Abstract
Berberin, hentet fra kinesisk urtemedisin Coptis chinensis, har vist seg å ha anti -tumor aktiviteter. Men de underliggende mekanismene er ikke fullstendig klarlagt. Vår nåværende studien viste at berberin hemmet
in vitro Hotell og
in vivo
vekst, migrasjon /invasjon av CRC celler, via demping uttrykket nivåer av COX-2 /PGE
2, følgende ved å redusere fosforylering av JAK2 og STAT3, så vel som MMP-2 /-9 uttrykk. Vi videre avklart at en økning av COX-2 /PGE
2 uttrykk oppveie undertrykkende aktivitet av Berberin på JAK2 /STAT3 signalering, og en JAK2 hemmer AZD1480 blokkert effekten av COX-2 /PGE
2 på MMP- 2 /-9 uttrykk. Oppsummert Berberin hemmet CRC invasjon og metastasering via nedregulering av COX-2 /PGE
2 JAK2 /STAT3 signalveien
Citation. Liu X, Ji Q, Ye N, Sui H, Zhou L, Zhu H, et al. (2015) Berberine hemmer invasjon og metastasering av tykktarmskreft celler via COX-2 /PGE
2 Mediert JAK2 /STAT3 signalveien. PLoS ONE 10 (5): e0123478. doi: 10,1371 /journal.pone.0123478
Academic Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN
mottatt: 10 desember 2014; Godkjent: 18 februar 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (81303103, 81473478, 81303102) National Science and Technology Commission av Shanghai kommune (13ZR1461000, 14140901402) og Program for Shanghai Municipal Education Commission (13CG47, 13YZ045). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste menneskelige kreftformer, ranking den tredje for kreftforekomst i verden [1]. I dag er kirurgi det beste valget for behandling av CRC, men post-kirurgiske metastase rente er fortsatt høy, et resultat av invasjonen og migrasjon av CRC celler til svulsten omkringliggende vev og distale organer [2-3]. Derfor, for å blokkere CRC celle fra metastase er en viktig strategi for kreftterapi.
Berberin, et alkaloid isolert fra tradisjonell kinesisk medisin Coptischinensis, har anti-inflammary, anti-infeksiøse effekter og har vært brukt for å behandle diabetes og hypertensjon [4-6]. Sist, berberin ble funnet å ha anti-tumoraktivitet, via påvirker MMP-2 /-9 uttrykk [7-8], men den underliggende molekylære mekanismen fortsatt ukjent.
Tidligere studier har funnet at over ekspresjon av COX-2 korrelerer med CRC tumorgenese, ikke bare gjorde det fremme tumorcelle-proliferasjon og hemme apoptose, men også øke tumor angiogenese, tumorcellebinding, så vel som migrasjon /invasjon [9]. Prostaglandin E2 (PGE
2), den viktigste katalysert produkt av COX-2 fra arakidonsyre, spiller en nøkkelrolle i CRC tumorigenesis [10]. JAK2 /STAT3 signalveien er vedvarende aktivert i CRC, opp-regulerer uttrykket nivåer av nedstrømsgener så som MMP-2 /-9 noe som resulterer i økt kreftcellemigrering /invasjon og metastase [11-12]. Selv om bevisene samlet i prostata, lunge kreft og kolangiokarsinom attestert en nær sammenheng mellom aktiverte COX-2 /PGE
2 og JAK2 /Stat3 signalveier [13-15], slik sammenheng og dens betydning i CRC fortsatt trenger å bli belyst . Vår nåværende studien undersøkte mekanismen av den hemmende effekten av berberin på CRC invasjon og metastasering, og viste en signifikant rolle JAK2 /STAT3 og COX-2 /PGE
2 signalisering i disse prosessene.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
Den menneskelige tykktarmskreft SW620 og LoVo celler ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA, USA). SW620-celler ble dyrket i L-15-medium og LoVo-celler i F12K-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 g /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, ved 37 ° C, 5% CO
2, og høy luftfuktighet. Berberine ble kjøpt fra Aldrich-Sigma (St. Louis, Missouri, USA), ADZ1480, en JAK2 inhibitor, fra Selleck (Houston, Texas, USA). For
in vitro-studier
, Berberine ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) og frosset i alikvoter ved -80 ° C. For
in vivo eksperimenter
, Berberine ble suspendert i vann supplert med 0,5% natrium-karboksymetylcellulose (CMC-Na) og lagret ved 4 ° C. I tillegg ble DMSO og CMC-Na anvendt som bærerkontroll i hele studien. Antistoffene mot COX-2, p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9, β-aktin, og HRP-geit-anti-kanin-IgG, HRP-geit anti-mus IgG ble kjøpt fra Cell Signaling (Beverly, MA, USA).
