Abstract
APE1 /Ref-en er en hoved regulator av cellulær respons på oksidativt stress
via
DNA-reparasjon funksjon og co-aktiverende aktivitet på NF-kB transkripsjonsfaktor. APE1 er sentral i å kontrollere oksidativt stress-baserte inflammatoriske prosesser ved modulering av cytokiner Uttrykket og overekspresjon er ansvarlig for angrep av chemoresistance i forskjellige tumorer inkludert hepatisk cancer. Vi har undersøkt den funksjonelle rollen til APE1 overekspresjon i løpet av levercelleskade i forbindelse med fettsyre opphopning og rollen til de redoks-funksjon av APE1 i den inflammatoriske prosessen. HepG2-celler ble stabilt transfektert med funksjonelle og ikke-funksjonelle APE1 kodende plasmider og den beskyttende effekten av APE1 overekspresjon mot genotoksiske forbindelser eller fettsyrer akkumulering, ble testet. JHH6 celler ble stimulert med TNFa-α i nærvær eller fravær av E3330, en APE1 redoks-inhibitor. IL-8-promoter-aktivitet ble fastslått ved et luciferase reporter assay, genekspresjon av Real-Time PCR og cytokiner (IL-6, IL-8, IL-12) som er målt ved hjelp av ELISA. APE1 overuttrykk ikke hindre cytotoksisitet indusert av lipid akkumulering. E3330 forhindret behandling funksjonell aktivering av NF-kB
via
endring av APE1 subcellulære handel og redusert IL-6 og IL-8-ekspresjon indusert av TNF-α og fettsyrer akkumulering gjennom blokkering av redoks-mediert aktivering av NF-kB. APE1 overekspresjon observert i leverkreftcellene kan gjenspeile en adaptiv respons på celleskader og kan være ansvarlig for videre celle motstand mot kjemoterapi og for utbruddet av betennelsesreaksjon. Effektiviteten av hemming av APE1 redoks-aktivitet ved blokkering av TNF-α og fettsyrer induserte inflammatoriske respons åpner nye perspektiver for behandling av inflammatoriske baserte leversykdommer
relasjon:. Cesaratto L, Codarin E, Vascotto C, Leonardi A Kelley MR, Tiribelli C, et al. (2013) Spesifikk hemming av Redox Aktivitet av Ape1 /Ref-1 av E3330 Blocks Tnf-Α-indusert aktivering av Il-8 Produksjonen i Liver Cancer Cell Lines. PLoS ONE åtte (8): e70909. doi: 10,1371 /journal.pone.0070909
Redaktør: Gordon Langsley, Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE – Institut Cochin, Frankrike
mottatt: 11 mars 2013; Godkjent: 24 juni 2013; Publisert: 15 august 2013
Copyright: © 2013 Cesaratto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erklærer at forskning fører til disse resultatene har fått støtte fra EU syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under tilskuddsavtalen Helse-F2-2009-241762, for prosjektet FLIP og med tilskudd fra Associazione Italiana per la Ricerca sul cancro (AIRC) (IG10269) og Minis dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) (FIRB_RBRN07BMCT) til GT. Økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt av National Institutes of Health NCICA121168, CA114571 og Riley Barnas Foundation til MRK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og erklære at de ikke har noen interessekonflikt, med unntak av Dr. Mark R. Kelley, som er leder av Scientific Grunnlegger legger~~POS=HEADCOMP og konsulent for APEX Therapeutics, et selskap som har lisensiert IP fra sitt arbeid. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ikke-alkoholholdige steatohepatitis (NASH) definerer en distinkt leversykdom hos pasienter uten tidligere alkoholmisbruk som histologisk ligner alkohol-indusert leverskade og inkluderer cellular skade, betennelse og fibrose [1], og kan utvikle seg mot skrumplever, leversvikt og HCC [2]. Mekanismene for denne progresjon og patogenesen av NASH er fremdeles dårlig forstått selv om oksidativt stress, som genereres som følge av mitokondriefunksjon, ser ut til å være direkte koblet med utbruddet av betennelses kretser som er ansvarlige for utviklingen av denne patologi. En av de viktigste pro-inflammatoriske cytokiner som ser ut til å være involvert i modulering av den inflammatoriske respons i flere former for leverskade er interleukin-8 (IL-8) [3], en CXC kjemokin, som rekrutterer og aktiverer neutrofiler, basofiler og T cellene [4]. Siden pasienter med NASH har signifikant forhøyet serumnivåer av IL-8 sammenlignet med friske individer, kan IL-8 spiller en viktig rolle i patogenesen av NASH [5]. I forskjellige lever
in vitro
modeller, kan lipid akkumulering stimulere IL-8 produksjon [6] gjennom aktivering av NF-kB [7]. I rottelever, frie fettsyrer (fettsyrer) aktiverer NF-kB veien og å øke ekspresjonen av noen pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-a, IL-1, IL-6) [8], [9].
