Abstract
Innledning
microRNAs spille en viktig rolle i mange menneskelige kreftformer; så langt, forblir deres uttrykk for å bli studert i øvre urinveis urothelial kreft (UUTUC).
Materialer og metoder
uttrykk for elleve microRNAs (MIR-10A, MIR-21, speil 96, MIR-135, MIR-141, MIR-182, MIR-200b, MIR-205, MIR-429, MIR-520b, MIR-1244) tidligere vist å være oppregulert i urothelial blærekreft ble undersøkt i tilsvarende normal og kreft vevsprøver av pasienter som gjennomgår nephroureterectomy for UUTUC. Oppregulert microRNAs ble så målt i serumprøver av pasienter med UUTUC og pasienter med non-maligne urologiske sykdommer å vurdere deres potensial som ikke-invasive biomarkører for UUTUC.
Resultater
mikroRNA uttrykk tillatt differensiering av normal og kreftvev: Mir-21, MIR-96, MIR-135, MIR-141, MIR-182, MIR-205, MIR-429 og MIR-520b ble betydelig overuttrykt. Videre ble MIR-205 oppregulert i dårlig differensiert UUTUC. Analysen av sirkulerende RNA i serum, viste en økning av MIR-141 hos pasienter med UUTUC; mottageroperatøren karakteristisk analyse viste et område under kurven fra 0,726 til MIR-141 som et diagnostisk biomarkør. Videre har vi observert lavere nivåer av MIR-10a og MIR-135 i UUTUC pasienter.
Konklusjoner
mikroRNA uttrykk endres i UUTUC. Analysen av sirkulerende MIR-141 kan være nyttig for å identifisere pasienter med UUTUC
Citation. Kriebel S, Schmidt D, Holdenrieder S, Goltz D, Kristiansen G, Moritz R, et al. (2015) Analyse av Tissue og Serum mikroRNA Expression Pasienter med Øvre urinveis uroteliale Cancer. PLoS ONE 10 (1): e0117284. doi: 10,1371 /journal.pone.0117284
Academic Redaktør: Georgios Gakis, Eberhard-Karls-universitetet, TYSKLAND
mottatt: 13 april 2014; Godkjent: 20 desember 2014; Publisert: 28 januar 2015
Copyright: © 2015 Kriebel et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. samlingen av serum og vevsprøver på Universitätsklinikum Bonn ble utført innenfor rammen av Biobank initiativ ved Centrum für integrierte Onkologie (CIO) Köln Bonn ( https://www.cio-koelnbonn.de/mediziner/biobank/), som er støttet av Deutsche Krebshilfe. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
urothelial karsinom er en av de mest vanlige humane ondartede sykdommer [1]; 5-10% av disse uroteliale karsinom er plassert i øvre urinveier (UUTUC, pyelocaliceal hulrom og ureter). Selv om etiologien av UUTUC og blærekreft er lik, naturhistorie i UUTUC forskjellig fra blærekreft: UUTUC er ofte invasive ved diagnose, og dermed prognosen er dårligere. Flere prognostiske faktorer (dvs. stadium, klasse, lymfeknute invasjonen, lymphovascular invasjon, tumor plassering) har blitt identifisert [2]. Likevel gjenstår den forutsigelse av det kliniske forløpet av en bestemt pasient vanskelig, da alle av de ovenfor nevnte faktorer kan bare bestemmes postoperativt. Identifiseringen av en preoperativ markør, dvs. et serum biomarkør, vil være nyttig for å gi bedre risikovurderingen [3].
