Abstract
Nyere studier understreker den viktige rollen microRNAs (miRNA) i utviklingen av lunge kreft. De viktigste regulatorer av miRNA biogenesis er ribonuklease drosha, dicer og Ago2. Her rollen til kjerneproteiner av miRNA biogenese maskineri i respons av humane ikke-små og småcellet carcinom cellelinjer for behandling med ioniserende stråling ble målt. Vi fant ut at drosha og dicer ble uttrykt på et høyere nivå i radioresistant men ikke i sensitive cellelinjer. Imidlertid, nedregulering av enten dicer eller drosha hadde ingen effekt på følsomheten av celler til bestråling. Eliminering av komponenter av RNA-indusert demping kompleks Ago2 og Tudor stafylokokk nuklease heller ikke sensibilisere celler til den samme behandling. Dermed er modulering av miRNA biogenesis maskiner ikke tilstrekkelig til å øke Radiosensitivity av lungesvulster og andre strategier er nødvendig for å bekjempe lungekreft
Citation. Surova O, Akbar NS, Zhivotovsky B (2012) Knock-Down av kjerne~~POS=TRUNC Proteiner Regulerings mikroRNA biogenesis har ingen effekt på følsomhet av lungekreft celler for ioniserende stråling. PLoS ONE 7 (3): e33134. doi: 10,1371 /journal.pone.0033134
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 29 november 2011; Godkjent: 05.02.2012; Publisert: 30 mars 2012
Copyright: © 2012 Surova et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra det svenske Vetenskapsrådet, svenske og Stockholm kreft Societies, den svenske Childhood Cancer Foundation, svensk Society for Medical Research, den russiske departementet for høy utdanning og forskning (11.G34.31.0006), EC FP- 6 (Chemores) samt FP7 (APO-SYS) programmer. OS ble støttet av et fellesskap fra det svenske instituttet og Karolinska Institutet og NA av Higher Education Commission of Pakistan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft (LC) er en ledende årsak til kreftdødelighet i verden i både kvinner og menn. Det finnes to hovedtyper av denne neoplasi, småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som varierer betydelig i sine histopatologiske egenskaper og reaksjoner på behandling. Ioniserende stråling, alene eller i kombinasjon med kirurgi eller kjemoterapi, er en effektiv behandling for mange kreftformer, inkludert LC. Men både indre og ervervet tumor radioresistance sterkt redusere effekten av strålebehandling for NSCLC og SCLC og ofte føre til tilbakefall og metastasering. Derfor er det av stor betydning for å utforske de molekylære mekanismene bak motstanden LC celler til stråling.
microRNAs (miRNA), ikke-protein koding, enkelt-strandet RNA av 19-25 nukleotider, utgjør en roman klasse av genet regulatorer og har blitt rapportert å spille en avgjørende rolle i krefttransformasjonen [1]. Nyere studier viste avvikende uttrykk for miRNAs i LC [2] – [5]. Produksjonen av miRNAs krever et sett av proteiner kollektivt referert til som miRNA maskiner. Avvikende ekspresjon av komponentene i miRNA maskiner har vært implisert i tumorgenese, inkludert LC [6], [7]. Oppregulering av dicer i lunge adenokarsinom og dens mulige rolle i utviklingen av perifere adenocarcinomer er blitt rapportert [7]. Høy ekspresjon av andre RNA-indusert stanse kompleks (RISC) proteiner, skjør X mental retardasjon syndrom-relaterte protein 1 (FXR1), Tudor-SN (TSN) og protein aktivator av interferon-indusert protein kinase (PACT), er blitt vist i SCLC [7]. En annen gruppe er beskrevet en sammenheng mellom redusert dicer uttrykk og dårlig prognose i LC pasienter [8]. Således er ytterligere undersøkelser er nødvendig for ytterligere å klargjøre rollen av miRNA maskineri i