Kliniske tilfeller
Menneskelige tykktarmskreft prøvene og matchet ikke-svulster kolon vevsprøver ble samlet ved kirurgisk reseksjon ved Shuguang Hospital, Shanghai Universitetet i tradisjonell kinesisk medisin. All forskning som omfatter mennesker deltakere har blitt godkjent av etikkomiteen av Shuguang Hospital, Shanghai Universitetet i tradisjonell kinesisk medisin, og alle kliniske undersøkelser har blitt utført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Alle pasienter som tilbys «skriftlig informert samtykke» til å delta i denne studien.
Celleviabilitet analyser
Menneske CRC celler (5 × 10
3) ble sådd ut på 96-brønners plate i 100 ul kulturmedier, etter festing, ble behandlet med berberin i doser på 0, 5, 10, 20, 40 og 80 pM. Ved 24, 48, 72 timer etter behandling, ble cellenes levedyktighet målt ved bruk av CCK-8 kit (Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble CCK-8-reagens tilsatt til cellene og inkubert i 4 timer, absorbans (OD) ble kvantifisert ved 490 nm med en referansebølgelengde på 630 nm. Celleviabilitet = (ODN-OD
0) /(ODC-OD
0) × 100%, OD
0. Blank, ODC, ubehandlet kontroll, ODN, berberin behandlet
xenograft mus modell
Mann BALB /C nakne mus, alder 4-6 måneder, veide 18 ± 2 g, ble kjøpt fra SLAC Lab Animal Co., Ltd (Shanghai, Kina, lisens nr. SCXK 2012-0002) og vedlikeholdes i henhold til patogen-frie vilkår for studiene. Alle dyr arbeidet er utført i henhold til Institutional Animal bruk og vedlikehold Committee of Shanghai Universitetet i tradisjonell kinesisk medisin, og all forskning ble godkjent av Shanghai Medical Experimental Animal Care-kommisjonen og i samsvar med bestemmelsen og generelle anbefaling av kinesiske forsøksdyr Administration Lovgivning. Som tidligere beskrevet [16], CRC-celler (1 x 10
6, i 0,2 ml PBS) ble injisert subkutant inn i flankene av nakne mus for å initiere tumorvekst. Når tumorer nå en gjennomsnittlig størrelse på 100 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i 5 grupper (6 mus pr gruppe): gruppe 1 mus: kontroll (CMC-Na); gruppe 2, 3, 4: oral gavaged berberin, ved 50, 100, 200 mg /kg /d, henholdsvis; gruppe 5: injisert intraperitonealt 5-FU, ved 50 mg /kg /2d. Kroppsvekten til dyrene og de to vinkelrette diametere (a og b) ble registrert hver 2 dager og tumorvolumet (TV) ble beregnet som: TV = ab
2/2. Musene ble avlivet etter 4 ukers behandling, og tumorene ble skåret ut og veiet. Tumoren inhibering ble beregnet som: (1-gjennomsnittlig tumorvekt av behandlede mus /gjennomsnittlig tumorvekt av kontrollmusene) x 100%. I mellomtiden, blod ble samlet inn for analyse av alanin transaminase (ALT), aspartattransaminase (AST), kreatinin (CT), urea nitrogen (FN) med ELISA kit (Bogoo, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner.