microRNAs er små, ikke-kodende RNA-molekyler, som modifiserer uttrykket av mange menneskelige gener og dermed regulerer viktige cellefunksjoner som cellesyklus, utvikling, apoptose, differensiering og [4]. Expression profilering studier viste tumor-spesifikke mikroRNA uttrykk. En fersk studie viste forskjellige mikroRNA uttrykk profiler i normal nyre vev, UUTUC og nyrecellekarsinom imidlertid UUTUC ble ikke sammenlignet med normal urothelial vev [5]. Gitt likheter av UUTUC og urothelial kreft i blæren, er det sannsynlig at mikroRNA uttrykk er tilsvarende endret. MicroRNAs kan påvises i en rekke kroppsvæsker inkludert serum [6]. Stabiliteten mot nedbrytning av RNases og ytre påvirkninger (pH-endring, lagring, fryse /tining) kvalifiserer sirkulerende microRNAs som ikke-invasive biomarkører [7,8]. Som en konsekvens er serum microRNAs blitt undersøkt i mange ondartede sykdommer (for eksempel kreft i blære [9], nyrekreft [10], prostatakreft [11], testikkelkreft [12]).
For å undersøke rolle microRNAs som ikke-invasive biomarkører hos pasienter med UUTUC, uttrykk for elleve microRNAs (MIR-10A, MIR-21, MIR-96, MIR-135, MIR-141, MIR-182, MIR-200b, MIR-205 , MIR-429, MIR-520b, MIR-1244) tidligere vist å være oppregulert i urothelial kreft i blæren [13-20], ble analysert [11] i tilsvarende normal ureter og UUTUC vev. Deretter undersøkte vi serumnivåene av disse satsings microRNAs med høyest oppregulering hos pasienter med UUTUC og pasienter med ikke-maligne urologiske sykdommer, for å utforske deres diagnostiske /prognostisk potensial.
Materialer og metoder
2,1. Prøvetaking
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver enkelt og studien ble godkjent av den lokale etikkutvalg (godkjenningsnummer: 036/08 og 049/13). Prøveinnsamlingen ble gjennomført fra 2005-2012 (vev) og 2008-2013 (serum). De kliniske-patologiske parametere av studiekohorten er gitt i tabell 1.
2,2. Vevsprøver
mikroRNA nivåer i kreft vevsprøver fra 47 pasienter som gjennomgår nephroureterectomy ved Institutt for Urologi ved Universitetssykehuset Bonn ble undersøkt. Histologisk normal urinleder vev var tilgjengelig fra 36 av disse pasientene. Prøvene ble fiksert i formalin, innstøpt i parafinvoks og arkivert i Institutt for patologi ved Universitetssykehuset Bonn.
Ved hjelp av en mikrotom, 5 til 10 seksjoner (20 pm) ble produsert fra hver parafin blokk. Seksjonene ble neddykket i oppvarmet vann og plassert på objektglass. Etter tørking i 24 timer, ble prøvene deparaffinized ved bruk av xylol og fortynningsserie av etanol. På grunnlag av hematoksylin-eosin fargede seksjoner, av hvilke tumor og normalt vev var merket på forhånd, ble en makro-disseksjon gjort, segregerende svulsten og tilstøtende prøver normale urothelial vev (mer enn 1 cm fra hverandre)
. Total RNA ble deretter ekstrahert med RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) som anbefalt av produsenten. Den endelige elueringsvolumet var 50 mL. Kvantitet og renhet av RNA ble bestemt ved bruk av Nanodrop 2000 spektrofotometer (PeqLab, Erlangen, Tyskland). Revers transkripsjon ble utført ved å bruke miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger instruksjoner med 400 ng RNA (fortynnet i et totalvolum på 12 ul). cDNA ble til slutt fortynnet til en konsentrasjon på 5 ng /pl i HiSpec-buffer.
2,3. Serumprøver
Vi prospektivt samlet blodprøver ved urologiske avdelinger ved universitetssykehusene Bonn (n = 10) og Münster (n = 34). Serumprøver ble håndtert i henhold til standard driftsprosedyrer av biobanken tiltak. Som en kontroll ble en alder tilpasset kohort av 34 individer med ikke-maligne sykdommer (benign prostata hyperplasi, urinrørsstriktur, inkontinens, urin stein) som gjennomgår mindre urologiske operasjoner ble anvendt. Veneblod ble tatt i serum S-Monovette Gel rør med koagulering aktivator (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) før operasjonen. Etter et minimum på 60 minutter ble koagulert serum sentrifugert (10 min, 2500 g), separert og lagret i cryotubes ved -80 ° C inntil bruk.
