Abstract
serum prostata-spesifikt antigen (PSA) testen har en høy falsk positiv rate. Som en enkelt markør, gir Ptil begrenset diagnostisk informasjon. En multi-markør test kan påvise ikke bare svulster, men også potensielt dødelige som gir et udekket klinisk behov. Ved hjelp av nanoString NCounter genekspresjon system, ble en 20-gen multiplex testen utviklet basert på digital-genet telling av RNA-transkripter i urinen som et middel for å påvise prostatakreft. I denne testen blir latt urin sentrifugert for å pelletere cellene, og det rensede RNA forsterkes for hybridisering til forutvalgte probesets. Amplifisering av testcellelinje RNA viste seg ikke å innføre betydelig skjevhet, og tellingene passet godt med genet overflod nivåer som målt ved hjelp av DNA-mikromatriser. For dataanalyse, ble de individuelle tellinger sammenlignet med β2 mikroglobulin, en husholdningsgenet. Urinprøver av 5 pre-operative saker og to ikke-kreft ble analysert. Patologi informasjonen ble deretter hentet. Signaler for et flertall av genene var lav for ikke-kreft og lav Gleason score, og 6/6 kjente prostatakreft markører var positive i sakene. Ett tilfelle av Gleason 4 + 5 viste, i kontrast, sterke signaler for alle kreft-assosiert markører, inkludert CD24. En ikke-kreft viste også signaler for alle 6 kreftmarkører, og denne mannen kan huse en udiagnostisert kreft. Denne multiplex test analyse av en naturlig avfallsprodukt kan potensielt brukes til screening, deteksjon tidlig kreft og pasientutvelgelse. Diagnostisk informasjon er oppnådd fra RNA signaturer som er forbundet med celletyper av prostatakreft
Citation. Quek SI, Ho ME, Loprieno MA, Ellis WJ, Elliott N, Liu AY (2012) En Multiplex analyse til Mål RNA transkripsjoner av prostatakreft i urin. PLoS ONE 7 (9): e45656. doi: 10,1371 /journal.pone.0045656
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12. juni 2012; Akseptert: 21. august 2012; Publisert: 20.09.2012
Copyright: © Quek et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute – Early Detection Research Network (NCI EDRN) stipend CA111244. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne ønsker å erklære tilknytning til en av medforfatterne, Nathan Elliott, til kommersielt selskap nanoString Technologies. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Med en aldrende befolkning, antall prostata krefttilfeller vil øke dramatisk i neste to tiår. Den serum PSA testen brukes til å overvåke menn til prostata kreft og mange svulster har blitt oppdaget tidlig gjennom sin bruk. Men nesten ¾ menn med unormal Ptil vise seg å være negativ for kreft ved biopsi [1]. Således er mange av de utførte biopsier er unødvendige. Dessuten er noen krefttilfeller oppdages av PSA. Mens PSA er rikelig produsert av prostata er det ikke kreftspesifikk selv om molekylære former for PSA som [-2] proPSA synes å vise bedre ytelse [2]. Andre markører er nødvendig for definitiv kreftdiagnose. I tillegg er markører for å skille prostata kreft som kan være dødelige fra de som ikke er det. En multi-markør test er nødvendig. Den nanoString NCounter teknologi kan direkte måle flere RNA transkripsjoner i biospecimens, og avlesning er digital i genet teller [3]. I det NCounter system, er to oligonukleotidprober beregnet for hvert transkript mål: en konjugert til biotin, og den andre fargekodet med fargestoffmolekylet kombinasjoner. Etter hybridisering i løsning, er den fangede transkriptene immobiliseres på en streptavidin-belagt overflate, innrettet i et elektrisk felt, og identifisert ved deres individuelle fargekoder. Kodene telles med et mikroskop /kamera enhet og ordnet i Excel. Av tekniske årsaker, det maksimale antall gener som kan analyseres per løp er like under 800. Teknologien har et utvalg virkningsgrad på ~ 1% (dvs. 1800 molekyler produsert 25 teller), et signal varierer fra -25 til 50000 teller, og god reproduserbarhet [3].
