Abstract
Exosomes er små ekstracellulære membranvesikler av endocytic opprinnelse utgitt av mange celler som kan finnes i de fleste kroppsvæsker. De viktigste funksjonene til exosomes er mobil kommunikasjon og mobilnettet avfall opprydding. Denne undersøkelsen ble gjennomført for å bestemme involvering av exosomes i regulering av sensitiviteten av lungekreft cellelinjen A549 til cisplatin (DDP). Når DDP ble lagt inn i A549 celler, exosomes sekresjon ble styrket. Tilsetning av de utskilte exosomes til andre A549 celler øket motstand av disse A549 celler til DDP. Ved eksponering av A549 til DDP, uttrykket nivåer av flere mirnas og mRNA velig knyttet til DDP følsomhet endret seg betydelig i exosomes; disse endringene kan megle motstanden av A549 celler til DDP. Exosomes utgitt av A549-celler i løpet av DDP eksponering redusert følsomheten av andre A549 celler til DDP, som kan være mediert av mirnas og mRNA utveksling av exosomes via celle-til-celle-kommunikasjon. Selv om den detaljerte mekanismen for resistens er fortsatt uklart, antas vi at inhibering av exosomes dannelse og frigivelse kan også utgjøre en ny strategi for lungekreft behandling i fremtiden
relasjon:. Xiao X, Yu S, Li S, Wu J Ma R, Cao H, et al. (2014) Exosomes: nedsatt følsomhet for lungekreft A549-celler til Cisplatin. PLoS ONE 9 (2): e89534. doi: 10,1371 /journal.pone.0089534
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 8 oktober 2013; Godkjent: 22 januar 2014; Publisert: 21 februar 2014
Copyright: © 2014 Xiao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 81372396) og seks talent Peak of Human Affairs Hall i Jiangsu-provinsen (nr 40). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet i tale og ikke-småcellet lungekreft Caner (NSCLC) er den vanligste formen for lungekreft. Pasienter med en slik aggressiv tumor har en dårlig fem-års overlevelsesraten mindre enn 20%, noe som mest sannsynlig tilskrives metastatisk sykdom ved tidspunktet for diagnose. Selv om flere mål stoffer som erlotinib og cetuximab kunne øke den totale overlevelsen av NSCLC pasienter, platina-dublett kjemoterapi er fortsatt den viktigste behandlingen for pasienter med avansert NSCLC.
Platinum (DDP) er et DNA-ødeleggende middel som kunne gå inn tumorceller og føre til aquation og hydrolyse for å danne reaktive platinaforbindelser [1]. Aquated DDP vanligvis gjenkjenner DNA som det primære og interagerer med DNA, noe som fører til dannelse av interstrand og /eller intrakjede tverrbindinger [2]. DNA-skade respons (DDR) system og forskjellige signalbaner, er aktivert [3], og uttrykket nivåer av RNA kan bli påvirket tilsvarende [4]. Mange pasienter vise enten medfødt ufølsomhet overfor medikamentet eller DDP-insensitivitet tilbakevendende av sykdommen etter en innledende behandlingsperiode. Flere mekanismer som er involvert i regulering av følsomheten av tumorceller til DDP; disse mekanismene inkluderer intracellulær akkumulering og utstrømming av DDP [5], DNA-reparasjon evne, toleranse for ureparert DNA-lesjoner [6], og regulering av flere gener [7].
Exosomes er små ekstracellulære membranblærer, som kunne bli utskilt av mange typer av tumorceller og finnes i de fleste kroppsvæske [8], [9]. Uansett opprinnelse, exosomes har lignende protein komposisjoner, som kan kategoriseres i tre hovedgrupper: ekte flåte proteiner, cytoskjelettet som proteiner og varmesjokkproteiner [10]. Innvendige vesiklene er dannet av den indre spirende celler kjent som multivesikulære endosomer (MVE). Fusjon av MVE med plasmamembranen fører til utgivelsen av den interne vesikler kalt exosomes [11]. Exosomes kunne reise til omkringliggende celler eller fjerne vev for å vise funksjoner som immunstimulering, immunsuppresjon [12], induksjon av spredning og toleranse [13] – [15], overføring av genetisk materiale [10] og søppel fjerning [16]. Exosomes inneholde en betydelig mengde av RNA og kan overføres fra en celle til en annen [10], og dermed bidra til proliferasjon og metastase av kreft og kreftutvikling [13], [14], [17], [18]. Men til vår beste overbevisning, er fortsatt ukjent involvering av exosomes i reguleringen av sensitiviteten av lungekreftceller til DDP.