Total RNA ble isolert fra 400 mL serum ved hjelp av Mirvana PARIS Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), etter tilsetting av 25 fmol av syntetisk miRNA cel-MIR-39 (Qiagen, Hilden, Tyskland) som gjør at en kvantifisering av RNA isolering effektivitet. Ekstraksjonen ble utført ved å følge produsentens protokoll. Endelig elueringsvolum var 50ul. Revers transkripsjon ble gjort ved hjelp av miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Før real-time PCR, ble en preamplification gjort for å få tilstrekkelig materiale (miScript preamp PCR Kit, Qiagen, Hilden, Tyskland), som foreløpige tester viste at serum mikroRNA nivået var for lavt for direkte kvantifisering. Den preamplification ble utført i henhold til produsentens protokoll ved anvendelse av følgende betingelser: sykling Innledende aktiveringstrinn (95 ° C, 15 minutter), to-trinns sykling (denaturering 94 ° C i 30 sekunder, annealing og forlengelsen 60 ° C i 3 minutter) med 12 sykluser.
2,4. Kvantitativ real-time PCR
Alle PCR eksperimenter ble utført i tre eksemplarer med 10 mL hver på en ABIPrism 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i 384 brønners plater ved hjelp av miScript SYBR Grønn PCR Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Alle PCR primere ble kjøpt fra Qiagen. Hvert forsøk omfattet cellelinjen RT112 som positiv kontroll, så vel som vann, ikke-RT, TE-buffer og genomisk DNA som negative kontroller (preamplified for serum PCR-løper). En seriell fortynning av RT112 tillatt oss å måle den PCR-amplifisering effektiviteten av hver PCR-run. PCR ble utført i henhold til følgende protokoll: 1.Hot Start (95 ° C, 15 minutter), 2.Denaturation (94 ° C, 15 sekunder), 3.Annealing (55 ° C, 30 sekunder), 4.Extension (70 ° C, 30 sekunder). Hvert forsøk bestod av 40 sykluser med trinn 2 til 4. Smelte kurve analyse bekrefter spesifisiteten av PCR-produktene. MikroRNA nivåer i prøvene med CK verdier 35 ble vurdert som null; uteliggere med Cq forskjell i triplicates 1 ble ekskludert. PCR-data ble analysert med SDS Relativ Kvantifisering programvare v2.4 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og QBase + v2.5 (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgia). De individuelle mikroRNA uttrykk data leveres i S1 Table (vev studien) og S2 Table (serum studien).
mikroRNA uttrykk i vev ble normalisert mot RNU1-4, SNORD43 og SNORD48. MikroRNA ekspresjon i serum ble normalisert mot RNU1-4 og SNORD43, som SNORD48 ikke kunne måles på en pålitelig måte i serum. Egnetheten av disse RNAer som referanse-genet ble påvist tidligere, [21].
2,5. Statistisk analyse
Mann-Whitney-U test og Kruskal-Wallis-test ble brukt til å evaluere forskjeller mellom kreftpasienter og friske kontroller og å knytte mikroRNA uttrykk med kliniske-patologiske parametere, som passer. Mottaker Operator Curve (ROC) analyser ble utført for å bestemme sensitivitet og spesifisitet microRNAs som diagnostiske biomarkører; den Youden Indeksen ble brukt til å identifisere den optimale terskelen. Statistisk signifikans ble avsluttet ved p 0,05, og Bonferroni korreksjon for multippel hypotesetesting ble utført (vev forsøk p 0,0045, serum forsøk p 0,0063). Unsupervised toveis hierarkisk klyngeanalyse med euklidske avstanden ble utført for å klassifisere tumor og normale prøver uroteliale vev. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS statistikk V21 (IBM, Chicago, Illinois, USA).