molekyl patogenesen av LC. Nylig har den potensielle terapeutiske effekten av dicer uttømming på kjemosensitivitet og spredning av brystkreftceller blitt rapportert. Den knock-down av dicer av siRNA førte til betydelig G1 arrest og økt følsomhet for DNA-ødeleggende middel, cisplatin, i brystkreftcellelinje MCF-7 [9]. Gitt de grunnleggende og flere biologiske roller mirnas i ulike cellulære prosesser, kan modulering av uttrykket av proteiner involvert i mirnas biogenesis være et lovende terapeutisk tilnærming for ytterligere klinisk anvendelse. Til dags dato er det ingen data om rollen miRNA produserende proteiner i resistensmekanismer /følsomheten LC celler til behandling. Derfor, undersøkte vi hvorvidt uttømming av kjerne proteiner involvert i mirnas biogenese påvirker motstanden av LC til radioterapi. Overraskende, knock-down av uttrykk for drosha, dicer, Argonaute2 og Tudor-SN av RNA interferens ikke øke følsomheten av NSCLC celler som var resistente mot behandling med ioniserende stråling.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC og behandlinger
Menneskelig NSCLC cellelinjer U1810, U1299 (begge fra UU samling), A549, H661, H157, H23 (alle fra ATCC); og SCLC-cellelinjer H69 (ECACC), H82 (ATCC), U1906, U1690, U2020, U1285 (alle fra UU samling) ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), glutamin ( 2 mM), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (alle oppnådd fra Gibco) ved 37 ° C, 5% CO
2 og 95% fuktighet. Celler ble utsatt for bestråling med en dose på 8 Gy å bruke en
60Co kilde (Karolinska Biomics Center, Karolinska universitetssykehus) for periodene angitt i figuren legender.
Evaluering av apoptose
Apoptose ble bestemt ved mengden celler i under G1 fase. Cellene ble trypsinisert og resuspendert i fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1% FBS. Totalt 1 × 10
6 celler ble brukt for analyse. Celler ble pelletert ved 2000 rpm og vasket en gang i PBS. Pelleten ble resuspendert i 250 ul iskald PBS og blandet med 2 ml iskald 70% etanol dråpevis under virvling. Prøvene ble oppbevart ved 4 ° C i 24 timer og deretter pelletert ved 2000 rpm og vasket to ganger med PBS. Etter siste vask ble cellene resuspendert i 360 ul PBS inneholdende 100 ug /ml RNase-A (Fermentas) og inkubert ved 37 ° C i 1 time. Førti ul av propidiumjodid oppløsning (lager ved 0,5 mg /ml) ble tilsatt til prøvene, etterfulgt av inkubasjon i 30 minutter ved romtemperatur med forsiktig svingende og beskyttelse mot lys. Cellene ble analysert ved strømningscytometri (FACScan, Becton Dickinson), og data ble evaluert ved hjelp av Cell quest programvare.
Caspase aktivitetsanalyse
celler ble vasket med iskald PBS, resuspendert i 25 ul PBS, lysert ved frysing i flytende nitrogen, inkubert med caspase-3-lignende substrat og analysert som tidligere beskrevet [10]. Caspase aktivitet ble uttrykt som fold økning i forhold til hensiktsmessige kontroller.
siRNA Transfeksjon
sirnas rettet mot menneskelig Dicer1, drosha, Argonaute2 og ikke-måls siRNA som en negativ kontroll ble innhentet fra Thermo Scientific Dharmacon® og lagret ved en konsentrasjon på 20 uM. Tjuefire timer før transfeksjon ble cellene sådd ut på 6-brønners plater i vekstmedium uten antibiotika. sirnas ble fortynnet i 100 mL RPMI 1640 medium (Gibco) og blandet med en mL DharmaFECT®1 siRNA Transfeksjon Reagens (Thermo Scientific Dharmacon®). Etter 20 min inkubasjon ble kompleksene tilsatt til cellene for å gi en sluttkonsentrasjon på siRNAs i mediet på 50 nM. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble mediet skiftet og cellene ble utsatt for stråling.