CRC lungemetastase musemodell
Eksperimentelle lungemetastaser av CRC ble indusert ved hjelp av injeksjoner av et enkeltcellesuspensjon av CRC-celler (1 x 10
6 i 0,2 ml PBS) inn i den laterale halevenen til nakne mus, som ble randomisert inn i 5 behandlingsgrupper som beskrevet i de xenograft studiene [17]. Musene ble avlivet etter 4 ukers behandling, ble organer lunge excised, fastsatt av formalin og parafin innebygd for videre analyse.
Histologi og immunhistokjemi (IHC)
De organer og svulsten var fjernet, fiksert med formalin, innebygd med parafin og delt [18]. IHC av COX-2 og p-STAT3 ble utført på 5-mikrometer seksjoner ved hjelp av antistoffer fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Bilder ble analysert og kvantifisert for den samlede verdien av optisk tetthet (IOD) for IHC positivitet av Image pro-plus 6,0 Software.
Cell migrasjon og invasjon analyser
En 24-brønns transwell plate (8 mm porestørrelse, Corning, NY, USA) ble anvendt for å måle hver cellelinje er trekkende og invasive egenskaper, som vi tidligere beskrevet [19]. CRC-celler ble behandlet ved berberin i 48 timer før den ble trypsinert og sådd ut i den øvre transwell kammer (2,5 x 10
4) i 1% FBS kulturmedium, med det nedre kammer inneholdende 600 ul media med 15% FBS og 10 ug /ml fibronektin. Tjuefire timer senere, ble de migrerte cellene fiksert med 95% alkohol, farget med krystallfiolett farging, analysert ved hjelp av mikroskop (Ti-E, Nikon, Tokyo, Japan). For invasjon assay, 100 ul fortynnet matrigel (100 ug /ml, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) ble først tilsatt til bunnen av transwell kammeret, den følgende prosedyren var den samme som migreringsanalyse, med unntak av de invaderende celler blir analysert etter 48 timer.
Western blot-analyse
cellelyse, proteinekstraksjon og Western blotting analyser ble utført som tidligere beskrevet [20]. Proteinprøver (20 ug) ble underkastet 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese, overført til en polyvinylidenedifluoride membran. Membranene ble blokkert i 5% ikke-fett tørrmelk-buffer (10 mmol /l Tris, pH 7,5, 100 mmol /l NaCl, 0,1% Tween 20), før den ble inkubert med primære og senere, sekundære antistoffer, og auto fotografert. Data fra de vestlige blot eksperimenter ble analysert ved Bio-Rad Antall En 1D Analysis programvare (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
luciferaserapportørplasmid analysen
Ved hjelp av vårt etablerte protokollen [ ,,,0],21], ble pGL3-basis COX-2-promoteren og en kontrollvektor PRL-SV40-celler transfektert inn i CRC. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble forskjellige doser av berberin lagt inn på cellene i ytterligere 48 timer. Deretter målinger av ildflue og
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter i cellelysatene ble utført ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega, Madison, USA). Resultatene ble angitt som forholdet for ildflue luciferase-aktivitet til
Renilla
luciferaseaktivitet i hver prøve utført in triplo ± SD.