Når utsatt for DDP, kreftceller vanligvis tilpasse seg mikromiljøet og juster til stimulering. Siden exosomes er rapportert å være involvert i cellekommunikasjon, hypotese vi den mulige involvering av exosomes i reguleringen av A549 celle responser på DDP. Nærmere bestemt kan exosomes utgitt av A549-celler i løpet av DDP eksponering endre følsomheten av de omliggende celler til DDP. I tillegg kan exosomal RNA overføres fra en celle til en annen [10]. Som sådan, antok vi at noen mirnas og mRNA velig forbundet med DDP motstand kan overføres fra en celle til en annen ved exosomes. MiR-21, MIR-98, MIR-133b, MIR-138, MIR-181a og MIR-200c [19] – [24] ble angivelig knyttet DDP følsomhet regulering, mens ERCC1, BRCA1 og RRM1 [25] – [27 ] var relatert til DDP motstand. For å teste våre hypoteser, ble disse mirnas og mRNA valgt å foreløpig studere deres engasjement i ferd med DDP motstand.
Resultater
Karakterisering av Exosomes utgitt av A549-celler
Å sikre vellykket isolering av exosomes, ble de oppsamlede exosomes observert med TEM (transmisjonselektronmikroskop) og analysert ved hjelp av Western blot (figur 1A). Mikrovesikkelen klynger utstilt runde blemmer som måler 30-100 nm i diameter (Tall 1B, 1C). Figur 1D viser ekspresjon av CD63, et tetraspanin familiemedlem som lokaliserer i exosomal indre vesikler, som et dobbelt bånd på exosomes og som et lett bånd i celler.
(A) Exosome isoleringsfremgangsmåten anvendt i denne studien. (B, C) Transmisjonselektron mikroskopisk bilde av exosomes. Exosomes er små blærer som måler fra 30nm til 100 nm i diameter. (D) Western blot av CD63 og β-aktin i exosomes og celler.
Cellular Effekt av A549-celler til Cisplatin
Dose-respons-evaluering ble utført i denne studien. En konsentrasjon på 3 ug /ml DDP ble valgt for vår protokoll siden denne dosen forårsaket død av ca 50% av A549-celler (figurene 2A, 2B). For å teste effekten av DDP på utgivelsen av exosomes, exosomes ble kvantifisert med BCA; proteinet standardkurve er vist i figur 2C. Som vist på figur 2D, er mengden av exosomes utgitt av hver celle i løpet av DDP eksponering var høyere enn under normale betingelser, noe som indikerer en betydelig økning i exosomes utgitt av A549 celler som ved eksponering for DDP.
(A) doseresponsforhold mellom levedyktigheten til A549-celler (%) og konsentrasjon av cisplatin (1-10 ug /ml) i 48 timer. (B) Mikroskopisk bilde av A549 celler behandlet med 0 og 3 ug /ml cisplatin. Bilder ble oppnådd ved en forstørrelse på 100 x. (C, D) Mengde av exosomes bestemt ved BCA standardkurven og forbedret sekresjon av exosomes normaliserte til celleantall etter eksponering til A549-celler til cisplatin. (E) Differensial ekspresjonsnivåer av de seks mirnas i celler etter eksponering til A549-celler til cisplatin. (F) Differansen ekspresjonsnivåer av de to mirnas i exosomes etter eksponering til A549-celler til cisplatin. (G) Brett-endringer i uttrykket av MIR-21 og MIR-133b i exosomes er høyere enn de i cellene. Linjene indikerer gjennomsnittlig ± SD av tre gjentak. * Indikerer p. 0,05 versus kontrollgruppene
For å finne ut om exosomes kunne transportinformasjon, uttrykk for de seks mirnas foreslått i denne utredningen ble påvist i celler og exosomes. Alle seks mirnas kunne påvises i cellene, mens bare MIR-21 og 133b kunne påvises i exosomes (Ct verdien av de fire andre mirnas skredet 40). For å teste påvirkning av DDP på uttrykket nivåer av miRNAs i celler og exosomes, ble uttrykket nivåer av disse seks mirnas oppdaget i celler og exosomes ved eksponering av A549 celler til DDP. Som vist i figurene 2E og 2F, uttrykket nivåer av MIR-21, MIR-133b, MIR-98 økte MIR-181a i celler, mens uttrykkene i MIR-21 og 133b økt i exosomes. Fold-endringer i uttrykket av MIR-21 og MIR-133b i exosomes var også høyere enn i celler (figur 2G).
