Abstract
Til tross for tidligere studier som viser kjennetegn ved tykktarmskreft stamceller (CCSCs) og rollen som epithelial -mesenchymal overgang (EMT) i tumor utvikling, er det fortsatt kontroversielt som forholdet mellom CCSCs og EMT. I denne studien, for å kunne presentere et innblikk i dette forholdet i tykktarmskreft, utviklet vi HCT116 og HT29 sfære modeller, som er kjent for å være cellene berikende kreftstamceller. Sammenlignet med sine foreldre kolleger, sfæroide cellene vises nederst homotypisk /heterotypic vedheft men høyere in vitro trekkfugl /invasiv kapasitet, samt høyere tumorigent og metastatisk potensial in vivo. De sfæroide Cellene også vist nedregulert E-cadherin og oppregulert α-SMA og vimentin uttrykk, som er typisk fenotypen av EMT. For å undersøke om dette fenomenet er knyttet til aktivering av Wnt /β-catenin vei, vi har oppdaget flere nøkkelsignalmolekyler. Sammenlignet med sine foreldre celler, HCT116 og HT29 sfæroide celler demonstrert nedregulert uttrykk for GSK3P, men oppregulert uttrykk for Slug og snegl. Og også, opp-regulering av kjernen β-catenin i sfæroide celler indikerte at den frie β-catenin overført fra cytoplasma til cellekjernen. Våre funn tyder på at sfæroide celler har karakteristikkene av tykktarm kreft stamceller, og EMT kan forklare deres stemness og malignitet. Og vedvarende aktivering av Wnt /β-catenin veien kan spille en viktig rolle i EMT av CCSCs
Citation:. Han X-Y, Wei B, Fang J-F, Zhang S, Zhang F-C, Zhang H-B, et al. (2013) Epitelial-Mesenchymale Transition Associates med vedlikehold av Stemness i spheroid-avledet stilk-Like Colon kreft celler. PLoS ONE 8 (9): e73341. doi: 10,1371 /journal.pone.0073341
Redaktør: Giovanni Camussi, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: May 26, 2013; Godkjent: 29 juli 2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science Foundation National of China (No. 81000960), Key prosjekt Foundation Science of Guangdong-provinsen (nr 10251008901000011) og grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (No. 12ykpy42). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis, og den 5-års relativ overlevelse er bare 53,8 til 65,2% til tross for diagnostiske og terapeutiske fremskritt [1], [2]. Tumorresidiv og metastasering er to viktige overlevelses-påvirkende faktorer av tykk- og endetarmskreft (CRC). Det er en økende forståelse for at epitelial-mesenkymale overgang (EMT) bidrar til tumorinvasjon og metastase [3], [4]. Som vi alle vet, er EMT en svært konservert cellular program som lar polariserte, godt differensierte epitelceller til å konvertere til upolarisert bevegelige mesenchymalceller. Denne prosess anses å fremme tykktarmskreftcelle for å invadere basalmembranen og den omgivende mikromiljøet, slik som lymfe og blod vaskulære systemer, til slutt bidra til intra eller ekstravase [5].
Nylig økende bevis tyder på at startfasen og metastaser er avhengig av en liten sub-populasjon av tumorceller betegnet kreft stamceller (cscs) som bærer uendelig selvfornyelse potensial og evnen til å differensiere til forskjellige populasjoner som omfatter en tumor [6], [7], [8] , [9]. Ifølge denne modellen, kreft stamceller opprettkreftutvikling, angiogenese, metastaser, og gjentakelse prosessen med kolorektal kreft [10]. Med andre ord, kreft stamceller er ansvarlig for malignitet av tykktarmskreft. Men hvordan gjør de kreftstamceller opprettholde sin stemness, for eksempel evne til migrasjon, invasjon og metastasering? Mange forskere observert at noen kreftceller (for eksempel brystkreft, tykktarmskreft, etc.) kan oppnå de samme egenskapene som kreft stamceller gjennom epitelial-mesenkymale overgang [11], [12], [13], [14]. Det vil si, EMT kan tildele kreftcelle stammen lignende bionomics, noe som indikerer at EMT kan delta i vedlikehold av stemness av CCSC. Men den detaljerte forhold mellom kreft stamceller og EMT ikke har blitt rapportert. Samtidig utbredt aktivering av Wnt /β-catenin signalveien i sporadisk CRC, er relevant for EMT [15]. Den aktuelle studien hadde som mål å demonstrere hvis bionomics av tykktarmskreft stamceller og vedlikehold av stemness er relatert med EMT eller ikke, og illustrere rollen Wnt /β-catenin signalveien i denne prosessen.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle eksperimenter som involverer menneskelige deltakere (inkludert innsamling av menneskelige tykktarmskreftprøver) har blitt godkjent av det medisinske forskningsetiske komité for Sun Yat-sen-universitetet, og gjennomført i henhold til prinsippene uttrykt i Helsinkideklarasjonen. Alle deltakerne i studien signert informert samtykke former. Og alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer. Og dette prosjektet ble godkjent av Medical Research dyreetikk Committee of Sun Yat-sen-universitetet.