ELISA
Etter å ha blitt behandlet med forskjellige konsentrasjoner av berberin i 48 timer, CRC-cellene ble gjen sådd ut på 24-brønners plater (5 x 10
4 i 0,5 ml kulturmedium). Førti-åtte timer senere ble kondisjonert medium samlet, sentrifugert (3000 rpm i 10 min), og målt for PGE
2 konsentrasjonen ved hjelp av en ELISA kit (Bogoo, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner.
over-ekspresjon og knockdown av COX-2-gen
CRC-celler ble transfektert med den pIRES2-COX-2 eller kontroll vektor pIRES2 ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ved å følge produsentens instruksjoner, og stabilt overekspresjon COX-2 eller kontrollvektor celler ble valgt med neomycin (G418, 1 mg /ml). For shRNA-mediert genet knockdown, CRC-celler ble Lipofectamine 2000 transfektert ved de Pfu-GW-RNAi plasmider som inneholder COX-2-spesifikke siRNA-sekvenser: 1: 5-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3, 2: 5-GCAGATGAAATACCAGTCTTT-3, eller den krafse sekvens: 5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3, og de transfekterte cellene ble selektert med neomycin. Effektiviteten av genet knockdown ble bestemt av kvantitativ real-time PCR og Western blot.
RNA ekstraksjon og sanntids kvantitativ analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol (Takara Bio Inc, Dalian, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Takara Bio Inc, Dalian, Kina). De følgende primere sekvenser ble anvendt for PCR-amplifikasjon: human COX-2 frem: 5′- GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 «, og omvendt: 5′- TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′, den TaqMan probe: 5»-FAM-TGGCAGGGTTGCTGGTGGTAG GA-3-TAMRA -3 «(Shine Gene, Shanghai, Kina); GAPDH fremover: 5»-CCACTCCTCCACCTTTGA C-3 «, og omvendt: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′; TaqMan probe: 5»-FAM-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3 «(Shine Gene, Shanghai, Kina). Real time PCR ble utført i Applied Biosystems 7300 System ved hjelp Premiks Ex Taq (Takara Bio Inc, Dalian, Kina).
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført med SPSS (versjon 18) programvare, data ble presentert som gjennomsnitt med standardavvik (SD), og statistikken sammenligning ble utført ved hjelp av t-test, enveis ANOVA analyse, Mann-Whitney test, eller Kruskal-Wallis test.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultat
1.Berberin hemmet cellevekst og migrasjon /invasjon av CRC in vitro og in vivo
Vi testet først hemmende effekt berberin på etablerte xenografttumorer på menneske CRC cellelinjer SW260 og LoVo i mus. Som vist i figur 1A og 1B, berberin induserte en tumorinhibering hastighet på 25,83% og 30,66% i SW620 og LoVo tumor, respektivt. I tillegg fikk mus behandlet berberin ikke har endret kroppsvekt og lever- og nyrefunksjoner forble normal (S1 figur og tabell S1), noe som tyder på ingen toksisitet av forbindelsen ved den testede konsentrasjon. Vi neste vist at berberin fortrengte
in vitro
cellevekst av disse to CRC-cellelinjer, med en IC50 på 54,41 uM for SW620 og 78,66 uM for LoVo, ved 48 timer etter behandlingen (figur 1C). Vi indikerte videre at berberin redusert lungemetastase av CRC-celler i en halevene-injeksjon induserte musemodell, i et medikament dose-avhengig måte (Fig 1 D).
In vitro
Transwell-studier bekreftet at berberin, ved medikamentkonsentrasjoner på 10, 20 og 40 uM, effektivt kan svekket evne til CRC-celler til å migrere og invadere (figur 1E).