Vårt mål er å utvikle denne nanoString teknologi for å oppdage prostatakreft gjennom analyse av annullert urin siden prostata er drenert av urinveiene. Ulike celletyper, inkludert syke de kan kaste eller løslatt fra organer langs denne veis. For de NCounter probesets, ble informative prostata kreft gener identifisert gjennom transcriptomic analyse av kreft epitel og kreft-assosiert stromal celletyper mot sine respektive ikke-kreft motstykke. Til dags dato, de relevante celletyper inkludert Gleason mønster tre CD26
+ kreftceller, Gleason mønster 4 CD26
+ kreftceller, CD90
+ kreft-assosiert stromale celler til kontrast med CD26
+ luminal celler og CD49a
+ stromale celler [4], [5]. Valgte markørgener ble innlemmet i nanoString prostatakreft probe biblioteket for å produsere NCounter codeset. Urinoppsamling representerer den minst invasive rute for å oppnå testmateriale, og å være et avfallsprodukt, kan flere prøver hensiktsmessig samles uten risiko eller belastning for pasientene. Siden celle typer svulster har tydelig genekspresjon, bør deres gen signatur ikke være til stede i sunn ikke-kreft. Det er også mulig at på grunn av den unormale histoarchitecture av tumorer, kreft så vel som kreftassosiert celler er mer sannsynlig å bli sluppet ut i urinen enn celler i normal, spesielt i tilfeller hvor den ekstracellulære matriks blir ødelagt av tumor-avledet metalloproteinaser.
Gen-Probe PCA3 urinprøve er en dag basert på tilstedeværelsen av kreftceller i urinen for sykdom diagnose [6]. Den måler en ikke-kodende RNA (PCA3) gjennom målinnfanging og forsterkning, kjemiluminescerende probe deteksjon med avlesning i relative lysenheter. En multisenter evaluering av testen viste akseptable analytisk ytelse og et riktig emne klassifisering (kreft
vs
. Biopsi negativ) i underkant av 70% [7]. Som en prognostisk markør, PCA3 viste ingen signifikant sammenheng til Gleason score, tumor volum, scene, basert på 70 tilfeller [8]. En annen studie rapporterte en link til disse clinicopathological funksjonene [9]. Andre markører kan inkluderes ved å bruke hel transkriptomet forsterkning fulgt av polymerasekjedereaksjon (PCR) [10]. Tre andre markører (PSMA, HPN, GALNT3) pluss PCA3, for eksempel kan skille kreft fra benign på 100% i en rapport [11]. Multipleks PCR, er imidlertid ikke en robust teknologi og tungvint å utføre i en høy gjennomstrømning innstilling. Den NCounter teknologien ikke bare gir multi-markør analyse evne, men også lette-av-bruk. Payton
et al
. [12] rapporterte anvendelsen av NCounter for å måle RNA overflod av akutt myelogen leukemi. Vår utvikling av en multipleks (PCA3 pluss andre markører) test er motivert av lignende tester som tilbys brystkreftpasienter for stratifisering [13].
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av University of Washington Institutional Review Board. Annullert urinprøver og overflødig vevsprøver fra operasjoner ble samlet inn fra givere med skriftlig samtykke.
Probeset Utvalg
NCounter probesets ble utformet og syntetisert av nanoString Technologies [3]. I henhold til nanoString codeset design, ble hver probe par gjort komplementær til et 100-base område av target RNA. Fangst sonden ble konjugert til biotin for immobilisering på en streptavidin-belagt plate etter hybridisering, og reporteren sonden til en fargekodet tag for signaldeteksjon. Tjue genmarkører ble valgt (tabell 1). Av disse var seks gener som rapportert av flere grupper for å vise øket ekspresjon i prostata cancer: AGR2 (anterior gradient 2) [14], AMACR (α-methylacyl-CoA-racemase) [15], CRISP3 (cysteinrike sekretorisk protein 3 ) [16], HPN (hepsin) [17], PCA3 [18], og ERG (
v
-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog, aktivert som et resultat av gen-fusjon til androgen-regulerte
TMPRSS2
) [19]. B2M (β2 mikroglobulin) ble brukt som kontroll for RNA kvalitet og kvantitet. BRE (hjerne og reproduktive organ-uttrykt TNFRSF1A modulator), IL24, CCI3 [chemokine (C-C motiv) ligand 3, makrofag inflammatorisk protein en underenhet MIP1α] ble oppdaget som oppregulert gener i prostatakreftceller [4]. ACPP (prostata syre fosfatase), AZGP1 (sink α2-glykoprotein 1), KLK2 [(hK2) og KLK3], ANPEP (alanyl aminopeptidase, CD13), CD24, CD9, DPP4 (dipeptidyl-peptidase 4, CD26), MME (membran metallo-endopeptidase, CD10) ble inkludert som prostata luminal celle gener med differensialuttrykk mellom kreft og ikke-kreft [20]. CD90v (CD90 variant BAD92446, og CD90 /THY1) ble inkludert for kreft-assosiert stromale celler [5], [21], og UPK3A (uroplakin 3A) for blære celler [22].