Resultater
3.1 Analyse av mikroRNA uttrykk i øvre urinveis urothelial kreftvev
mikroRNA uttrykket er ikke undersøkt i UUTUC vev så langt. Vi bestemte dermed uttrykk for elleve microRNAs tidligere vist seg å være overuttrykt i urothelial blærekreft i 47 UUTUC vevsprøver og 36 tilsvarende prøver av histologisk normale urinlederne. Vi observerte en betydelig overekspresjon av MIR-21, MIR-96, MIR-135, MIR-141, MIR-182, MIR-205, MIR-429, MIR-520b (alle p 0,001) i UUTUC; den microRNAs MIR-10a (p = 0,012) og Mir-200b (p = 0,006) viste en tydelig trend mot oppregulering, mens MIR-1244 (p = 0,600) var lik i normal og ondartet vev. MIR-205 (p = 0,002) ble oppregulert i udifferensiert UUTUC (G3 vs. G2 /G1). Se fig. 1.
log2-fold-endringen ble brukt til å konstruere heatmap som indikerer at en mikroRNA uttrykk profilering tillater differensiering av normal ureter og urothelial karsinom vev. Prøvene fra normal urothelial vev er kodet med «N», kreftprøver med «T». Boksplott diagrammer viser relative nivåer av hvert mål mikroRNA.
3.2 Analyse av sirkulerende serum microRNAs i øvre urinveiskreftpasienter
Vi neste undersøkt serumnivå av søker microRNAs identifisert under vev profilering: serumprøver fra pasienter med UUTUC (n = 44) sammenlignet med pasienter med ikke-maligne urologiske sykdommer (n = 34) ble behandlet ved to tertiære henvisning klinikker ble undersøkt. De mikroRNA uttrykk nivåer i serum er vist i fig. 2. MIR-141 ble sirkulert til vesentlig høyere nivåer (p 0,001) i serum av UUTUC pasienter enn hos kontrollpersonene (gjennomsnittlig 1,30 vs 0,69). ROC analyse viste en AUC på 0,726 (95% konfidensintervall 0,609 til 0,843) for MIR-141 som diagnostisk biomarkør; se fig. 3 og Tabell 2. MIR-200b (p = 0,041), MIR-205 (p = 0,008), MIR-425 (p = 0,025), MIR-96 (0,013) viste en trend mot høyere nivåer i kreftpasienter, men p-verdien var 0,0065 som ble definert som signifikansnivå etter korreksjon for multippel hypotesetesting. MIR-182 (p = 0,083), MIR-21 (p = 0,532) og Mir-135 (p = 0,261) var lik i UUTUC pasienter og kontroller.
Mann-Whitney-U test ble brukt til å evaluere forskjeller mellom gruppene.
Så, vi korrelert serum mikroRNA nivåer med klinisk-patologiske parametere. Serum MIR-10a (p = 0,003) ble redusert i muskel-invasiv UUTUC (PTA /PT1: 1,79 vs. pT2-4: 0,79). MIR-135 viste også en trend mot lavere nivåer i kreftpasienter med muskel-invasiv tumorer (2,18 vs 0,96, p = 0,040). Vi observerte ikke en sammenheng med alder, kjønn, metastaser eller gradering (alle p 0,05). Og sirkulerende mikroRNA nivåer
Diskusjoner
Interessen mikroRNA økt dramatisk de siste årene, og vev og tumorspesifikke ekspresjonsprofiler er blitt karakterisert. Gitt likheter av urothelial kreft i blære og øvre urinveier, utførte vi et litteratursøk for å identifisere et sett av feilregulert microRNAs i blærekreft [13-19] som er av interesse for uttrykk profilering i UUTUC vev og serumprøver. Helt nylig har vev mikroRNA ekspresjonsprofiler i UUTUC blitt publisert [5,22]: imidlertid antallet UUTUC prøver (n = 5) var svært liten, og ikke i forhold til normalt vev urothelial [5], eller undersøkelsen var begrenset til ondartede prøver [22].