A. Berberin hemmer CRC xenograft tumorvekst. Subkutant implantert svulster CRC cellelinje SW620 og LoVo ble behandlet med kontroll, 5-FU, og 3 doser berberin i 28 dager. Tumorvolumer i forskjellige grupper av mus ble registrert og presentert. B. xenografttumorer skåret ut fra mus behandlet med medisiner og varighet fremgår A. C. Berberin avtar CRC celleviabilitet
in vitro
. SW620 og LoVo-celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av berberin for 24, 48 og 72 timer. Middelverdi ± SE fra 5 replikater ble vist. D. Berberin reduserer CRC celle lunge metastaser hos mus. Mus med SW620 og LoVo celle lunge metastase ble behandlet med angitte variable berberin doser. Øvre panel: representant HE farget deler av mus lunge med CRC celle metastase foci. Nedre panel: antall CRC lungemetastase foci i kontroll og berberin behandlede mus. E. Berberin hemmer migrasjon og invasjon av CRC celler. Celle migrering og invasjon analyseresultatene av CRC-cellelinjer SW620 og LoVo, behandlet med berberin eller kontroll. Resultatene som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. Barene og feilfelt representerer gjennomsnitt ± SE, og
P
-verdi ble beregnet ved hjelp av en uavhengig
t
-test. **
P
0,01, kontroll vs behandlet;
##
P
0,01, kontroll vs behandlet
2.Berberin nedregulert uttrykket nivåer av COX-2 og PGE2 i CRC celler
.
Vi neste undersøkt de underliggende mekanismene for hemming av CRC celle migrasjon /invasjon av berberin. Vi begynte ved å finne at i SW620 og LoVo-celler, uttrykket nivåer av COX-2 og PGE
2 ble dempet med berberin i en medikamentdoseavhengig måte (figur 2A, 2B og 2D). Disse data ble bekreftet av en COX-2-promoteren luciferase reporter-analysen, noe som indikerer at aktiviteten av COX-2-promoteren ble undertrykt av berberin (figur 2C). For å støtte vår hypotese, gjennomførte vi COX-2 over utfoldelse og knockout eksperimenter som viser at økte nivåer av COX-2 protein up-krysset den vandrende /invasiv evne til CRC cellene mens COX-2-genet knockout av shRNA konstruere oppnådd motsatt effekt (figur 2E). Videre er tilsetningen av PGE
2, nedstrøms katalyserte produkt av COX-2, også forsterket grader av migrering og invasjon i CRC-celler (figur 2F).
A. og B. Ekstrakter fra SW620 og LoVo celler behandlet med berberin ved indikerte konsentrasjoner i 48 timer ble analysert for COX-2. C. SW620 og LoVo-celler ble transfektert med en COX-2-reporter-konstruksjonen og et tk
Renilla
konstruksjon (for transfeksjon /lasting kontroll) i 24 timer, behandlet med de angitte doser av berberin i ytterligere 48 timer, og ble lysert og utsatt for firefly og
Renilla
luciferase aktivitetsmålinger. Søylene viser fold induksjon over ikke-behandling (gjennomsnitt ± SE). D. Nivåer av PGE
2 i SW620 og LoVo-celler behandlet ved angitte doser av berberin i 48 timer ble målt ved hjelp av ELISA (middelverdier ± SE). CRC celle migrasjon og invasjon påvirkes av: E. Over utfoldelse eller knockdown av COX-2-genet; F. PGE
2. Resultatene som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. Barene og feilfelt representerer gjennomsnitt ± SE, og
P
-verdi ble beregnet ved hjelp av en uavhengig
t
-test. **
P
0,01, innvandringskontroll vs behandlet;
##
P
. 0,01, invasjon kontroll vs behandlet
3.Berberin hemmet JAK /STAT3 signalisering i CRC celler
For å avgrense mekanismen for dets hemmende effekt på CRC cellemigrering /invasjon, avlest vi påvirkning av berberin på celle signalveier. Vi har funnet berberin signifikant redusert fosforyleringen nivåer av JAK og STAT3 proteiner (pJAK2 og pSTAT3) i CRC-celler (figur 3A). Til sammenligning, ved hjelp av en JAK2 inhibitor (AZD1480), vi på lignende måte avskaffet pJAK2 og pSTAT3, noe som resulterer i den fuktede cellemigrering /invasjon nivåer av CRC-celler (figur 3B og 3C).