Western Blot Detection
Celler ble lysert ved hjelp Komplett lysis buffer (Roche) pluss proteasehemmer cocktail (PIC, komplett-M, Roche). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke BCA-proteinanalyse (Pierce). Etter blanding med Laemmli-buffer, ble prøvene underkastet SDS-PAGE og Western blotting. For immundeteksjon, ble de følgende antistoffer benyttet: anti-dicer, anti-spaltet PARP, anti-spaltet caspase-3, anti-spaltet caspase-9 (alt erholdt fra Cell Signaling Technology), anti-Ago2, anti-drosha (begge fra Millipore), anti-XPO5, anti-PRKRA (PACT) (begge fra Abnova), anti-FXR1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-β-aktin (Sigma-Aldrich), og anti-GAPDH (Trevigen). Pepperrot-peroksidase-merket anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer (Pierce) og en forbedret kjemiluminescens kit (Western blot deteksjonsreagensen, GE Healthcare UK Limited) ble anvendt for påvisning av anerkjente proteiner. Densitometrisk analyse for kvantifisering av det relative nivået av protein uttrykk ble utført ved hjelp av ImageJ programvare (https://rsbweb.nih.gov/ij/).
Real-Time Kvantitativ PCR
RNA var isolert fra celler ved hjelp av en PureLink ™ RNA Mini Kit (Invitrogen). Revers-transkribert cDNA fra prøvene ble anvendt som templater. Argonaute2 (Ago2 venstre ctaccttcccctggaggtctg og Ago2 høyre cgacctagcagtcgctctga) og 18S ribosomalt RNA (18S-1 cgctactaccgattggatggtt og 18S-2 agtcaagttcgaccgtcttctc) primere (Invitrogen) ble utviklet for å matche målet cDNA sekvensen. Tyve ng av revers-transkribert cDNA som templat, ble blandet med SYBR® grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) og amplifisert ved anvendelse av en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) med følgende program: 40 sykluser, hver syklus bestående av en denatureringstrinn ved 95 ° C i 15 s og en gløde /forlengelsestrinn ved 60 ° C i 1 min.
statistisk evaluering
resultatene fra tre uavhengige eksperimenter ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM Statistiske Evalueringen ble utført ved hjelp av en ikke-paret t-test.
Resultater
Uttrykk av proteiner involvert i miRNA Biogenesis i NSCLC og SCLC
For å identifisere molekylære mål for den bestrålingssensibilisering av LC celler blant proteiner involvert i miRNA biogenesis vi utført et protein uttrykk analyse av syv kjerne miRNA maskinkomponenter i et panel av NSCLC og SCLC (seks cellelinjer i hvert panel). For hvert LC subtype cellelinjer ble valgt på grunnlag av deres radiosensitiviteten, som målt ved fraksjonen overlevende etter eksponering for 2 Gy (SF2) i en klonogene overlevelsesanalyse, og gruppert i radiosensitive (RS) med SF2 0,3 Gy eller radioresistant (RR) med SF2 ≥ 0,3 Gy [11] – [14]. De basale nivåer av alle proteiner (drosha, dicer, exportin-5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), protein aktivator av interferon-indusert protein kinase (PACT), skjøre X mental retardasjon syndrom relaterte protein 1 (FXR1) og Argonaute2 (Ago2) ble vurdert av Western blot i alle valgte cellelinjer før bestråling (Figur 1a). Begge RNase III enzymer (drosha og dicer) ble uttrykt ved relativt høye nivåer i NSCLC celler sammenlignet med SCLC. Et medlem av karyopherins proteinfamilie, XPO5, som er involvert i den kjernefysiske eksport av mirnas, ble uttrykt på et høyere nivå i H661 mens lave nivåer av ekspresjon ble observert i H69 og U1690 i forhold til de gjenværende cellelinjer. Graden av ekspresjon av TSN, PACT, FXR1 og Ago2 proteiner varierte ikke dypt mellom de ulike cellelinjer, med unntak av H69, som oppviste lavere ekspresjon av alle de undersøkte proteiner. som vår panel besto av både RS og RR-celler, ble H23 cellelinjen valgt som representant for radiosensitive celler, ble og U1810 og H661 brukt som representanter for radioresistant celler i videre undersøkelser. Densitometrisk analyse av protein uttrykk avslørte at dicer, drosha og XPO5 ble uttrykt på et høyere nivå i RR celler sammenlignet med RS, mens det var ingen klar sammenheng mellom nivået av uttrykk for Ago2, TSN, PACT og FXR1 og SF2 verdier (Figur 1b) .