Exosomes Reduser sensitiviteten til A549 celler til DDP
For å finne ut exosomes opptak av A549-celler, ble exosomes merket ved VISSTe og ko-inkubert med A549-celler i 3 timer, hvoretter fluorescens mikroskopi ble utført. Som vist på figur 3B, kan exosomes bli absorbert av omgivende celler. For å avgjøre om exosomes kan påvirke sensitiviteten av A549 til DDP ble exosomes utgitt av A549 celler under normale tilstand og under DDP tilstand høstet og lagt til cellene. Som vist i figur 3A og 3C, kan exosomes utgitt av A549-celler i henhold til DDP eksponering redusere følsomheten av andre A549 celler til DDP, mens exosomes utgitt av A549-celler under normale betingelser hadde liten innflytelse på sensitiviteten til A549-celler til DDP. Fordi exosomes utgitt av A549 celler under normale forhold ikke påvirker følsomheten av omkringliggende celler til DDP, vi valgte å studere funksjonen av exosomes utgitt av A549 celler i henhold DDP eksponering bare.
(A) forbehandling av A549 celler med exosomes frigjøres under cisplatin (3 ug /ml) eksponering reduserer sensitiviteten av celler overfor cisplatin med omtrent 20% sammenliknet med de uten forbehandling i 48 timer. (B) Opptak av exosomes (rød) av A549-celler etter inkubasjon i 3 timer ble visualisert ved mikroskopi. Skala: 50 mikrometer. (C) Mikroskopisk bilde av A549 celler dyrket under fire vilkår [control, exosomes, DDP (3 mg /ml), exosomes + DDP] i 48 timer. Bilder ble oppnådd ved en forstørrelse på 100 x. * I (A) indikerer p 0,05 versus kontrollgruppene
Exosomes påvirke uttrykket nivåer av Cellular mirnas og mRNA
For å teste mulige vekslinger i uttrykk av miRNAs og mRNA i celler. som et resultat av exosomes utgitt av A549-celler i løpet av DDP eksponering, ble detektert uttrykket nivåer av disse mirnas og mRNA etter at cellene ble utsatt for exosomes. Som vist i figur 4A, ekspresjonsnivået av MIR-21 økte, mens uttrykket nivåer av MIR-98, 133b, 138, 181a, 200c og redusert. Figur 4B viser en økning i uttrykket nivåer av ERCC1, BRCA1 og RRM1. Videre, som vist i figurene 4C og 4D, etter A549-celler ble behandlet med DDP, de relative bretteendring på mirnas og mRNA i celler forbehandlet med exosomes varierte fra de relative brette endringer observert i celler dyrket under normale forhold.
Expression nivåer av (A) mirnas og (B) mRNA under normale forhold med og uten exosome forbehandling. Brett-endringer i uttrykket av (C) mirnas og (D) mRNA henhold cisplatin med og uten exosome forbehandling. Linjene indikerer gjennomsnittlig ± SD av tre gjentak. * Indikerer p. 0,05 versus kontrollgruppene
Diskusjoner
Så langt vi kjenner til, er den første til å demonstrere exosomes engasjement i reguleringen av følsomhet for lungekreft A549 vår studie celler til DDP. Vi har funnet at eksponering av A549 celler til DDP kan føre til at celler for å frigjøre mer exosomes enn i normale forhold, og at vekselvirkningen av disse exosomes med andre A549 celler kunne øke motstanden i disse A549 celler til DDP. Vår studie først beviser at når A549 cellene blir utsatt for DDP, uttrykket nivåer av flere mirnas og mRNA velig knyttet til DDP følsomhet vesentlig forandring i exosomes og at disse endringene trolig megle DDP motstand av A549 celler.
Når utsettes for DDP, kreftceller tilpasse seg endringer i omgivelsene for å overleve. DNA skade respons (DDR) system og diverse signalveier blir så indusert. Noen celler kan reparere denne skaden og passere gjennom cellesyklussjekkpunkter, mens andre celler ikke klarer å reparere skader og dermed gjennomgå celledød ved apoptose eller mobilnettet senescence. Som vist i figur 2A, omtrent halvparten av cellene døde etter eksponering til A549-celler til 3 ug /ml DDP, mens innholdet og cellulære prosesser av overlevende celler ble forandret på transkripsjonsnivået. Som vist i figur 2E, er ekspresjonsnivåene av MIR-21, MIR-133b, MIR-98 og MIR-181a detektert i dette papiret varieres. RNA-innholdet i exosomes velig forskjellig fra RNA fra donorceller [10], og differensialuttrykk exosomal mirnas avhenger både av opprinnelsen av celler og miljø. Figur 2G viser at under DDP behandling, de differensial uttrykk nivåer av miRNAs i exosomes skilte seg fra de i cellene. Og som vist i Figur 2E og 2F, cellulære mirnas uttrykk var forskjellig fra exosomal mirnas uttrykk. I tillegg er uttrykket nivåer av mirnas varieres i celler dyrket under forskjellige betingelser, som indikerer at mirnas innholdet i exosomes kan reguleres i samsvar med den biologiske tilstanden til cellene.