A. Utdrag fra SW620 og LoVo celler behandlet med berberin ved indikerte konsentrasjoner i 48 timer ble analysert for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 og beta-aktin (som lasting kontroll). B. JAK hemmer AZD1480 blokker JAK2 /STAT3 signalering. Ekstrakter fra SW620 og LoVo-celler behandlet med AZD1480 (5 uM) ble analysert for ekspresjon av pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 og beta-aktin. C. AZD1480 hemmer migrasjon og invasjon av CRC celler. Resultatene som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. Barene og feilfelt representerer gjennomsnitt ± SE, og
P
-verdi ble beregnet ved hjelp av en uavhengig
t
-test. **
P
0,01, innvandringskontroll vs behandlet;
##
P
0,01, invasjon kontroll vs behandlet
4.Elevated uttrykk nivåer av COX-2 og pSTAT3 korrelert med tumorinvasjon og metastase i primær menneske. CRC
Immunhistokjemisk (IHC) analyse av primære CRC eksempler illustrerer at uttrykket nivåer av COX-2 og pSTAT3 var signifikant høyere i CRC-vev, sammenlignet med de tilstøtende normale vev (figur 4A og tabell 1). Som det kan sees i tabellene 2 og 3, var det en sterk korrelasjon mellom tilstedeværelsen av COX-2 eller pSTAT3 med graden av differensiering, graden av invasjon og metastase, og Duke oppsetning. COX-2 og pSTAT3 positivitet på IHC ikke korrelerer med pasientens alder, kjønn og tumorstørrelse. Overlevelsen var signifikant lenger i COX-2-lav uttrykker pasienter versus COX-2-høy seg, men ingen sammenheng mellom pSTAT3 nivåer og pasient overlevelse (figur 4B).
A. Eksempler på CRC vevsprøver farget for COX-2 og pSTAT3 vises. B. Expression nivåer av COX-2 og pSTAT3 korrelerer ikke med CRC pasientenes overlevelse.
5.COX-2 /PGE2 regulert JAK2 /STAT3 signale i CRC celler
Vi neste over-uttrykt COX-2 protein i CRC SW620 og LoVo celler ved transfeksjon, og funnet økte nivåer av pJAK2 og pSTAT3, og redusert uttrykk nivåer av MMP-2, MMP-9, som er transcriptionally regulert nedstrøms JAK2 /STAT3 signalering; på den annen side, shRNA konstruksjonen mediert COX-2-gen knockdown trukket i motsatt retning (fig 5A og 5B). Tilsetningen av PGE
2 ligand til CRC-cellene aktiveres av JAK2 /STAT3 signalering og ekspresjon av MMP-2 /-9 (figur 5C og 5D) betydelig. Basert på disse dataene, hypotese vi at aktivert COX-2 /PGE
2 akse forbedret JAK2 /STAT3 signalveien, oppregulert uttrykket nivåer av MMP-2 /-9, som fører til økt metastatisk potensial for CRC celler.
A. og B. Ekstrakter fra SW620 og LoVo celler transfektert med COX-2 over-uttrykk eller shRNA konstruksjon ble analysert for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 og beta-aktin. C. og D. Utdrag fra SW620 og LoVo celler behandlet med PGE
2 for angitte varig ble analysert for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 og beta-aktin.
6.Berberin hemmet CRC celle invasjon og metastasering via undertrykke COX-2 /PGE2 /JAK2 /STAT3 signaliserer akse
Med våre data viser berberin hemme COX-2 /PGE
2 uttrykk og JAK2 /STAT3 signalering, så vel som COX-2 /PGE
2 regulerende JAK2 /STAT3 vei, vi antatt at mekanismen for berberin sin hemmende virkning på CRC invasivitet og metastatisk potensiale ble sin negative innflytelse på signaleringsaksen for COX-2 /PGE
2-JAK2 /STAT3. For å teste denne teorien vår, behandlet vi CRC celler ved hjelp JAK2 hemmer AZD1480, og fant uttrykk for MMP-2 /-9 var «frikoblet» fra COX-2 og PGE
2, dvs. verken overekspresjon av COX-2 heller ikke tilsetning av ligand PGE
2 kunne øke protein nivåene av MMP-2 /-9 (fig 6A og 6C). Omvendt, med AZD1480 blokkering JAK2 /STAT3 signalering, berberin hadde ingen effekt på MMP-2 /-9-ekspresjonsnivåer (figur 6B og 6D).