Apurinic apyrimidinic Endonuklease /Redox effektor faktor 1 (APE1 /Ref-1) er en multifunksjonell protein som fungerer som en mester regulator av cellulær respons på oksidativt stress forhold og bidrar til opprettholdelse av genomet stabilitet. APE1 er involvert i både basen excision repair (BER) veier av DNA-lesjoner, fungerer som den viktigste apurinic /apyrimidinic (AP) endonuklease, og i transcriptional regulering av genekspresjon som en redoks co-aktivator av ulike transkripsjonsfaktorer, slik NF- kB og andre [10], [11]. I mage epitelceller spiller APE1 en ledende rolle i å kontrollere utbruddet av oksidativt stress-baserte inflammatoriske prosesser gjennom moduler NF-kB-mediert IL-8 genekspresjon [12]. APE1 uttrykk er også oppregulert under nedsatt lipidakkumulering i NASH pasienter [13], selv om det fortsatt er ukjent om dette oppregulering har en kausal rolle i utbruddet av NASH eller er knyttet til en beskyttende funksjon på lipidakkumulering cytotoksisk effekt.
APE1 er oppregulert i lever kreft [14], men den funksjonelle rollen til denne overekspresjon i tumoren patogenesen og progresjonen er ennå ikke klart. APE1 Redox funksjonen utøves gjennom en roman redox-basert mekanisme som involverer tre cysteinrester (dvs. C65, C93 og C99) [15]. Nyere
in vitro
studier viste at APE1 vedtar ulike utfoldet conformations avhengig av Redox tilstand av sine Cys rester [15]. (E) -3- (2- [5,6-dimetoksy-3-metyl-1,4-benzoquinonyl]) – 2-nonyl-propensyre (E3330) har blitt rapportert å binde direkte APE1 protein og å inhibere dets redoks aktivitet, uten å påvirke dets endonuklease-aktivitet, ved å øke dannelsen av disulfidbindinger som involverer redoks-aktive Cys65, forandre folding av APE1 protein og redusere protein redoks-aktive befolkning [16], og dermed påvirker på APE1 subcellulære handel [17]. E3330 har klinisk terapeutisk potensial som en spesifikk hemmer av APE1 Redox funksjon [18]. Betydningen av denne funksjonen er markert med resultater som viser at NF-kB-mediert genuttrykk reguleres av APE1 redoks aktivitet, uten effekter på IκBα degradering [19]. E3330 ble også funnet å selektivt hemme vekst /migrering av humane kreft i bukspyttkjertelen celler [20], som tyder på at APE1 redoks-funksjon kan representere en god kandidat for hemning av tumorinvasjon og metastase. E3330 trykkes betennelsesreaksjon i aktiverte makrofager [21], som tyder på en mulig bruk av E3330 for å redusere inflammatoriske prosesser i leversykdommer, slik som de som er knyttet til NASH.