Vi først observert at microRNAs ekspresjonsprofiler tillatt særtkreft og normale ureter /nyrebekken prøver med høy nøyaktighet. Spesielt MIR-21, MIR-96, MIR-135, MIR-141, MIR-182, MIR-205, MIR-429 og MIR-520b ble tydelig overexpressed i UUTUC. Interessant, dette delvis overlapper med mikroRNA uttrykk profilen tidligere etablert i en studie av prostatakreft, der MIR-205, MIR-96 og MIR-182 ble funnet spesielt regulert [23]. Vi kunne også bekrefte lignende molekylær kreftutvikling av urothelial kreft i blære og øvre urinveiene som oppregulering av mange microRNAs tidligere identifisert som oncomirs i blærekreft ble også sett i UUTUC [13-19]. Nylig, Zaravinos et al. [20] undersøkte mikroRNA uttrykk i normale nyrevevet og nyresvulster (nyrecellekarsinom og UUTUC): 21 microRNAs ble spesielt deregulert i UUTUC (5 microRNAs oppregulert og 16 microRNAs downregulated-the UUTUC profilen var forskjellig fra vår målgruppe microRNAs); MIR-10a, MIR-200b og MIR-205 ble oppregulert i forhold til nyrevevet. Det skal bemerkes at mangel på normal urothelial vev som hensiktsmessig kontroll begrenser informasjonsverdi (urothelium spesifikk ekspresjon er ikke kontrollert) [20].
neste undersøkt serumnivåene av disse microRNAs i et to-senter -cohort av pasienter med UUTUC og ikke-maligne sykdommer. Vi observerte en signifikant økning av MIR-141 i UUTUC pasienter: gjennomsnittlig nivå var nesten dobbelt så høy sammenlignet med kontroller; flere andre kandidater (MIR-200b, MIR-205, MIR-425 og MIR-96) viste også en trend mot økte nivåer i UUTUC pasienter. ROC-analyser viste at MIR-141 lov til å skille UUTUC pasienter og kontroller med en AUC på 0,726 (sensitivitet 71% og spesifisitet 74%) som indikerer at sirkulerende MIR-141 er et egnet diagnostisk biomarkør. Så langt vi kjenner til, er dette den første beskrivelsen av en nukleinsyre biomarkør i blodet hos pasienter med UUTUC. I en tidligere studie på pasienter med urothelial blærekreft, ikke ble det observert en signifikant økning av MIR-141 i serum av kreftpasienter, selv om en trend mot høyere MIR-141 nivåer sammenlignet med kontrollpersoner kan bli sett [9]. Stage og klasse kan forklare denne forskjellen: Det ble observert høy serum MIR-141 nivåer i mange studier i avanserte stadier [24,25] eller pasienter med tilbakefall etter operasjon [25-27]; Men MIR-141 ble ikke korrelert med noen prognostisk parameter i vår studie på UUTUC. Funnet av økt urin MIR-141 nivåer i blærekreftpasienter støtter tanken om MIR-141 som et diagnostisk verktøy [28]. Det skal bemerkes at sirkulerende MIR-141 nivåer er forhøyet i flere tumortyper inkludert prostata kreft [25], tykktarmskreft [29] og livmorhalskreft [30]. En overekspresjon av MIR-141 er involvert i KEAP1 regulert cisplatin motstand [31], og dermed MIR-141 målinger kan være nyttig for overvåking av pasienter som gjennomgår kjemoterapi cisplatin for metastatisk UUTUC. Den TarBase 6.0 [32], en database med eksperimentelt validerte mikroRNA-genet interaksjoner, indikerer at MIR-141 regulerer ulike gener (for eksempel PTEN [33], ERBB2IP [34], HOXB5 [34], E2F3 [33], cyclin D1 [33]) som er involvert i urothelial kreftutvikling (databasespørring. 06-03-2014)