Prostate Cancer Cell Lines
prostata kreft cellelinjer PC3, ble c4-2, og C4-2B opprettholdt i RPMI 1640 media supplert med 10% føtalt bovint serum. De transcriptomes av PC3 og c4-2 ble rapportert tidligere [23]. C4-2B ble avledet fra c4-2 for vekst i (mus) ben [24]. PC3 og c4-2 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). C4-2B [25] ble vennlig levert av Dr. Robert Vessella i Urologi avdeling.
Tabellen viser normaliserte genet teller i en fortynning serie på 10.000, 1000, 100, 10, 1 (3x) celler av PC3
vs
. C4-2. Genene er oppført i første kolonne. Datasettet søket display for uttrykk nivåer av disse genene i c4-2 og PC3 er vist til høyre.
Urin Innsamling og behandling
annullert urinprøver ble samlet inn fra givere. Ingen spesiell pre-samling preparatet ble pålagt av pasientene. I løpet av 2 timer ble urinen (20 til 100 ml) helles fra innsamlings glassene i 50 ml sterile koniske rør, og sentrifugert ved 1500 rpm i 5 min. Supernatanten ble lagret (for protein analyse); pelleten ble resuspendert i resturin og overført til 1,5 ml Eppendorf-rør til mindre enn 1 min i en mikrosentrifuge ved maksimal hastighet. Ikke mer enn 10 ul RLT buffer (Qiagen, Valencia, CA) som inneholder 1% β-mercaptoethanol ble tilsatt. Cellelysatene ble lagret ved -80 ° C inntil analyse (NCounter hybridisering eller RNA-ekstraksjon og amplifikasjon).
Synlig er Excel-format av NCounter data fra unamplified
vs.
Forsterket (merket med * ) RNA av C4-2B og PC3 celler. POS og NEG er kontroll probesets. B. Signal teller innhentet fra unamplified
vs
. forsterket (markert med *) er sammenlignet i histogram. Gene telling for B2M er satt lik 100 og alle andre gener tellinger sammenlignet med B2M fra den samme prøven. Note gener med fraværende uttrykk ble ikke forsterket.
RNA Utvinning og Amplification
Urin RNA ble utarbeidet med RNAqueous Micro (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, California). I korthet, ble 90 ul av Lysis løsning ble tilsatt til 10 ul cellelysatene med kraftig blanding. Femti mikroliter etanol ble deretter tilsatt, og blandingen ble fylt på en Micro-Filter kassett. Patronen ble vasket, og RNA ble eluert på 2 x 8 mL av forvarmet elueringsoppløsning. Avhengig av RNA-konsentrasjonen ble 3-5 ul av den eluerte RNA (30-50 ng) RNA anvendt for amplifisering ved å bruke RiboMultiplier Sense-RNA-amplifikasjon (Epicentre, Illumina, Madison, WI). Første cDNA syntese, terminal oligomer tagging, andre-cDNA syntese,
in vitro
transkripsjon av sense RNA og DNase fordøyelsen ble utført etter produsentens protokoll i en Thermocycler. Amplifiserte RNA ble renset ved anvendelse av RNeasy Mini (Qiagen) og resuspendert i 30 ul RNase-fritt vann. RNA fra cellelinjer ble utarbeidet med RNeasy Mini.