A. og B. Trekker ut fra SW620 celler behandlet med AZD1480 i 2 timer, transfektert med COX-2 over-ekspresjon konstruere i 24 timer, behandlet med berberin (40 uM) i 48 timer, ble analysert for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP -2, MMP-9 og beta-aktin. C og D. Utdrag fra SW620 celler behandlet med AZD1480 i 2 timer, behandlet med berberin (40 mm) eller PGE
2 (5 mm) for 48 timer, ble analysert for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP- 2, MMP-9 og beta-aktin.
Diskusjoner
Invasivitet og metastasering, karakteristikk av ondartede svulster, er de viktigste årsakene til at kreft terapi mot CRC mislykkes. Derfor finne frem til nye metastase-målsøkende anti-tumor medikamenter synes å være sannsynlig for å øke overlevelsen av CRC pasienter. Blir brukt mer og mer i klinikken, har tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har vist seg å være et viktig alternativ behandlingsalternativ for CRC, foruten kirurgi og kjemoterapi [22]. Med akkumulere dokumentasjon som viser at TCM er svært effektiv behandling av kreft, er det stadig viktig og nødvendig å studere mekanismene bak anti-tumor aktivitet av TCM og deres komponenter. Berberin, et alkaloid isolert fra TCM urt Coptis chinensis, har vist seg å ha anti-tumor effekt i behandling av CRC, lever, bryst, prostata og lunge cancer [23-27]. I vår nåværende studie, presenterte vi
in vitro Hotell og
in vivo
data avgrense berberin indusert hemming av CRC cellevekst, migrasjon /invasjon og metastasering, videre, vi utforsket understreking mekanisme.
Tidligere studier har vist at COX-2, det hastighetsbegrensende enzym som katalyserer omdannelsen av arachidonsyre til PGE
2, over-uttrykker i tumorvev på flere maligniteter, inkludert CRC. Som nedstrøms effektor av COX-2, PGE
2 fremmer tumor angiogenese, cellevekst, migrasjon /invasjon, og immune evasion. Derfor PGE
2 er fortsatt en viktig faktor på tumorigenesis. Epidemiologiske bevis har antydet at langsiktig, kunne rutine å ta av COX-2-hemmer som NSAIDs (nonsteroidal anti-inflammatorisk narkotika) redusere 50% av CRC forekomst [28-29]. Våre resultater viste at berberin hemmet uttrykket nivåer av COX-2 og PGE
2 i CRC-celler, i overensstemmelse med dataene Singh et al funnet i melanomceller behandlet med berberin [30]. Dermed vil berberin være så effektiv som NSAIDs for å redusere forekomsten CRC? Dette vil være et veldig interessant tema for fremtidige studier, spesielt på den mekanismen som berberin verker i CRC celler.
