på proliferative og apoptotiske signal i AR-positive LNCaP C-81 og MDA PCa2b-AI celler under SR forhold. Figur 4A og 4B viste at, ved 3-dagers behandlinger, 10 pM av hver forbindelse i betydelig grad undertrykkes LNCaP C-81 og MDA PCa2b-AI celleproliferasjon.
(A) LNCaP C-81-celler ble sådd ut i triplikat i T25 kolber på 4 x 10
3 celler /cm
2 i vanlig medium, dyrket i 72 timer da steroid sultet i 48 timer. Cellene ble deretter behandlet med 10 uM imidazopyridin-derivater eller DMSO som kontroll for ytterligere 72 timer under SR betingelser. Cellene ble trypsinert og levende celle tall telles via trypanblått analysen. Forsøkene ble utført in triplo med 3 sett av uavhengige eksperimenter. ***
p
0,0005. (B) MDA PCa2b-AI-celler ble dyrket, behandlet og tellet under betingelser som beskrevet ovenfor i (A) for LnCap C-81-celler. Resultatene som presenteres er gjennomsnitt ± SE; n = 3×3. *
p
0,05; **
p
0,005; ***
p
0,0005. (C) LNCaP C-81 totale celle lysat-proteiner ble oppsamlet fra (A) etter celleantall telling. *
p
0,05;