I DDP eksponering, exosomes utgitt av hver overlevende celle øke og noen av DDP eksporteres av disse exosomes [16]. Exosomal mirnas blir så formidlet i celle-til-celle-kommunikasjon [10]. Figur 3B, kunne 4A og 4B viser at exosomes frakte meldinger uptaken av omkringliggende celler og celleinnholdet er endret tilsvarende. Disse meldingene kan inneholde informasjon om overhengende fare, og innholdet i exosomes alltid avhenger av tilstanden hvor exosomes frigjøres. Når cellene ble behandlet med en andre syklus av DDP, ble transkripsjonsnivåer påvirket. Som vist på figur 4C og 4D, celler forbehandlet med exosomes demonstrert noen forberedelse for den andre syklus av DDP behandling og transkripsjonelle nivået indusert i cellene var forskjellige.
Når de utsettes for DDP, A549-celler ble stimulert og ekspresjonsnivået av MIR-21 økt. Fordi uttrykket nivået av MIR-21 i exosomes også økt betydelig og exosomes kan uptaken av omkringliggende cellene, utledet vi at exosomes kunne mekle mer MIR-21 til andre celler. Faktisk ble det observert en økning i ekspresjonsnivået av MIR-21 i andre celler, noe som antyder at oppregulert ekspresjon av MIR-21 [19] minsker følsomheten av lungekreftceller til DDP. Når de utsettes for DDP en gang til, celler som har mottatt et andre stimulering og reagert mindre sterkt. Uttrykket nivåer av MIR-21 økte, men ikke så mye som i den første endringen. Ekspresjonsnivået av MIR-133b også økt etter A549-celler ble behandlet med DDP. Exosomes medier MIR-133b kan uptaken av omkringliggende celler og påvirke transkripsjons nivåer av andre celler. Når det rikelig av ytre MIR-133b kan være mediert inn i cellene, kan ekspresjonen av MIR-133b i celler bli matet tilbake til minke. Den downregulated ekspresjon av MIR-133b [28] har vist seg å redusere følsomheten av lungekreftceller til DDP. Etter en andre syklus av DDP behandling, celler med dårlig uttrykk for MIR-133b svarte og uttrykket nivået av MIR-133b tydeligvis økt.
Mange forskere har uttrykt ulike syn på funksjon exosomes påvirke celle responser til stimulering, og disse funksjoner av exosomes har alltid vært avhengig av hvilken type stimulering. Maria Eldh et al. hevdet at exosomes påvirke responsen av mottakercellene til en ekstern belastning stimulans av medierer RNA fra en celle til en annen [29]. Claire Corcoran et al. funnet at exosomes delvis bidrar til mobil kommunikasjon, noe som resulterer i mediering av docetaxel-resistens til sekundære celler [15]. Vår undersøkelse videre demonstrert exosome involvert i regulering av sensitiviteten til A549-celler til DDP under DDP eksponering, og at denne innflytelse er sannsynligvis regulert av exosomes. Men flere mangler og svakheter finnes i dette arbeidet, og den detaljerte mekanisme DDP motstand vil bli ytterligere undersøkt i vår neste studie.
I denne studien har vi vist at exosomes utgitt av A549 celler eksponert for DDP kunne kommunisere med andre celler og innflytelse motstand av disse cellene til DDP. Selv detaljert mekanisme er fortsatt uklart, mener vi at hemming av exosome dannelse og frigjøring kan presentere en ny strategi for fremtidig behandling av lungekreft.
Materialer og metoder
Cell Culture
Celler fra velkarakterisert human lunge adenokarsinom kreftcellelinje A549 (Shanghai Cellular Research Institute, Kina) ble holdt i RPMI-1640 medium (Nanjing Kaiji Biology, Kina) supplert med 10% FBS (føtalt bovint serum, Hyclon Laboratories, USA ) ved 37 ° C og under 5% CO
2. Cellene ble inokulert i en 96-brønns plate ved en celletetthet på 6 x 10
3 celler /brønn, og dose-responsevaluering av DDP til A549-celler ble utført ved anvendelse av en celletelling kit-8 (CCK-8; Dojindo , Kumamoto, Japan).