vev nivåer MIR-205 ble også korrelert med udifferensiert UUTUC, og MIR-10a og MIR-135 ble redusert i serum av pasienter med muskel-invasiv UUTUC. Tumor klasse og scenen er vanligvis korrelert i urothelial kreft, og dermed en forventer signifikante sammenhenger med stadium (MIR-205) eller Karakter (MIR-10a, MIR-135), henholdsvis. Flere forklaringer er mulige:
(i)
visse biologiske prosesser indusere mikroRNA endringer i senere stadier av kreftutvikling; (
ii
) tre (av ti) pasienter med ikke-muskel invasiv sykdom hadde G3 svulster, og dermed begrense korrelasjon på scenen og klasse; og (
iii
) et funn ved en tilfeldighet kan ikke utelukkes. Således kunne analysen av microRNAs være nyttige for prognostiske formål, selv om fremtidige studier er nødvendig for å bekrefte resultatene. Spesielt, ble MIR-205 [35] og MIR-10a [36] er forbundet med overlevelsestiden hos pasienter med blærekreft. Den siste rapporten fra Izquierdo et al. indikerer at MIR-149 nivåer i svulstvev er prediktive for kreftspesifikk overlevelse hos pasienter med UUTUC [22]; en analyse av dette mikroRNA i serum i en fremtidig studie ville være av interesse. Men MIR-149 var ikke påvises i serum av verken en pasient med prostatakreft eller en sunn emne, selv om en preamplification skritt ble ansatt i henhold til Mitchell et al. [37], som konkluderte med at MIR-149 nivåer i blodprøver er for lav til å oppdage
En roman biomarkør må bevise seg mot etablerte markører.; urincytologi hos pasienter som lider av en dårlig følsomhet [38], selv hos pasienter med høy grad UUTUC. Inkludering av konjunktiv markører (BTA stat test [39] eller FISH [40]) nærmer kan øke den diagnostiske informasjon betydelig, men lav grad av kreft er fortsatt vanskelig å oppdage. Ytelsen til serum MIR-141 ser ut til å være noe lavere sammenlignet med urin markører (sensitivitet 71%, spesifisitet 74%), men tilsvarende oppdagelsen priser i muskel-invasiv og ikke-muskel invasiv UUTUC rettferdiggjøre fremtidig forskning å utforske sin verdi.
Noen begrensninger bør anerkjennes: vi sammenlignet mikroRNA uttrykk i kreft og tilstøtende normalt vev. Selv om det normale vev var histologisk normale og plassert minst 1 cm fjernt fra svulsten, kan den såkalte «felt-effekt» forårsake molekylære forandringer i denne kontrollvevet. Imidlertid sammenligningen av ondartet og normalt vev fra de samme pasientene minimerer effekten av inter mikroRNA uttrykk forskjeller. Størrelsen på utvalget i vår studie var bare moderate (47 kreft vs. 36 normalt vev, og 44 UUTUC vs. 34 kontroll serumprøver), men den relative sjeldenhet av UUTUC forhold til blærekreft eller nyrecellekarsinom gjøre analyse av store kohorter vanskelig .
Konklusjoner
mikroRNA uttrykk dysregulerte i UUTUC vev; disse endringene føre til endrede mikroRNA profiler i pasientenes sirkulasjon. Påvisning av økt MIR-141 nivåer tillater identifikasjon av pasienter med UUTUC; hvis fremtidige studier bekrefter dette funnet, kan måling av serum microRNAs hjelpe klinikere til å håndtere disse pasientene.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Oppsummering av vev mikroRNA uttrykk nivåer hos pasienter med øvre urinveis urothelial kreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0117284.s001 plakater (XLSX)
S2 Table. Oppsummering av serum mikroRNA uttrykk nivåer hos pasienter med øvre urinveis urothelial kreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0117284.s002 plakater (XLSX)
Takk
Vi takker Jennifer Bräunig for kritisk lesing av manuskriptet.