(A) Western blot-analyse av nivået av protein ekspresjon av drosha, dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), protein aktivator av interferon-indusert protein kinase (PACT), skjøre X mental retardasjon syndrom relaterte protein 1 (FXR1) og argonaute 2 (AGO2) i et panel av NSCLC (U1810, U1299, A549, H661, H157, H23) og SCLC (U1285, H82, H69, U1690, U1906, U2020 ) cellelinjer. (B) Densitometrisk analyse av relative nivåer av protein uttrykk i H23, H1299, U1810 og H661 cellelinjer. Cellelinjer fordelt etter Radiosensitivity, målt som andel overlevende på 2 Gy (SF2). Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-p-aktin antistoffer. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Effekt av ioniserende stråling på miRNA Machinery i NSCLC
For å undersøke hvilken rolle miRNA maskinkomponenter i responsen av LC celler til bestråling videre, to RR cellelinjer (U1810 og H661), og en RS linje (H23) fra panelet av NSCLC ble utsatt for gammabestråling og protein ekspresjon ble analysert 6, 24 og 48 timer etter behandling. Som forventet, ble massiv apoptotisk celledød observert i H23 i 6 timer etter ioniserende stråling, som bestemt ved spalting av PARP, mens H661 og U1810 responderte på behandling ved senere tidspunkter etter 24 og 48 timer, henholdsvis (figur 2). Ingen synlige forandringer i ekspresjon av enhver av de studerte proteiner ble påvist enten i RR eller RS-celler, som målt ved Western blot ved 6, 24 og 48 timer etter behandling IR (figur 2). Dermed gjør gammastråling ikke påvirke ekspresjon av kjerneproteiner av miRNA maskineri i NSCLC uavhengig av RR eller RS fenotype av disse kreftceller.
Spaltningen av PARP og nivået av ekspresjon av drosha, dicer, exportin 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), protein aktivator av interferon-indusert protein kinase (PACT), og skjøre X mental retardasjon syndrom relaterte protein 1 (FXR1) i U1810, H661 og H23 celler ble oppdaget av Western blot på 6, 24 og 48 timer etter bestråling med 8 Gy. Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-p-aktin antistoffer. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Knock-down hos Core proteiner involvert i det første trinnet av miRNA Biogenesis er ikke tilstrekkelig til å bevisstgjøre NSCLC Cells til Bestråling
Siden nivået av protein uttrykk på minst tre miRNA maskinkomponenter, dicer, drosha og XPO5, var positivt korrelert med radioresistance av NSCLC celler, kan det høye nivået av deres uttrykk bidra til kreftcellenes respons på behandling i en miRNA-guidet mote. For å utforske denne muligheten vi bestemte oss for å undersøke potensialet sensibiliserende virkning av nedregulering av dicer og drosha proteiner i U1810 cellelinje. Den kjernefysiske ribonuklease drosha og det cytoplasmatiske ribonuklease dicer er de to viktigste regulatorer av det første trinnet av miRNA produksjon og fremme spaltningen av lange primær transkripter i hårnål mellomprodukter (pre-mirnas) og påfølgende spaltning til modne mirnas. Således, ved å eliminere en av de to kjerneproteiner vi forventes å redusere miRNA produksjon og påvirker radioresistance av NSCLC-celler.