Isolering og karakterisering av Exosomes utgitt av A549-celler
for å redusere påvirkningen av exosomes i FBS, FBS ble tømt for exosomes av ultrasentrifugering ved 200.000 x g ved 4 ° C i 16 timer (Beckman 70 Ti rotor). Etter at cellene å feste over natten, ble mediet erstattet med RPMI-1640 medium og 10% exosome-utarmet FBS. Etter 48 timer ble kulturmediet høstet for å samle exosomes. Exosomes isolasjon (figur 1A) ble utført ved hjelp av en Beckman ultrasentrifuge (70 Ti rotor) og ExoQuick-TC exosome nedbør løsning (System biovitenskap, Mountain View, CA, USA).
Exosomes oppløst i 200 mL av fosfat- bufret saltløsning (PBS) ble kvantifisert ved bruk av en forbedret BCA proteinanalysesett (Beyotime Biotechnology, Kina). Morfologien og partikkelstørrelsen av exosomes oppløst i PBS ble karakterisert via et transmisjons-elektronmikroskop (TEM, JEM-2100, JEOL, Tokyo, Japan). Totale cellulære og exosomal proteiner ble henholdsvis ekstrahert fra celler og exosomes ved hjelp av SDS-lyseringsbuffer (250 nM Tris-HCL, pH 7,4, 2,5% SDS). Proteiner (10 mg /ml) ble separert på 10% SDS-PAGE-geler og overført til en PVDF-membran. Antistoffene som brukes for immunoblotting inkludert CD63 (System biovitenskap, Mountain View, CA, USA) og β-aktin (Sigma-Aldrich). Ved hjelp av forbedret chemiluminescence løsning (ECL kit, Pierce), ble proteinbåndene observert ved hjelp av molekylær bilde ChemiDoc XRS + (Bio-Rad).
Opptak av Exosomes og celleviabilitet analyse
exosome pellets ble resuspendert i 1 ml phosphatebuttered saltvann (PBS) inneholdende 5 ug /ml gjorde (Biotium, USA) i 30 minutter. Den resuspenderte oppløsning ble sentrifugert ved 200.000 x g i 2 timer, og PBS-resuspenderte pelleter ble tilsatt til A549-celler. Fluorescens bildebehandling ble senere fremført av konfokal mikroskopi.
For å vurdere effekten av exosomes på følsomheten av celler til DDP, 6 × 10
3 celler /brønn ble sådd i en 96-brønns plate med RPMI- 1640 inneholdende 10% exosome-utarmet FBS. Etter 24 timer ble exosomes utgitt av A549-celler under normale og DDP-behandlede betingelser tilsatt til de tilsvarende celler i et forhold på 5: 1 (exosomes høstet fra 5 ml av supernatanten ble tilsatt i celler dyrket i 1 ml kulturmedium) for 3 timer. Det samme volum av PBS uten exosomes ble tilsatt til celler som anvendes som kontrollgruppen. For cytotoksisitetsanalyser, ble 3 mg /ml DDP påført brønnene i 48 timer og den totale cellelevedyktigheten ble bedømt ved bruk av en celletelling kit-8 (CCK-8).
RNA Isolering og analyse
Exosomal RNA ble isolert ved hjelp av en Mirvana mikroRNA isolasjon kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og eluert i 100 mL av oppvarmet eluering løsning i henhold til produsentens protokoll. Cellular RNA ble oppnådd ved hjelp Trizol® utvinning metodikk (Invitrogen, Paisley, UK) og eluert i 30 mL av DDH
2o.
miRNA ble stilk-løkke revers transkribert (RT) med miRNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RT-PCR ble utført in triplo ved bruk av TaqMan miRNA analyse (Applied Biosystems). Et gen-spesifikk probe mix (MIR-21, 000 397, MIR-98, 000 577, MIR-133b, 002 247, MIR-138, 002 284, MIR-181a, 000 480, MIR-200c, 002 300) ble brukt i denne studien. U6 snRNA ble benyttet som intern kontroll for TaqMan miRNA analyse for å påvise ekspresjon nivået av mirnas i celler; syntetiske ikke-menneskelige miRNA [
Caenorbabditis elegans
MIR-39 miRNA (cel-MIR-39); Takara Bio Inc., Tokyo, Japan] ble tilsatt i å normalisere exosome volumet ved starten av RNA-isolering.
Tilpasset TaqMan Low Density RT-PCR-array (Confinder Bio., Kina) ble anvendt for å detektere mRNA uttrykk, og GAPDH ble valgt som den interne kontrollen. Analyse av genuttrykk ble utført ved hjelp av ABI Prism 7900 Sequence D intern overvåkning av systemprogramvaren (Applied Biosystems).
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student
t
-UNDERSØKELSER når man sammenligner to grupper (PASW Statistikk 18.0), og p. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