Cell kultur
HCT116 (ATCC, CCL-247) og HT29 (ATCC, HTB-38) koloncancercellelinjer ble holdt i DMEM /F12 supplert med 10% FBS, 200 U /ml penicillin og 200 ug /ml streptomycin. Tumorsphere media (også kalt serumfritt medium, SFM) besto av DMEM /F12 media supplert med 1 x B27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), rutine insulin (5 ug /ml, Invitrogen), 200 U /ml penicillin og 200 ug /ml streptomycin. For 3D flytende kultur, ble HCT116 og HT29-celler dyrket i to-dimensjonal monolag spaltet med trypsin, resuspendert og deretter sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
6 celler i SFM i 100 mm ultralave feste retter (Corning) i 37 ° C i en fuktet 5% CO2 /95% luft atmosfære.
Påvisning av CD133 uttrykk ved flowcytometri
celler avledet fra monolags kulturer og opphengskuler på dag 7 etter primærkulturen var påvist for ekspresjon av CD133. Cellene ble vasket to ganger i kald PBS, og deretter cellesuspensjon ble inkubert ved 4 ° C med 1:10 FITC-konjugert musemonoklonalt antihumant CD133 antistoff (Ab, Miltenyi Biotec) i 45 minutter i mørket. Etter inkubasjon ble cellene vasket to ganger i kald PBS med 1% BSA og resuspendert i 400 ul kald PBS med 1% BSA i strømningscytometri-analyse i løpet av en time (h).
Immunofluorescence farving
den anti-Lgr5 Ab (Abcam), anti-CK20 Ab, anti-E-cadherin Ab, anti-β-catenin Ab, anti-α-SMA-Ab og anti-vimentin Ab (Santa Cruz Bioteknologi) ble fremstilt i henhold til produsentens protokoller. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,05% Triton X-100 i PBS ved romtemperatur i 20 min. Prøvene ble blokkert med 1% bovint serumalbumin (Sigma) og inkubert med passende primært antistoff ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking i stor utstrekning, ble de inkubert med Alexa Fluor-488 geit-anti-mus IgG (Invitrogen) eller Fluor-Cy3 geit-anti-kanin-IgG (Jackson Immunoresearch) ved 37 ° C i 1 time. Kontra av kjerner med DAPI (Invitrogen) ble også utført. Cellene ble deretter vasket og montert for observasjon under et scanning konfokalt mikroskop (LSM-710, Zeiss). Her, i hele dette manuskriptet, data fra minst tre uavhengige eksperimenter har blitt analysert for å kontrollere reproduserbarheten av resultatene.