I denne studien brukte vi
in vitro
modeller av fett overbelastning oppnås ved å utsette leverceller til en blanding av langkjedede fettsyrer (palmitinsyre (C16:0) og oljesyre (C18:1) syrer som er de mest tallrike fettsyrer i leveren triglyserider [22], [23 ]. i tillegg har den foreliggende studien ble rettet mot å undersøke den funksjonelle rollen til APE1 overekspresjon i løpet av levercelleskade relatert til lipidakkumulering og rollen til de redoks-funksjon av APE1 i den inflammatoriske prosessen utløses av TNF-α og fettsyrer akkumulering. Våre data viser at APE1 overekspresjon ikke beskytte mot fotballforbund indusert celleskade og at APE1 og NF-kB spille en viktig rolle i TNF-α-indusert transcriptional aktivering av IL-8 genuttrykk i leverkreft cellelinjer. Hemming av APE1 Redox aktivitet ved redoks inhibitor E3330 er effektiv i å forebygge både TNF-α eller lipidakkumulering indusert aktivering av IL-8-ekspresjon på transkripsjonsnivået ved blokkering av redoks-mediert aktivering av NF-kB.
Materialer og Metoder
Cell kultur og behandlinger
i denne studien brukte vi Huh-7 (differensiert hepatocytter avledet cellular carcinoma cellelinje) [24], den HepG2 (differensiert leverkreft) [25] og JHH6 ( udifferensiert leverkreft) [26] som modeller i leveren tumorigent prosessen. Huh-7 og JHH6 ble kjøpt fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) mens HepG2 fra ATCC. Huh-7, og HepG2-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (EuroClone, Pero, IT), JHH6 ble cellene dyrket i Williams medium E (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), begge supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Euroclone, Milano, IT).
HepG2-cellekloner ble dyrket ved en tetthet på 70.000 celler /cm
2 og ble behandlet med forskjellige doser av -metylmetansulfonat (MMS) eller 2,5 mm H
2o
2 (begge reagenser er distribuert av Sigma-Aldrich) i 2 timer eller 1 time hhv.
for etoposid behandling, HepG2 cellekloner ble trypsinert og 400.000 celler ble sådd på dekkglass i 6-brønn kulturplater. Etter 24 timer ble mediet erstattet med Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med eller uten etoposid (Sigma, St. Louis, MO), 50 uM i 1 time. (2E) -3- [5- (2,3-dimetoksy-6-metyl-1,4-benzoquinoyl)] -2-nonyl-2-propensyre (E3330; definert synthesized) [16] ble oppløst i DMSO. Behandling med E3330 ble utført i serumfritt medium William E, for å hindre at serum albumin-nivåer for å påvirke E3330 sluttkonsentrasjon.
behandling med rekombinant human TNF-α (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ) ble utført ved 2000 U /ml i serumfritt medium William E for å redusere serum-indusert IL-8-frigjøring.
for å indusere fett-overbelastning av celler, ble JHH6 eller HepG2-cellekloner sådd ut ved en tetthet på 14 000 og 57000 celler /cm
2 henholdsvis og etter 24 timer ble cellene eksponert for en blanding av langkjedede fettsyrer (oleat og palmitate) ved 2:01 forhold. Stamløsninger av 100 mM oleinsyre (Sigma-Aldrich) og 100 mM palmitinsyre (Sigma-Aldrich), fremstilt i DMSO, ble hensiktsmessig fortynnet i Williams medium E eller DMEM høy glukoseinneholdende 60 uM albumin fra bovin serum (Sigma-Aldrich) for å oppnå de ønskede sluttkonsentrasjoner. Med blandinger av fettsyrer og albumin, er opptaket en funksjon av fri fettsyre (fettsyrer), som er den monomere form i likevekt med albuminbundne fettsyrer [27].