NanoString NCounter Hybridisering og presentasjon av Gene Teller
Probe hybridisering ble utført med 4-5 mL av cellelysatene eller 100-2,000 ng RNA for 18 timer i en automatisert NCounter maskin. Alle gener på NCounter codeset ble analysert samtidig i sann multiplex mote. Rå tellinger ble først normalisert ved hjelp av gjennomsnittet av seks interne pigg i positive kontroll prober for alle prøver å gjøre rede for systematiske forskjeller mellom analyser. Disse kontroll-normaliserte tellinger ble deretter sammenliknet med ekspresjonsnivået av B2M (satt til 100 for enkelhets skyld). For datapresentasjon, ble hvert gen telling er angitt i forhold til den av B2M ved å multiplisere en faktor på 100 /(B2M gen count). De NCounter data ble innhentet før patologi av kreft ble hentet frem, dvs. blinde for Gleason score og stadium av svulstene. Disse patologi funksjonene ble tilskrevet i sakens tallene i resultatdelen.
Sammenligning av rå signalverdiene som oppnås for (a) PC3 og (b) c4-2 /C4-2B celler er vist. Bunnpanelet (c) viser sammenligning av fold-endring beregnes ut fra de oppnådde dataverdier.
Immunohistochemistry
Serial 5-mikrometer frosne deler av svulster ble behandlet for farging med antistoffer å klynge Betegnelse (CD) celleoverflateantigener eller andre markører som beskrevet [20]. Monoklonalt antistoff mot CD24 (klon ML5, 1:50) ble oppnådd fra BD PharMingen (San Diego, CA), monoklonalt antistoff mot CCI3 (klon 4E7, 01:50) var fra Abnova (Taiwan), og antistoff mot AGR2 (klon P1G4 , 01:50) ble fremstilt i vårt laboratorium [26]. De immun seksjonene ble fotografert med Olympus BX41 (Melville, New York) er utstyrt med MicroFire digitalkamera (Optronics, Goleta, California). Bilder ble behandlet med Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, California).
Histogrammet data Displayet viser signal teller P08-022N (blå) og P08-027N (magenta). De høye tellinger av B2M ble ekskludert for datavisning. P08-022N viser ingen signaler for kreftmarkører. I kontrast, viser P08-027N teller for disse markørene.
Resultater
Grense av Oppdagelsen
RNA fra en fortynningsrekke av prostatakreft linjer c4-2 og PC3 var forberedt, og hybridisert til en sonde bibliotek av seks utvalgte gener: KLK3, CD90 /THY1, AGR2, HPN, PCA3, UPK3A. Den rå teller var normalisert, og dataene ble analysert ved nanoString statistisk programvareverktøy. Bakgrunnstellinger ble funnet å være 15 og sensitiviteten grensen var ~20-30 celler basert på et rikelig uttrykt gen som KLK3 i c4-2 (Fig. 1). Tellingene var i god overensstemmelse med celle tall: 22,100 KLK3 teller 10.000 celler; 2400 teller for 1000; 290 teller 100. På en per celle basis, c4-2 viste en signatur på 2,21 KLK3, 0,06 HPN, 0,01 UPK3A, 0 THY1, 0 AGR2, 0 PCA3, mens PC3 viste en signatur fra 0 KLK3, 0 HPN, 0 UPK3A , 0 THY1, 0,005 AGR2, 0 PCA3. Signaturen for c4-2 kan også uttrykkes i forhold til den minste telle antall: 220 KLK3, 6 HPN, en UPK3A. Uttrykket matchet den som oppnås ved DNA microarray analyse.
Signal teller P08-024pre (Gleason 3 + 3), P08-029pre (Gleason 3 + 3, T2C), P08-025pre (Gleason 3+ 4), og P08-046pre (Gleason 3 + 4, T2C) blir sammenlignet med de av P08-022N. Merk ikke bare kreftmarkører, men også prostata luminal markører produsert signaler (kreftceller også produsere disse markørene). B. To seriesnitt av svulsten prøven 08-052A ble farget for CCI3 og AGR2 uttrykk. Forstørrelse er 100x.