homogenitet og heterogenitet adhesjonsassayet
adhesjon evnen til cellene til ECM ble testet ved hjelp av fibronektin (FN)-belagte 96-brønners plater (Corning). Enkeltcellesuspensjoner av sfæroide og adherente celler ble sådd ut (10
5 /brønn) og inkubert ved 37 ° C i 2 timer, deretter vasket med PBS for å fjerne ikke-klebende celler. Delt OD på 570 nm bølgelengde var fast bestemt på å gjenspeile de FN-heftende celler ved hjelp av celletelling Kit-8 (Dojindo, Japan). Adhesjonen av celler evne til homogene-celler ble testet ved anvendelse av monolagscellene-asfalterte 96-brønners plater. Sfæroide og adherente celler ble sådd ut på 10
5 per brønn, og inkubert ved 37 ° C i 60 min, 90 min og 120 min. Da de ikke-klebende celler ble talt opp og homotypisk lim aktivitet ble beregnet ved hjelp av formelen:. Homotypisk vedheft (%) = (total celle nummer – ikke-klebende celler) /total celler x 100%
Migrasjon og invasjon analyser
Migrasjon og invasjonen ble utført i 24-brønners Transwell kamre med 8 mikrometer-pore polykarbonat filterinnsatser (Corning). Totalt 5 × 10
4 eller 10
5 dissosiert spheroid eller heftende celler ble sådd på ubestrøket eller Matrigel-belagte innstikk i 100 ul serumfritt medium innsatser for migrasjon eller invasjon analyser hhv. De nedre kamre ble fylt med 0,5 ml 10% FBS-supplert DMEM /F12-medium. Etter 24 timer og /eller 48 timer ble cellene på oversiden av filteret fjernet og cellene på den nedre overflate av innsatsen ble fiksert og farget med krystallfiolett. Antallet fargede celler ble tellet under et lysmikroskop. Analysene ble utført i tre paralleller.
Western blot analyse
GSK3p, β-catenin, Slug, og Snail uttrykk ble analysert totalt celleekstrakter eller i nucleus ekstrakter adskilt med 10% SDS-polyakrylamidgel elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid membran (Millipore). Membranene ble vasket i Tris-bufret saltvann med Tween (TBST, bestående av 10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20), blokkert i 1 time ved romtemperatur med 5% fettfri melk i TBST deretter probet 1 time ved romtemperatur med anti-E-cadherin Ab, anti-α-SMA Ab, anti-vimentin Ab, anti-GSK3P Ab, anti-β-catenin Ab, anti-sneglen Ab (Santa Cruz Bioteknologi), anti -Slug Ab (BD Pharmingen), anti-α-Tublin Ab og anti-GAPDH Ab (Peprotech). Etter inkubasjon med pepperrot peroksyd-konjugert sekundært antistoff, ble immunoreaktive proteiner påvist ved ECL-deteksjonssystem (Millipore). Kvantitative analyser av immunoblottingforsøk signalene ble innhentet via densitometry analyse ved hjelp LAS4000 Bilde programvare (Fuji Film). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av BCA protein assay kit (ThermoScientific biovitenskap).
In vivo tumorigenesis
For å avgjøre om sfæroide celler er mer tumorigent enn sine tilhenger kolleger i vivo, vi gjennomført svulst utvikling og levermetastaser eksperimenter. Enkle celler ble resuspendert i PBS. En 100 ul suspensjon inneholdende 2 x 10
6 adherente celler eller sfæroide-celler ble injisert subkutant (s.c.) inn i flankene av 4- til 6-uker gamle hann BALB /c-nu mus, erholdt fra Jackson Laboratory. Subkutane Tumordiametere ble målt med en digital caliper hver to eller tre dager, og tumorvolumet i mm
3 ble beregnet ved hjelp av formelen: Volum = bredde
2 × lengde × 0,52. Deretter 3 eller 4 uker senere, ble musene drept og frosne vevssnitt (6 mikrometer) av subkutane svulster ble gjort for patologisk deteksjon.
In vivo levermetastaser
Liver metastatisk modellen ble brukt til å bestemme metastatisk potensial for sfæroide celler. Levermetastaser ble etablert av intrasplenic injeksjon av 4 × 10
6 HCT116 celleklump eller heft celler og splenektomi ble utført 10 min etter intrasplenic injeksjon for å unngå milt metastaser. Den generelle helsetilstand ble registrert i detalj én gang om dagen. Levermetastaser foci ble undersøkt og målt. Og vev seksjon ble gjort for hematoxylin-eosin-farging for å bekrefte den patologiske kilden.