Generation of APE1 overekspresjon levercellelinjer
for generasjon av APE1 overekspresjon cellelinjer, en APE1 ekspresjonsvektor ble generert ved kloning et EcoRI-BamHI fragment fra pflag-CMV-5,1 /APE1 (Sigma, Milan, IT) i p3XFLAG-CMV-14 vektor (Sigma ). Den APE1
NΔ33 delesjonsmutant ble generert ved PCR og subkloning fra full-lengde cDNA-sekvensen. Riktigheten av kloningsprosedyren ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Deretter ble HepG2-celler transfektert med p3XFLAG-CMV /APE1, villtype-APE1 (APE1
WT) og delesjonsmutant (APE1
NΔ33), på forhånd fordøyet med Scal (Fermentas, St. Leon Rot, UK ); 48 timer etter transfeksjon, ble cellene underkastet seleksjon med G418 (Invitrogen, Milano, Italia) i 14 dager og som er valgt for ervervet resistens. Individuelle kloner ble isolert ved hjelp av cellekloningssylindere (Sigma), overført og dyrket trinnvis inn i 24-brønners, 12-brønners, og 6-brønners plater for utvidelse til 10
7-celler i nærvær av selektive antibiotikum. Som kontroll brukte vi cellekloner transfektert med p3XFLAG-CMV-14 tom vektor. Geneticin (G418) (PAA Laboratories GmbH, Pasching, AT) ble tilsatt til cellekulturmediet ved en endelig konsentrasjon på 300 ug /ml i løpet av cellevekst. Totalt cellulære ekstrakter ble analysert for APE1 uttrykk av immunblot, og dermed avslører uttrykk for ektopisk flagget WT og mutant form av protein.
MTT og cellevekstanalyser
For å fastslå levedyktighet HepG2-celler overuttrykkende APE1 protein, ble en 3 (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid (MTT) analyse utført [28]. HepG2 kontroll og over-uttrykker APE1 kloner ble sådd ut på 96 multi-brønn plater ved en tetthet på 70.000 celler /cm
2 til hver brønn. Dagen etter ble cellene inkubert med MMS eller H
2o
2 som angitt. Etter behandling, i hver brønn 1/10 volum av MTT-løsning (4 mg /ml i PBS) ble tilsatt og inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Deretter ble supernatanten fjernet, og et like stort volum DMSO ble tilsatt til cellene og MTT-formazan ble oppløst ved pipettering. Absorbansen ble målt på en ELISA plateleser (EL808 Ultra -mikroplateleser Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) med en test og referanse bølgelengde på 570 og 630 nm, henholdsvis.
For trypanblått eksklusjons eksperimenter, celler ble trypsinert, resuspendert i 0,08% w /v trypan blå (Sigma) i komplett medium, og tellet etter 3-5 minutters inkubering.
data ble uttrykt som prosentandelen av overlevende celler i forhold til den ubehandlede kontroll.
MTS assay
dagen før behandlingen, JHH6 celler ble sådd ut ved en tetthet på 26.000 celler /cm
2. For å evaluere effekten av behandlingen i form av celle levedyktighet, den CellTiter 96
® AQ
ueous En løsning Cell Proliferation Assay (Promega Corporation, Madison, WI) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Denne analysen inneholder en ny tetrazolium-forbindelse [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium, indre salt; MTS] som er bioreduced av celler til et farget formazanprodukt som er løselig i cellekulturmedium og kan kvantifiseres ved å avlese absorbsjon ved 490 nm.
Nile Red-farging
Lipidinnholdet i dyrkede celler ble bestemt fluorometrisk ved hjelp Nile Red farging (Sigma-Aldrich, Milan, IT), en vital lipofilt og selektiv fluorescerende flekken for intracellulær lipid dråper opphopning [29].