Gene Expression profil ble konservert med RNA Amplification
For å evaluere RNA forsterkning, PC3 og C4-2B RNA ble forsterket og de resulterende produkter hybridisert til NCounter 20- gen codeset: ACPP, AGR2, AMACR, ANPEP, AZGP1, B2M, CD90v, BRE, CCI3, CD24, CD9, CRISP3, DPP4, ERG, HPN, IL24, KLK2, MME, PCA3, UPK3A. Fig. 2A viser RNA telledata innhentet i Excel-format. Signal teller (fra ~2,000 ng innspill RNA) mellom unamplified og forsterket materiale var relativt tilsvarende for disse markørene (Fig. 2B). Den relative overflod ble også opprettholdt. En merkbar skjevhet ble ikke sett på noen karakterutskriften. For eksempel 2000 ng C4-2B RNA produsert 151,027 teller B2M, 200 ng produsert 13,335 teller, og 1700 ng forsterket RNA produsert 120,849 teller; for AMACR de samme RNA mengder produsert 114,542 teller, 12,095 teller, og 69,311 teller henholdsvis. Den mest betydningsfulle resultatet var at ikke-uttrykte gener (bakgrunnstellinger 25-30) ikke ble oppdaget, for eksempel, den stromal celle genet CD90v: 40 teller, 2 teller, og 36 teller, og IL24:23 teller, 3 teller , 26 teller henholdsvis for de tre mengder RNA.
data~~POS=TRUNC displayet viser høy signal teller innhentet, spesielt at av CD24. B. CD24 immunhistokjemi viser sterkt farget kreftceller i vevsprøver 01-009E og 02-034A. Forstørrelse er 40x.
samsvar mellom NCounter og DNA microarray profilering
PC3
vs
. PC3 med ingen forventet forskjell og C4-2B
vs
. C4-2 med noen forskjeller ble valgt med vilje for sammenligning. For PC3, en sterk samstemmighet (Pearson
r
= 0,78, Fig. 3) i uttrykket nivåer mellom genet teller og rekke signalverdiene ble funnet. En lavere korrelasjon (
r
= 0,68) mellom C4-2B og c4-2 kunne tilskrives de få differensielt uttrykte gener mellom de to, f.eks var C4-2B positivt for AGR2 og c4-2 ikke. Totalt sett uttrykket fold forskjell på de 20 genene i PC3
vs
. C4-2B /c4-2 viste en korrelasjon på
r
= 0,77. Dermed NCounter kunne produsere en nøyaktig profil av uttrykte gener og deres overflod i bestemte celletyper.
Urin RNA underskrift Non-kreft
Den første kohort av annullert urinprøver ble samlet inn fra lab frivillige . De eksperimentelle data (ikke vist) viste at 1) prøvepreparering var tilstrekkelig i at det var ingen signifikant RNA-degradering som angitt ved signalene fra nagler i nanoString kontroller i prøvene; 2) større urinvolum ikke nødvendigvis gi flere celler; 3) signalene var generelt lavt uten RNA forsterkning; 4) blod i urinen produsert falske avlesninger. I tillegg, å plassere prostatakreftceller PC3 og c4-2 i urinen i 6 timer ga ingen signifikant reduksjon i signalet teller (data ikke vist).
Ved hjelp av RNA-amplifikasjon, en andre kohort av prøvene [erholdt uten digital rektal eksamen (DRE)] ble testet: P08-022N, P08-027N fra menn uten tidligere diagnostisering av kreft, som besøkte UW Prostate Cancer Awareness; P08-023, P08-024, P08-025, P08-029, P08-046 fra pre-op (regenerative) kreftpasienter. Ved hjelp av et histogram format for data skjermen, alle signal teller for de utvalgte prostata kreftgener var på bakgrunn for P08-022N: AGR2 = 0,08 [(8 teller, i forhold til B2M = 100 (10 000 tellinger)], AMACR = 0,46, CD90v = 0,02, CRISP3 = 0,25, ERG = 0,1, HPN = 0,04, PCA3 = 0,09 (fig. 4, data oppføringer i blått). det var også lite representasjon av prostata (sekretoriske) celler i urinen som utledes fra ACPP = 0,2, AZGP1 = 0,14, KLK2 = 0,06.
Dette sammensatte data skjerm illustrerer forskjellen mellom Gleason score (tellinger av B2M er inkludert).