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble bestemt ved enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc-test for multiple sammenligninger eller t-test. For alle tester, P 0,05 eller 0,01 ble ansett som statistisk signifikant eller svært viktig
Resultater
morfologiske og biologisk karakterisering av colonospheres
Når dyrket i serumfritt medium. supplert med 1 x B27, 20 ng /ml EGF og 10 ng /ml bFGF, både HCT116 og HT29 kolon kreftceller vokser i store runde, ufestede flytende sfæroide kolonier (betegnet colonospheres) (figur 1). Morfologisk, normal polaritet av heftende celler forsvant i colonspheres. Deretter bestemmes vi frekvensen av kule-dannende celler ved å foreta en ekstrem begrensende fortynning analyse (ELDA) for paren og sfæroide-avledet HCT-116-celler. Frekvensen for å danne colonsphere ble funnet å være 5,5 ganger høyere i sfæroide celle enn foreldrecellelinje, noe som indikerer at den sfæroide cellen hadde høyere fornye seg selv kapasitet.
Både HCT116 og HT29 kan danne store runde med løs flytende colonsphere på 50-100 um når dyrket i SFM. FCM-analyse viste at CD133 ekspresjon stiger fra ≤1.2% opp til 60% -80% når de dyrkes i SFM. Og sterkt ekspresjonen av Lgr5 ble påvist ved immunfluorescens farging. Men som markør for differensiert epitelceller, CK20 uttrykk presenteres negativ endring.
De sfæroide cellene viste økt uttrykk for tykktarms CSC markører-CD133 og Lgr5, men svekket uttrykk for differensiert epitelceller markør CK20 forhold til deres tilsvarende foreldre celler. Andelen av de CD133 positive celler ble bestemt ved flow-cytometri i paren og sfæroide celler, ble de funnet å være mer enn 80% i colonospheres, i motsetning til ≤1% observert i parencellelinjer (figur 1). Når colonospheres ble utsatt for immunofluorescens farging for Lgr5, observerte vi lys Lgr5 flekker på overflaten av hver kuleformet celle som indikerer tilstedeværelse av cscs i colonosphere (figur 1). Resultatene tyder på at cscs ble effektivt beriket i colonospheres. For multippel-differensiering analysen ble de sfæroide cellene overført serumholdig medium. Deretter fenotypen ble påvist etter 4 ukers kultur. Og vi har observert at de sfæroide cellene på nytt festet til plasten og skiftet til adherente celler morfologisk, sammen med nedregulert CD133 /Lgr5 ekspresjon og oppregulert CK20 (ikke vist). Resultatene tyder på at sfæroide celler har kapasitet multi-differensiering [10].
spheroid celler vise lavere adhesjon men høyere in vitro trekkfugl /invasiv kapasitet
For å underbygge ondartet profil av den oppnådde kolon kreft sfæroide celler, gjennomførte vi in vitro analyser for å vurdere vedheft og vandrende /invasiv kapasitet på sfæroide celler i sammenligning med sine tilhenger kolleger. Resultatene av celleadhesjon assay demonstrert at sfæroide celler har lavere kapasitet for både adhesjon til FN (en av hovedkomponentene ECM) og adhesjon til sine naboer homogene, sammenlignet med deres parentale celler (figur 2A og 2B).
sfæroid-celler har lavere kapasitet på begge adhesjon til FN (A) og til deres homogene naboer (B), sammenlignet med foreldre motstykker. HCT116 /HT29 sfæroide celler viste en 3,8 ganger (p 0,01) og 4 ganger (p 0,001) vekst i kjemotaktisk potensialet ved 24 timer (C). Flere sfæroide celler var i stand til å invadere Matrigel i forhold til foreldre motstykker (p 0,001 og p 0,05, henholdsvis, D).