Stamløsninger løsninger~~POS=HEADCOMP av Nile Red (100 eller 1000 ug /ml) i aceton ble fremstilt og lagret beskyttet mot lys. Farging ble utført på fikserte celler (1,5% glutaraldehyd, 5 min). Cellemonolagene ble vasket to ganger med PBS, behandlet i 5 minutter med 0,1% Triton X-100 i PBS og inkubert i 1 time med Nile Red-løsning for å bevirke en 1:100 fortynning i PBS. Etter Nile Red behandling ble atomkjerner farget med 5 minutters inkubering i 300 nM oppløsning av 4 «, 6»-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) (Sigma) i PBS. Monolag ble så vasket tre ganger i PBS og brukt til fluorescens mikroskopi. Immunofluorescent bilder ble samlet inn ved hjelp av en konfokal mikroskop (Leica DM IRB /E, Wetzlar, Tyskland) ved eksitasjon bølgelengde, 450-500 nm og emisjonsbølgelengden . 528 nm
Utarbeidelse av totale celleekstrakter
for fremstilling av totale cellelysater, ble cellene høstet ved trypsinering og sentrifugert ved 250 x
g
i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten ble fjernet, og pelleten ble vasket en gang med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) og deretter sentrifugert igjen som beskrevet tidligere. Cellepelleten ble resuspendert i lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 1% (vekt /volum) Triton X-100 tilsatt 1x protease inhibitor cocktail (Sigma), 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM NaF og 1 mM Na
3VO
4, ved en celletetthet på 10
7 celler /ml i 30 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering ved 12.000 x
g
i 30 minutter ved 4 ° C, supernatanten ble oppsamlet som totalt cellelysat. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse-reagens (Bio-Rad, Hercules, CA).
Western blot-analyse
De indikerte mengder av celle-ekstrakter ble elektroforert på en 12% SDS -SIDE. Proteiner ble så overført til nitrocellulosemembraner (Schleicher Primere som ble anvendt var: IL-8 For 5′-CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3 «IL-8 Rev 5′-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3′; 18S For 5»-CTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAG-3 «, 5′-18S Rev CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTC-3′; GAPDH For 5»-CCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3 «, 5′-GAPDH Rev TGGGATTTCCATTGATGACAAGC-3′; HPRT For 5»-AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG-3 «, 5′-HPRT Rev GTCTGGCTTATATCCAACACTTCG-3».
cDNA ble amplifisert i 96-brønners plater ved bruk av primere for IL-8, 18S, GAPDH og HPRT i separate brønner ved hjelp 2X iQ
TM SYBR
® Grønn Supermix (Bio-Rad Laboratories) [100 mM KCl; 40 mM Tris-HCl, pH 8,4; 0,4 mM av hver dNTP; 50 U /ml iTaq DNA polymerase; 6 mM MgCl
2, SYBR grønn I, 20 nM fluorescein og stabilisatorer] og 300 nm bestemt sense og anti-sense primere i et endelig volum på 15 ul til hver brønn. Hver prøve ble analysert i triplikat. En prøve uten mal, som negativ kontroll, og en prøve med ikke retro-transkribert mRNA istedenfor templat cDNA, som kontroll for genomisk DNA-forurensning, ble inkludert. Syklusparametrene var: denaturering ved 95 ° C i 10 s og gløding /forlengelse ved 60 ° C i 30 s (gjentatt 40 ganger). For å verifisere spesifisitet av forsterkning, ble en smelte-kurve analyse utført, umiddelbart etter amplifikasjonsprotokoll.
Løselig cytokiner besluttsomhet
IL-8 og IL-12 proteinnivåer i TNF -α behandlet celle-kultursupernatantene ble kvantifisert ved hjelp av en FlowCytomix analysesett (Bender MedSystems, Atlanta, GA), i henhold til produsentens protokoll.