knock-down av dicer i U1810-celler ble utført ved anvendelse av RNA-interferens, hvoretter cellene ble kastes gammabestråling og analysert 48 timer etter behandling. Den komplette stanse av dicer protein uttrykk ble bekreftet ved Western blot før og etter bestråling (figur 3A). Nedregulering av dicer ble etterfulgt av redusert produksjon av flere mirnas (miR1301, miR1249, miR1227, miR532-3p, miR625, miR1827, miR324-5p) som vurderes av real-time PCR (data ikke vist). Men U1810 celler med utarmet dicer utstilt så sterk reaksjon på ioniserende stråling som gjorde villtype celler. Det var ingen forskjeller i spaltning av PARP mellom kontroll og dicer banket ned-celler (Figur 3A). Prosentandelen av apoptotiske celler etter bestråling var det samme i alle studerte gruppene (figur 3B). Analyse av aktivering av kaspaser viste at caspase-3 og -9 like ble behandlet etter bestråling og at caspase-3-lignende aktivitet var nesten identisk i både villtype og dicer-uttømte celler (figur 3A og C). En tilsvarende effekt på radioresistance var tydelig når drosha ble tømt i U1810 celler. Ingen endringer i PAPR spaltning (figur 3D) eller antallet av apoptotiske celler (figur 3E) ble påvist mellom kontroll og drosha banket ned-celler 48 timer etter ioniserende radiaiton. Lignende resultater ble oppnådd etter eliminering av dicer og drosha fra andre NSCLC-cellelinjer (figur S1 og S2). Alt i alt tyder disse data på at knock-down av enten dicer eller drosha var ikke tilstrekkelig til å sensibilisere NSCLC-celler til gammabestråling
(A) Nivået av dicer ekspresjon, spalting av PARP og behandling av kaspase-3 og. – 9 i U1810 celler transfektert (48 h) med kontroll (si SCR) eller dicer (siDicer) siRNA vurdert av Western blot 48 timer etter bestråling. Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-GAPDH antistoffer. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Påvisning av apoptotisk celledød i U1810 vurderes ved å måle sub-G1 befolkningen etter transfeksjon (48 h) med kontroll eller dicer siRNA og bestråling behandling (48 h). (C) Caspase-3-lignende aktivitet (ganger økning i forhold til kontroll) på U1810 celler etter behandling med enten bestråling alene eller i kombinasjon med transfeksjon av kontroll eller dicer siRNA (for detaljer, se Materialer og metoder). (D) Nivået av drosha ekspresjon og spaltning av PARP i U1810-celler transfektert (48 h) med kontroll (si scr) eller drosha (siDrosha) siRNA analysert ved hjelp av Western blot 48 timer etter behandling med bestråling. Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-GAPDH antistoffer. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) apoptotisk celledød i U1810 målt ved analyse av sub-populasjonen G1 etter transfeksjon (48 h) med kontroll eller drosha siRNA og bestrålingsbehandling (48 timer). Resultatene som vises er gjennomsnittet verdier ± S.E.M.. av tre uavhengige eksperimenter.
nedregulering av hovedkomponentene i RNA-induced Slå Complex (RISC) ikke bevisst NSCLC Cells til Bestråling
Siden uttømming av kjerne proteiner av første trinn i miRNA biogenese påvirket ikke Radiosensitivity av NSCLC, er det mulig at RNA interferens-mediert knock-down av enten dicer eller drosha resulterer i en betydelig reduksjon, men ikke den fulle tap, av modne miRNA grunn av den lange halv livet av modne molekyler. mirnas er stabile når de kommer inn i det effektor-komplekset. Derfor bestemte vi oss for å blokkere det andre steget i miRNA biogenesis av knock-down av de to viktigste komponentene i RISC, Argonaute2 og Tudor-SN, og dermed etablere sin rolle i radioresistance av LC celler. Den effektive nedregulering av ekspresjon av Ago2 i U1810 cellelinjen ble bekreftet ved å måle mRNA-ekspresjon, som ble redusert med opp til 95% etter transfeksjon med anti-Ago2 siRNA (figur 4A). Ikke desto mindre, den apoptotisk respons (målt ved PARP-spaltning og behandling av kaspase-3 og -9) som oppvises av Ago2-utarmet celler etter bestråling var så sterk som i villtype U1810 celler (figur 4B). I tillegg var det ingen signifikante endringer i andelen av sub-G1 befolkningen eller aktivering av caspase-3 etter ioniserende stråling, selv om begge parametere ble svakt redusert i Ago2-nedregulert celler sammenlignet med villtype celler (Figur 4C og D).