Vi fant at sfæroide celler viser en betydelig økning i celle motilitet ved hjelp Transwell migrasjon kamre. HCT116 /HT29 sfæroide celler viste en 3,8 ganger (p 0,01) og 4 ganger (p 0,001) vekst i kjemotaktisk potensialet ved 24 timer henholdsvis, sammenlignet med sine motparter adherente (figur 2C). Og også, betydelig flere HCT116 /HT29 sfæroide cellene var i stand til å invadere Matrigel-belagte innstikk i Transwell migrasjon kamre enn foreldre kolleger (p 0,001 og p 0,05, henholdsvis) (figur 2D). Disse resultatene indikerer at tykktarmskreft sfæroide celler, sammenlignet med sine motparter adherente er utstyrt med lavere adhesjon, og høyere vandrings /invasiv kapasitet, en funksjonell fenotype assosiert med tumor aggressivitet.
sfæroide celler ha høyere tumorigent og metastatisk potensiale vivo
For å avgjøre om sfæroide cellene er mer tumorigent og metastatisk enn sine tilhenger kolleger i vivo, vi gjennomført svulst utvikling og levermetastaser eksperimenter. Når 2 x 10
6-celler ble inokulert subkutant i nakne mus, alle musene utviklet tumorer. Transplanterte svulster ble bekreftet som tykktarm kreft med hematoksylin-eosin farging. Og volumene av subkutane tumorer i sfæroide celler gruppene var signifikant høyere enn den for adherente celler grupper (figur 3A, 3B og 3C).
Volumene av subkutan tumor i HCT116-celler sfæroide gruppe var betydelig høyere enn det i HCT116-celler gruppe (A, B). HT29-celler sfæroide viste lignende resultater (C). De HCT116 sfæroide celler utviklet mer levermetastaser enn HCT116 (D, F). Metastatiske svulster ble bekreftet som tykktarm kreft med hematoksylin-eosin-farging (E).
Som levermetastaser var bekymret, fire mus (4/5) utviklet levermetastaser i HCT116 spheroid celler gruppe, men bare en mus (1/5) gjorde i vedheftende gruppe (figur 3D). Metastatiske svulster ble også bekreftet som tykktarm kreft med hematoksylin-eosin-farging (figur 3E). Resultatet av levermetastaser telling viser lignende resultater (figur 3F). De samlede betingelser for musene i sfæroide celler gruppen er dårligere enn de som er i vedheftende celler gruppe, og noen av dem er utviklet ascites og alvorlig avmagring. Resultatene av in vivo eksperimenter vist at sfæroide-deriverte celler ha høyere tumorigen og metastaserende kapasiteter enn sine foreldre kolleger.
EMT-fenotype av sfæroide celler assosiert med Wnt /β-catenin signalveien
for å demonstrere om det var sammenheng mellom ondartede profiler av sfæroide celler og EMT, vi har oppdaget deres EMT-fenotype. Resultatene av IF og Western blotting viste at nedregulering av E-cadherin ekspresjon og oppregulering av α-SMA og vimentin ekspresjon i HCT116 og HT29 colonospheres, sammenlignet med deres parentale celler (figur 4 og 5). Det vil si, de sfæroide celler har de karakteristiske for mesenchymale celler. Aktiveringen av Wnt /β-catenin veien er rapportert å indusere EMT [16], [17]. Deretter nøkkelmolekyler i Wnt /β-catenin veien ble oppdaget ved hjelp av Western blotting. Sammenlignet med foreldreceller, HCT116 og HT29-celler sfæroide demonstrert nedregulering av ekspresjon GSK3P, men opp-regulering av Slug og snegle uttrykk. Og også, opp-regulering av kjernen β-catenin ekspresjon i sfæroide celler indikerte at den frie β-catenin overføring fra cytoplasma til cellekjernen (figur 5).
Representative mikrofotografier som viser høyere ekspresjon av E-cadherin og membranen lokalisering av β-catenin i HCT116 og HT-29 adherente celler enn de tilsvarende sfæroide celler ved immunfluorescens farging. Og høyere uttrykk av vimentin i sfæroide celler ble påvist sammenligne med heftende celler.
Wnt /β-catenin signale konstitutivt aktivert i sfæroide celler, inkludert oppregulert uttrykk for vimentin, Slug, sneglen, og kjernefysisk β-catenin, men nedregulert uttrykk for E-cadherin og GSK3p, sammenligne med de tilsvarende foreldrecellene.