En Mistenkelig N sak
P08-027N (alder 54), i motsetning, vises en kreftlignende signatur. AGR2 = 0,61 (61 tellinger), AMACR = 2,33, CRISP = 11,21, ERG = 0,76, HPN = 0,34, PCA3 = 0,53 (fig 4, data oppføringer i magenta), sammenlignet med ikke-kreft signaturen P08-022N. med 6/6 kjente prostatakreft markører ledelsen over bakgrunnen, en god sannsynlighet for at donor ble huse en udiagnostisert svulst. i tillegg har kreft oppregulert CD24 var på 7,98. Det var også høyere teller prostata gener: ACPP = 1,4, AZGP1 = 0,91, KLK2 = 1.25
Signaturer for Nedre Gleason Skaper
tellesignalene som oppnås for P08-024pre (Gleason tre. 3; PSA = 9,3), P08-029pre (Gleason 3 + 3, T2C, PSA = 3,6; tumorvolum = 0,6 cm), P08-025pre (Gleason 3 + 4; T2C; PSA = 7; tumorvolumet = 5 cc ), og P08-046pre (Gleason 3 + 4; T2C; PSA = 26; tumorvolum = 5 cm) i forhold til de ikke-kreft P08-022N er vist i fig. 5A. P08-024pre viste AGR2 = 0,67, AMACR = 1,73, CRISP3 = 1,11, ERG = 0,91, HPN = 0,38, PCA3 = 0,59 og P08-046pre viste AGR2 = 0,52, AMACR = 1,21, CRISP3 = 2,03, ERG = 0,66, HPN = 0,21, PCA3 = 0,81. Disse genet teller de seks kreftmarkører var 3 ganger over bakgrunns teller i ikke-kreft P08-022N. IL24 (0,80 og 0,43, respektivt) ble funnet oppregulert i kreft [4]. Økningen i CCI3 (3,69 og 3,08, respektivt) kan indikere tilstedeværelse av G4 tumorceller som var CCI3 ett av genene oppregulert i G4
vs
. G3 tumorceller [4]. Fig. 5B viser Gleason mønster 4 tumorceller farging for CCI3 (og AGR2) i vev prøven 08-052A. Disse gense signalene kan også bidratt med leukocytter. P08-029pre, som kom fra en liten svulst volum på 0,6 cc, viste marginal økning (2 til 3 ganger over bakgrunnen) for disse genene unntatt AMACR: AGR2 = 0,16, AMACR = 0,32, CRISP3 = 0,78, ERG = 0,28 , HPN = 0,12, PCA3 = 0,19. På den annen side viste P08-025pre lave teller for disse genene unntatt CRISP3:. AGR2 = 0,06, AMACR = 0,16, CRISP3 = 2,27, ERG = 0,04, HPN = 0,03, PCA3 = 0.07
underskrift en høy Gleason sak
signal~~POS=TRUNC teller P08-023pre (Gleason 4 + 5; PSA = 5) var betydelig mer uttalt ( 70 ganger over bakgrunnen) sammenlignet med N: AGR2 = 10,26, AMACR = 32.61, CRISP = 38,35, ERG = 17,15, HPN = 5,74, PCA3 = 10,8 (fig. 6A). Spesielt ble en svært høy CD24 count (111,95) oppnådd. Et stort antall av prostatakreft viser økt CD24-farging [20], og sterkt farget mønster Gleason 5-celler kan sees i fig. 6B for banked vevsprøver 01-009E og 02-034A. I tillegg CD90v = 4,19 for kreftassosiert stromale celler ble detektert. Det kan se ut som i dette tilfellet flere kreftceller og andre celletyper ble sluppet ut i urinen. Dette kan tilskrives tap av histoarchitectural integritet i avanserte sykdommer (som også kan føre til høyere serum PSA nivå). En sammensatt data vises i fig. 7 viser signal forskjellen mellom denne høyverdig kreft og de andre.