(A) nivået av Argonaute2 (AGO2) mRNA i U1810 celler transfektert med kontroll (scram) eller AGO2 siRNA normalisert mot 18S ribosomalt RNA. Resultatene er middelverdier ± S.E.M.. av tre uavhengige eksperimenter. (B) Spalting av PARP og behandling av kaspase-3 og -9 i U1810-celler transfektert (48 h) med kontroll (si scr) eller AGO2 siRNA, og deretter underkastet bestråling i 48 timer. Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-GAPDH antistoffer. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Bestemmelse av apoptotisk celledød i U1810 celler etter transfeksjon (48 h) med kontroll eller AGO2 siRNA og påfølgende behandling med bestråling (48 h). (D) Caspase-3-lignende aktivitet (ganger økning i forhold til kontroll) på U1810 celler etter behandling med enten bestråling alene eller i kombinasjon med transfeksjon med kontroll eller AGO2 siRNA. Alle resultater som er vist er middelverdier ± S.E.M.. av tre uavhengige eksperimenter.
Til slutt ble det samme sett av eksperimenter utført for å knock-down ekspresjon av en annen RISC komponent, Tudor-SN. I tillegg til sin funksjon som en komponent av komplekset multiprotein involvert i miRNA funksjon, er TSN kjent for å opptre som en transkripsjonen aktivator og oncogen i mange kreftformer. I tillegg er det spaltes i løpet av apoptose. Selv om betydelig nedregulering av ekspresjon ved hjelp av TSN siRNA ble oppnådd i U1810 celler, som vist ved Western blot-analyse, er banket ned celler oppviste lignende spaltning av PARP som villtypen ved ioniserende stråling behandling (figur 5A). Prosentandelen av apoptotiske celler ikke skiller mellom kontroll og TSN slått ned grupper etter bestråling (figur 5B). Lignende resultater ble oppnådd for to andre cellelinjer fra NSCLC panel (A549 og H661) etter ned-regulering av TSN (figur 5C og D).
Nivået av Tudor-SN ekspresjon og spaltning av PARP i U1810 (A), A549 (C) og H661 (D-celler) transfektert (48 h) med kontroll (si scr) eller Tudor-SN (si TSN) siRNA analysert ved hjelp av Western blot 48 timer etter bestråling. Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-GAPDH antistoffer. (B) Den apoptotiske celledød i U1810 celler etter transfeksjon med TSN siRNA og bestråling. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Strålebehandling er en viktig terapeutisk våpen i LC. Imidlertid er effektiviteten av denne type terapi begrenset av den innledende eller ervervet radioresistance av tumorcellene. NSCLC er preget av en lav tumor responsrate til bestråling og en 5-års overlevelse på bare 7% til 10% [15]. SCLCs utgangspunktet svarer godt til konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling, men utvikle ervervet kjemo- og radioresistance løpet av de neste tre til 12 måneder, og den samlede fem års overlevelse er bare 5% [16]. Mekanismene som fører til radioresistance av disse svulstene er ennå ikke fullt ut forstått.