Diskusjoner
begrepet svulst heterogenitet, som antas det ble ulike fenotyper i svulstvev, ble først foreslått av Fidler IJ på 70 s av forrige århundre [18]. Kreft stamcelle teorien ble formet basert på dette konseptet. Cancer stamceller har blitt definert som «celler i en svulst som besitter evnen til selvfornyelse og som kan føre til at heterogene linjer av kreftceller som utgjør svulst» på en nylig American Association of Cancer Research (AACR) workshop [19] . Opp til nå, ble eksistensen av kreft stamceller bekreftet i flere faste tumorer. Og den siste identifisering av tykktarmskreft tumor initiere celler legger ytterligere støtte til kreftstamcelle hypotese [7]. Ifølge denne teorien, den lille undergruppe av kreft stamcelle bærer hele karakteristisk for malignitet, inkludert invasjon og metastasering.
Det var flere metoder for å få kreft stamceller. Den mye brukt metode for å isolere eller berike tykktarm kreft stamceller er celle sortering basert på celleoverflatemarkører som CD133, CD44, Musasai-en, etc [20]. Deretter ble de fargestoff effluxing side populasjons celler som uttrykker ABCG2, en ATP-bindende kassett halv-transportør, isolert som kreft stamceller [21], [22], [23]. I denne studien har vi fått kreftkuler fra HCT116 og HT29 tykktarmskreft cellelinjer ved dyrking i serumfritt medium [24], [25]. Og følgende analyse indikerte at CD133 og Lgr5 ekspresjonen av disse sfæroide cellene var høyere enn foreldre motparter, mens CK20 ekspresjon var lavere som representerer den differensierte endotelceller. Og da ble dyrket i serumholdig medium, de sfæroide cellene på nytt festet til plasten og vises nedregulert CD133 /Lgr5 og oppregulert CK20 uttrykket (ikke vist). Resultatene tyder på at sfæroide cellene har samme kapasitet som multi-differensiering. Dessuten kan den sfæroide cellene danner de samme kuler, noe som indikerer at de har den selv fornye kapasitet. Fra disse resultatene kan vi trekke den konklusjon at kreften stamceller kan bli anriket i disse sfæroide cellene.
Vi utførte en rekke funksjonelle forsøk, for å ta en ytterligere innsikt i den biologiske oppførsel av disse sfæroide cellene . For det første resultatet av vedheft analysen viste at sfæroide celler demonstrere lavere kapasitet på begge voksn til FN (en av de viktigste ECM komponenter) og heft til deres homogene naboer. Det var å si, denne typen celler er lettere å løsne fra ECM og å frigjøre fra bulk svulst. Og også, sfæroide celler vise høyere kapasitet av in vitro-migrering og invasjon, i forhold til sine heftende motstykker. Som vi alle vet, kapasitet på migrasjon og oppløsning av basalmembran er obligatoriske for metastasering av kreft celler. Slik at sfæroide celler kan migrere til kjemotaktisk faktor lettere. Og de kan ha mer innretningen av enzymer sekresjon å oppløseliggjøre basalmembranen, og lettere å invadere den microvessel deretter vandrer til andre organer sammen med blodstrømmen. For å avgjøre om sfæroide cellene er mer tumorigent og metastatisk in vivo, ble tumorutvikling og levermetastaser eksperimenter utført. Og resultatene viste at volumene av subkutan tumor i sfæroide celler gruppene var signifikant høyere enn for adherente celler. Og også, viste levermetastaser telling lignende resultater. Funnene i in vivo eksperimenter vist at sfæroide-deriverte celler ha høyere tumorigen og metastaserende kapasiteter enn sine foreldre kolleger.