Statistisk analyse
Statistisk analyse på biologiske data var utføres ved hjelp av Microsoft Excel-dataanalyseprogram for Students
t
-test analyse. P 0,05 eller P 0,01 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk for ektopisk APE1
WT protein overfører leverceller beskyttelse mot gentoksisk skade
Vi først. undersøkte de biologiske virkningene av APE1 over-ekspresjon av leverceller ved hjelp av HepG2-celler, stabilt over-uttrykker ektopisk formen av villtype-proteinet (APE1
WT) eller dets delesjonsmutant (APE1
NΔ33) mangler den første 33 rester [31]. De cellekloner, i hvilken det endogene APE1 protein er co-uttrykt med et ektopisk Flag-merket rekombinant APE1 protein, representere en overekspresjon modell for å teste rolle av funksjonelle og ikke-funksjonelle APE1 proteiner i lipid-induserte cytotoksiske effekt og etterligner tilstanden funnet i avanserte stadier av leverkreft progresjon (fig. 1A) [14]. Vi karakterisert begge cellemodeller for APE1 lokalisering av immunofluorescens-analyse, som viser at, i likhet med den endogene protein, ektopisk APE1
WT lokalisert hovedsakelig innenfor den kjernefysiske rommet av HepG2-cellekloner, mens den APE1
NΔ33 mutant viste en panne -cellular fordeling både i cytoplasmiske og kjernefysiske kamre, som følge av mangel på den bi-partite NLS-sekvensen [32], og som allerede observert i andre cellesystemer (fig. 1 B) [33].
Panel A:.
Western blot-analyse av totalt celleekstrakter fra HepG2 stabil cellekloner
stabilt transfekterte kloner er blitt oppnådd som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Tolv mikrogram proteinekstrakter ble separert ved 12% SDS-PAGE og deretter overført til en NC-membran. Membranen ble immunoblottet med anti-APE1 antistoff. De rapporterte ovenfor Verdiene refererer til prosenter av bandet intensiteter mellom ectopically-uttrykk og endogen APE1, målt ved densitometri. Ektopisk Flag-merket rekombinant protein både i APE1
WT og APE1
NΔ33 cellekloner uttrykkes til en lignende grad på ulike dager i cellekultur. a: kloner etter sjette
in vitro
passasje; b: kloner etter den tiende
in vitro
passasje. Panel B:
APE1 lokalisering innenfor HepG2 celle kloner
HepG2 cellekloner ble fiksert og immunostained for Histone H3 (rød) og for Flag-merket APE1 med en α-Flag antistoff (grønn).. Sammenslåtte bilder (gul) viser lokalisering av APE1
WT innenfor cellekjerner og colocalization med Histone H3. Den APE1
NΔ33 sletting mutant colocalizes med Histone H3 innenfor cellekjerner, men viser også cytoplasma positivitet. Panel C:.
Vekstkurve av HepG2-cellekloner
HepG2 tom klon, APE1
WT klon og APE1
NΔ33 klone celler ble sådd i hver brønn i en 24-brønners plate og cellevekst ble overvåket hver to eller tre dager, som angitt, ved trypan blå eksklusjon. APE1
NΔ33 celler (trekant) vokste saktere enn APE1
WT (firkant) og de tomme kloner (DOT). Panel D:.