mirnas har blitt rapportert å være potensielle diagnostiske eller terapeutiske mål i kreftbehandling, inkludert lungesvulster. Det er økende bevis for sammenhengen mellom miRNA uttrykket i tumorer og kjemo- og radiosensitiviteten, både med hensyn til å forutsi og modulerende følsomhet [17] – [20]. En fersk studie på NSCLC identifisert en undergruppe av miRNAs viser robuste endringer i uttrykk som svar på bestråling. Dermed gjør en global miRNA reaksjon finnes i alle tumorcellene, inkludert lungekreft, og mirnas kan være komponenter av cellulær respons overfor cytotoksiske fornærmelse [20]. Lignende funn angående endringer i global miRNA uttrykket ble rapportert etter kreft behandling med ulike cellegifter i ulike kreftcellelinjer og pasientprøver [21]. Ekspresjonen av de miRNA prosesseringskomponentene ble vist å bli deregulert i forskjellige humane cancere [8], [22], [23], og således kan bidra til tumorceller respons på behandling i en miRNA styrt måte eller uavhengig av RNA interferens veien. Nedregulering av dicer i MCF-7 brystkreftcellelinje ved siRNA ble vist å forårsake G1 rest og øke følsomheten for det DNA-ødeleggende middel, cisplatin, noe som tyder på at kombinasjonen av anti-dicer strategi og tradisjonell kjemoterapi kan forbedre effektiviteten av kreftbehandling [9]. En annen studie viste at dicer nedregulering kan øke den proliferative og invasive egenskaper av tumorceller in vitro og likeledes fremme subkutan tumor xenograft in vivo proliferasjon 24. Samlet disse data tyder på at miRNA maskiner spiller enten en negativ eller positiv rolle i tumor og transformasjon respons på behandling i ulike typer kreft. I denne studien ønsket vi å avklare rollen til miRNA BIOGENESIS komponenter i modulering av stråling respons i NSCLC og SCLC cellelinjer. For å identifisere molekylære mål for radiosensibilisering, protein ekspresjon analyse av syv kjerne proteiner av miRNA maskineri, drosha, dicer, XPO5, TSN, PACT, FXR1 og Ago2, ble utført i et panel av NSCLC og SCLC-cellelinjer. Våre funn viste høyere uttrykk av drosha og dicer proteiner i celler som er resistente mot stråling i forhold til sensitive linjer. Imidlertid knock-down av disse to essensielle proteiner ikke påvirke følsomheten av NSCLC-celler til behandling med gammastråling. Dette kan delvis skyldes den lange halveringstiden for modne miRNA. Flere studier har vist at RNA-interferens-mediert knock-down av drosha, XPO5-5 eller dicer resulterer i en betydelig reduksjon, men ikke den fulle tap, av modne miRNA [25] – [28]. Siden mirnas synes å være ganske stabile når de kommer inn i effektoren kompleks, vi utforsket muligheten for å øke radiosensitiviteten av lunge tumorceller ved uttømming av nedstrøms komponenter i miRNA biogenese vei, det vil si to hoved RISC-proteiner, Ago2 og Tudor-SN. Ikke desto mindre har nedregulering av disse proteinene ikke påvirke følsomheten av NSCLC-celler til behandling. I så fall kan det være alternative biogenese reaksjonsvei (er) som kan aktiveres ved brudd i en av de flere trinn i den kanoniske miRNA biogenese prosess. Noen mirnas ble funnet å være generert via en dicer-uavhengig biogenese vei: etter å ha blitt behandlet av drosha, kan pre-mirnas være direkte lastet til siden og spaltet ved siden katalytisk senter for å generere et mellomliggende 3` ende, som er videre trimmes [29]. Det er også en klasse av ikke-anerkjente mirnas som omgår drosha mikroprosessor, men likevel krever dicer for deres biogenese [30]. Det bør bemerkes at analyse av protein uttrykk for alle sentrale komponenter av miRNA maskiner i U1810 celler utført etter nedregulering av dicer, drosha, TSN eller Ago2 avdekket at ingen av de knock-downs hadde en signifikant effekt på uttrykk for andre proteiner i vei, det vil si vi ikke sett noen økning i uttrykket av miRNA maskinkomponenter etter knock-downs (Figur S3). På den annen side, en nylig undersøkelse utført på udødeliggjorte og primære endotelceller viste at global undertrykkelse av miRNA uttrykk oppnådd gjennom nedregulering av enten Ago2 eller dicer proteiner ved anvendelse av siRNA ført til økt celledød etter bestråling [31]. Dette indikerer at bidraget av miRNA maskiner til responsen på strålebehandling kan svært avhengig av celletype og være annerledes i normale celler og kreftceller.