Cellene ved invasive fronter utstillingen endringer i epitel struktur og funksjon, som fører til en oppløsning av adherens veikryss, tap av apikal-basal polaritet, tap av epiteliale markører, omorganisering av aktin cytoskjelettet, induksjon av en mesenchymale gen-uttrykk program og deretter forbedret motilitet og invasjon: en prosess kalt epitel-mesenchymale overgang (EMT) [26] , [27], [28]. Vanligvis til E-cadherin, β-catenin og α-catenin bind danne et kompleks. Og forbindelsen av E-cadherin-β-catenin-α-catenin kompleks med Actin cytoskjelettet er meget viktig for opprettholdelse av celle polaritet og celleadhesjon. Så, er riktig lokalisering av E-cadherin til adherens veikryss svært viktig for etablering og stabilisering av disse inter veikryss blant HCT116 /HT29 celler. Dette er en viktig funksjon, særlig i sammenheng med tumorgenese og metastase, fordi et tap av E-cadherin på celleoverflaten har vist seg å spille en rolle i tumorprogresjon og metastase [16], [29]. I vår studie, sfæroide celler demonstrerte nedregulering av E-cadherin, og oppregulering av α-SMA og vimentin, og de to sistnevnte molekyler er markører for mesenchymale celler. Så, sfæroide cellene vise fenotype av EMT i henhold til våre resultater. Og de biologiske atferd av sfæroide celler i samsvar med de mesenchymale celler, slik som upolare morfologisk karakter, lavere adhesjon men høyere in vitro trekkfugl /invasive kapasitet.
Nyere studier har rapportert sentral rolle Wnt /β-catenin signal bane i den selvfornyelse av epiteliale stamceller [30], [31]. I motsetning til dette, har feilregulering av Wnt /β-catenin signalveien vært implisert i colon carcinogenesis [32], [33]. Det er rapportert at svært konservert Wnt /β-catenin signalveien nært forbundet med EMT [34]. Wnt /β-catenin signalveien inneholder mange komponenter, inkludert Wnt proteiner, frizzled (Fz), Dishevelled (Dsh), APC /GSK3p /Axin komplekse, β-catenin, TCF /LSF transkripsjonsfaktor, og noen mål gener (c-myc , Cycline D, survivin, sneglen, Slug, etc.). Vanligvis, i fravær av Wnt, APC /GSK3P /Axin kompleks (ødeleggelse kompleks) befinner seg i cytoplasmaet, hvor det binder og fosforylerer β-catenin. Sistnevnte forlater deretter den komplekse til å bli ubiquitinmolekyler av b-TrCP (som binder til den fosforylerte «degron» motiv i β-catenin), blir deretter nedbrutt av proteasomet. I tilstanden til aktivering av Wnt /β-catenin signalveien, induserer Wnt foreningen av Axin med fosforylert LRP. APC /GSK3p /Axin kompleks faller fra hverandre, og β-catenin er stabilisert. Akkumulert β-catenin i cytoplasma translocates til kjernen, og binder seg til TCF /LSF, forsterker uttrykket av målgener som Slug og snegl, som induserer EMT og metastasering av tykktarmskreft [35]. Aktivering av Wnt signal, hemming av APC /GSK3P /Axin kompleks, kjernefysisk translokasjon av β-catenin, og oppregulering av Slug og Snail er viktige punkter av EMT regulering i tykktarm kreft [36]. I vår studie, nedregulering av GSK3p og oppregulering av Slug og Snail uttrykk ble oppdaget. Og også indikerer oppregulering av kjernen β-catenin ekspresjon i celler sfæroide at den frie β-catenin overføring fra cytoplasma til cellekjernen.
Oppsummert gir vår studie bevis for eksistensen av kreft stamceller . De sfæroide celler avledet fra HCT116 og HT29-cellelinjer berike stilk-lignende celler. Sammenlignet med sine tilhenger kolleger, flytende sfære-avledet celler vises lavere homotypisk /heterotypic vedheft men høyere in vitro trekkfugl /invasiv kapasitet, samt høyere tumorigent og metastatisk potensial in vivo. Og de viser typisk fenotype av EMT (nedregulert E-cadherin og oppregulert vimentin), noe som kan forklare deres malignitet. Og aktivering av Wnt /β-catenin sti (nedregulering av GSK3p og oppregulering av Slug, Snail og kjernen β-catenin) kan spille en viktig rolle i EMT av CCSCs.
Takk
Vi vil gjerne takke Qi Zhang, Cui-Ling Qi, Li-Jie Pan, og Yu Yang for å få hjelp i prosessen med forsøket.