JAK2 /STAT3 signalveien er vedvarende aktivert i lunge, bryst kreft og i CRC [31-32 ]. Under normal fysiologisk tilstand, JAK2 /STAT3 signalveien midlertidig aktivert. Vekstfaktorer og cytokiner binde seg til sine reseptorer på celleoverflaten for å aktivere JAK2, som i sin tur fosforylerer tyrosin-rest 705 (Tyr705) av STAT3 protein for å aktivere den (pSTAT3). pSTAT3 danner homodimerer eller heterodiers, translocates inn i kjernen, transaktiverer uttrykket nivåer av Cyclin D1, VEGF og MMP-2 /-9-gener [33-36], hvis proteinprodukter som er involvert i reguleringen av tumorcellevekst, apoptose, angiogenese og metastasering. Det var allerede vist ved studier i nasopharyngeal kreft og diabetes sykdom som berberin blokkerte JAK2 /STAT3 signaliserer [37-38], og vår nåværende data har lagt til en annen del av bevis hevde hemmende effekt berberin på JAK2 /STAT3 aktivisering samt ekspresjon av nedstrøms målgener MMP-2 /-9 i CRC -. dette sannsynligvis er en del av den biologiske mekanismen av berberin anti-tumor effekt
Siden våre data slås at berberin påvirket både COX-2 /PGE
2 og JAK2 /Stat3 signalveier, vi videre undersøkt protein nivåer av COX-2 og pSTAT3 i grunnskolen CRC prøver, og avhørt noen tilknytning og regulatorisk sammenheng mellom disse 2 viktige spillere. I samsvar med andre forskeres observasjon av en nær sammenheng mellom aktivert COX-2 /PGE
2 og JAK2 /STAT3 signalveier i prostata, lunge kreft og kolangiokarsinom [13-15], oppdaget vi, i menneskelige CRC vev, høyere beløp av COX-2 og pSTAT3, som i betydelig grad korrelert med hverandre, og samlet begge var assosiert med høyere grad av tumor invasivitet og metastase. Neste vår in vitro studier avdekket at COX-2 /PGE
2 regulert CRC celle migrasjon /invasjon prosessen gjennom JAK2 /STAT3 signalering, og over-uttrykk for COX-2 og PGE
2 reversert den hemmende virkningen av berberin på JAK2 /STAT3 aktivisering og kreftcelle mobilitet. Videre avslørte vi at AZD1480, en JAK2 inhibitor /STAT3 aktivering blocker [39-40], frikoblet COX-2 /PGE 2 og berberin
fra å påvirke uttrykket nivåer av MMP-2 /-9. Disse funnene av oss opplyste COX-2 /PGE
2-JAK2 /STAT3 signalkaskade som stoffet mål for berberin å formidle sin effekt på CRC invasivitet og metastasering. I sammendraget, reduserer berberin COX-2 /PGE
2 nivåer, som igjen demper JAK2 /STAT3 aktivisering, noe som fører til redusert uttrykk av nedstrøms målgener MMP-2 /-9, noe som resulterer i mindre invasivitet og metastase i CRC (Fig 7 ). Denne rapporten av oss har gitt et viktig sett med pre-kliniske data for fremtiden utstrakte bruken av berberin i behandling av CRC.
PGE2, hoved katalysert produkt av COX-2 fra arakidonsyre, kan binde seg til EP -reseptoren på cellemembranen, for derved å aktivere den JAK2, etterfulgt av phorphorylating av STAT3 i Tyr705 området. Den aktiverte p-STAT3 danner homo-eller heterodimerer, som translocate inn i kjernen, binder seg til den nedstrøms målgenet MMP-2, MMP-9, og akselerere tumorprogresjon. Hemme COX-2 /PGE2 formidlet JAK2 /STAT3 signalveien, kan være en av mekanismene for hemmende effekt berberin på invasjon og metastasering i tykk- og endetarmskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Berberin hemmer CRC cellevekst og metastasering.
Kroppsvekt av mus, kontroll
vs
berberin gruppe. Behandling med berberin har liten virkning på mus kroppsvekt. Ingen signifikant forskjell mellom dyr behandlet med berberin ved dose på 200 mg /kg per dag og kontrolldyrene. Viste data som middel ± SD. B. Representative leverprøver fra kontroll- og berberin mus ble behandlet og farging av HE. Resultatene som vises er representative for tre uavhengige eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123478.s001 plakater (TIF)
S1 Table. Effekt av berberin på lever- og nyrefunksjoner (betyr ± SD)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123478.s002 plakater (DOC)