En annen rapport viste at miRNA biogenesis er globalt indusert ved DNA-skader i en ataksi -telangiectasia mutert (ATM) kinase-avhengig måte i mus embryonale fibroblaster (MEFs) etter behandling med radiomime stoffet neocarcinostatin (NCS), som genererer dobbel tråd pauser (DSB sin). KH-type spleising regulatorisk protein (KSRP) ble funnet å være en sentral aktør som oversetter DNA-skader signale til miRNA biogenesis. ATM kinase binder direkte til og fosforylerer KSRP, som fører til økt samhandling mellom KSRP og pri-mirnas og økt KSRP aktivitet i miRNA behandling [32]. Enten KSRP er aktivert og bidrar til miRNA behandling i NSCLC på nedregulering av sentrale komponenter i maskineriet miRNA og behandling med gammastråling er fortsatt ikke avklart.
I tillegg er det kjent at de fleste mirnas har dusinvis til hundrevis av mål, og at målet mRNA kan binde flere miRNAs. Kanskje omfanget av reduksjonen i miRNA produksjon og aktivitet forårsaket av eliminering av et enkelt protein fra en miRNA veien er ikke nok til å påvirke de mekanismene som er ansvarlige for resistens av LC-celler til bestråling behandling. Med andre ord, er det sannsynlig at en virkelig påvirkning på radioresistance av NSCLC-celler via miRNA maskiner ikke kan oppnås ved eliminering av enkle proteiner fra den biogenese reaksjonsveien, og således ytterligere identifisering og målretting av denne mirnas som er involvert i responsen av LC celler overfor bestråling behandling er nødvendig.
i sammendraget, i det foreliggende studiet ekspresjonen av et sett av proteiner involvert i miRNA biogenese ble vurdert for første gang i et panel av humane LC cellelinjer. Selv om ekspresjonen av kjerneproteiner av miRNA pathway korrelert med motstanden av celler til strålebehandling, knock-down av disse proteiner var ikke tilstrekkelig til å utløse sensibilisering av LC-celler til denne type behandling. Dette tyder på at lungetumoren radioresistance ikke kan overvinnes ved modulering av miRNA biogenesis maskiner, og at andre strategier er nødvendig for å bekjempe lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
ekspresjon av dicer og PARP spalting i A549 og H661-celler transfektert med kontroll (si scr) eller dicer (si dicer) siRNA analysert ved hjelp av Western blot 48 timer etter behandling med bestråling (A). Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-GAPDH antistoffer. (B) apoptotisk celledød i A549 og H661-celler, målt ved analyse av sub-populasjonen G1 etter transfeksjon (48 h) med kontroll eller drosha siRNA og bestrålingsbehandling (48 timer)
doi:. 10,1371 /journal.pone. 0033134.s001
(TIF)
Figur S2.
Nivået av drosha og spaltet PARP i A549 (A) og H661 (C) celler etter knock-down av drosha. Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-GAPDH antistoffer. (B) Den prosentandelen av apoptotiske celler i A549 transfektert med drosha siRNA og behandlet med bestråling (48 h). . (D) Caspase-3-lignende aktivitet (ganger økning i forhold til kontroll) i H661-celler etter behandling med enten bestråling alene eller i kombinasjon med transfeksjon med kontroll eller drosha siRNA
doi: 10,1371 /journal.pone.0033134. S002 product: (TIF)
Figur S3.
nivå drosha, dicer, XPO5, TSN, PACT etter knock-down av dicer, drosha, TSN og Ago2 i U1810 celler. Lik lasting ble bekreftet ved hjelp anti-GAPDH antistoffer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033134.s003 plakater (TIF)
Takk
Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til Hogir Salim, Dali Zong og Birgitta Mörk (Karolinska Biomics Center, Department of Oncology-patologi, Karolinska Institutet) for teknisk assistanse.