Cellevekst av MTT kolorimetrisk analyse
tretti tusen celler av kontroll (tom klon), APE1
WT og APE1
NΔ33 kloner ble sådd ut i fire brønner i en 96-brønns mikro tallerken. Celleviabilitet ble målt etter 72 timer med kultur. MTT analysen avslørte også at APE1
NΔ33 celle klon har et lavere nivå av spredning enn tomme og APE1
WT kloner. Data, uttrykt som prosentandel av cellelevedyktighet i forhold til kontroll tom klonen, er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Panel E
.: Effekt av MMS på levedyktigheten til HepG2-cellekloner
HepG2-cellekloner ble behandlet i 2 timer med 1,6 eller 2,0 mM MMS og cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT kolorimetrisk analyse. Når cellene ble behandlet med 2,0 mM MMS, ble cellelevedyktigheten signifikant redusert i APE1
NΔ33 celle klon, men ikke i den APE1
WT klon, noe som tyder på at ektopisk ekspresjon av APE1
WT beskytter cellene mot MMS- indusert citotoxicity. Data som er vist er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Panel F:
Effekt av H
2o
2 på levedyktigheten til HepG2 cellekloner
. HepG2-cellekloner ble behandlet med 2,5 mM hydrogenperoksyd i 1 time, deretter cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Etter eksponering for 2,5 mm H
2o
2 ingen signifikant reduksjon i celle levedyktighet ble oppdaget for APE1
WT klone forhold til tomme og APE1
NΔ33 celle kloner. Histogrammene viser gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Panel G:
Kvantifisering av γH2A.X foci i respons til etoposid behandling
Den γH2A.X foci ble oppdaget ved hjelp av immunhistokjemi og kvantifisert ved bildeanalyse.. Celler ble behandlet med etoposid (50 uM) i 1 time og antall dobbeltkjedet DNA bryter (DSB) ble bestemt til forskjellige tider for frigivelse (0 h, 15 h og 24 h). γH2A.X foci nivåer forbli betydelig høyere enn kontroller på 15 timer og 24 timer i etoposid behandlet APE1
NΔ33 celle klone (trekant). DNA-skader var svakere for APE1
WT klone (firkant) enn tom (dot) og APE1
NΔ33 celle kloner, tyder på en beskyttende rolle APE1 overekspresjon i DNA reparasjon.
Så, vi evaluert effekten av over-uttrykk for APE1
WT og APE1
NΔ33 funksjonell mutant på celle levedyktighet. Over-ekspresjon av APE1
WT som skyldes en økt celleformering hastighet, mens ekspresjon av APE1
NΔ33 protein Formen fremviste en tilsynelatende svekkelse av cellevekst sammenlignet med kontrollcelle klon (fig. 1C). Kontrollceller viste en mellomliggende fenotype som følge av ekspresjonen av bare det endogene APE1 protein. Celleviabilitet analyser ble evaluert ved MTT-analyse, viste at svekket proliferasjonen observert i APE1
NΔ33 mutant ble forbundet til en redusert cellelevedyktighet med hensyn til APE1
WT uttrykkende klon (fig. 1D). Disse data understøtter den konklusjon at den NΔ33 delesjonsmutant kan virke som en dominant negativ form for APE1 direkte innvirkning på cellenes levedyktighet, som også ses i andre kreftcellemodeller [17], [34].
Vi deretter testet evne APE1 overekspresjon for å beskytte cellene fra genotoksiske behandlinger, som beskrevet for andre cellemodeller [35], [36], [37], men aldri i leverceller. Til dette formål, APE1
WT og APE1
NΔ33 celle kloner ble behandlet med DNA alkyleringsmidlet -metylmetansulfonat (MMS) [38], med hydrogenperoksid (H
2o
2) eller med etoposid som induserer doble trådbrudd (DSB sin) i DNA. Cellekloner ble inkubert med økende doser av MMS i 2 timer, og cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Ved behandling med 2,0 mM MMS, ble celleviabilitet betydelig redusert i APE1
NΔ33 uttrykke klone sammenlignet med APE1
WT og kontroll kloner (Fig. 1E). Lignende resultater ble oppnådd når det gjelder H
2o
2 som genotoxicant (fig. 1F). Disse resultater antyder at stabilt over-uttrykt APE1
WT beskytter cellene mot genotoksisitetstesten indusert ved alkylering behandling og oksidativt stress, som allerede observert i andre cellelinjer [36].
I tilfellet med DNA dobbel tråd break-analyse ble celler behandlet i 1 time med 50 uM etoposid, en inhibitor av topoisomerase II som fører cytotoksiske DSB sin formasjon [39]. Som fosforylering skjer på S139 fra H2A.X, kalt γH2A.X, er viktig under DNA dobbel tråd reparasjon og regnes som en markør av DSB sin celle skade [40], analyserte vi kinetikken av etoposid-indusert DSB reparasjon av de ulike cellekloner. Som observert i fig.