Diskusjoner
Bruke nanoString teknologi, har vi utviklet en multi-markør urinprøve som potensielt kan brukes for screening, deteksjon og pasientutvelgelse av prostatakreft. RNA underskrifter fra vår tilfeldig valgt første kullet av kliniske urinprøver var lovende i at de kunne oppdage kreft i fire av fem pre-op prøver basert på de seks kjente prostatakreft markører inkludert PCA3, dagens urin-baserte markør. Enda viktigere, P08-023pre fra en pasient med høyverdig sykdom viste høye RNA teller for mange markører. Med hensyn til den mistenkelige P08-027N tilfellet, kan ytterligere testing ikke gjøres som oppholdssted for denne engangs donor er ukjent.
PCA3 urinprøve viser at prostatakreftceller kan bli funnet i urinen. I motsetning til PCA3 test, vår urin testing ikke krever en oppmerksom DRE, selv om DRE kan forbedre signaler ved mekaniske midler for å framkalle mer celle utgivelse fra kjertelen [7]. Dermed kunne NCounter test utvikles til en ikke-invasiv kreft screening. Mot dette formål, er testing av en stor kohort av menn trukket fra befolkningen for øvrig som ikke har noen diagnose av kreft av avgjørende betydning som referanse uttrykk for de valgte prostatakreft markører i urin er ukjent.
Mange av prostatakreft markørene er også uttrykt ved hjelp av ikke-prostatiske celletyper, for eksempel, AMACR i nyre tubulære celler [27], CRISP3 i den sekretoriske epitelet av mannlige kjønnsorganer [28], ERG mRNA og protein i endotelceller (selv om ERG fusjon er spesifikk for prostatakreft) [29], HPN i bitestiklene og sædvæske (The human Protein Atlas, https://www.proteinatlas.org), AGR2 i urothelium og nyre tubulære celler (The human Protein Atlas og upubliserte data) . PCA3 å være en ikke-kodende avskrift, dens uttrykk har ikke blitt grundig undersøkt av immunhistokjemi som de andre. Selv om genet signaturer av alle former for urogenital kreft /sykdommer er i stor grad ukjent, de seks kjente prostata kreftgener av AGR2, AMACR, CRISP3, ERG, HPN, og PCA3 er på eller under bakgrunnen, for eksempel i blærekreft [30] . Det er sannsynlig at hver type urogenital kreft /sykdom ville gi opphav til et unikt gen signatur. Den nåværende NCounter codeset er utformet spesielt for prostatakreft basert på tilgjengelig informasjon til dags dato. Post-op urin (med matchet pre-op) er informativ for å se om alle kreftmarkører (pluss prostata-spesifikt de) ville forsvinne etter operasjonen. For pasienter behandlet med fokusert stråling, kreft markører, men ikke ACPP, AZGP1, KLK3 ville gå tapt dersom svulsten er vellykket ablated. Tilleggsspørsmål er: hva er den dag-til-dag variasjon, om noen, i signaturen; gjør signaturen har en sammenheng med alderen som serum PSA; hva er antall normal
vs
. tumorceller som er utgytt i urinen.
NCounter probeset kan utvides til å omfatte flere mer vanlige gener (ved siden B2M) for genet count sammenligningsformål og andre markører for deteksjon av spesifikke celletyper som PTPRC /CD45 for hvite blodlegemer, PECAM1 /CD31 til endotelceller, NCAM1 /CD56, B3GAT1 /CD57, NGFR /CD271 for nevrale elementer, UMOD (uromodulin) for nyreceller (og UPK3A for blære-celler). Probe design er ikke perfekt, og noen ganger nye probesets kan kreves dersom de første gjorde det dårlig, f.eks DPP4 /CD26 i gjeldende kodesett. Begge luminal og kreftceller er sterkt immunostained for CD26, men signal teller DPP4 var generelt lav. For prostatakreft spesifisitet, er menn med negative biopsier, benign prostatahyperplasi, prostatitt, samt menn med blære og nyrekreft testet. Spesifisitet økes ved multipleks formatet NCounter. De valgte markører er de med økt uttrykk i prostatakreft som PCA3 og AGR2. Mange studier har nylig vist at urinen PCA3 poengsum kan gi et ekstra verktøy for klinikere å administrere sine pasienter [31]. Bu
et al
. påvises i urin AGR2 RNA ved QRT-PCR involverer 31 tilfeller (positiv biopsi) og 29 kontroller (negativ biopsi) for å vise at urin AGR2 transkripsjon utkonkurrerte serum PSA [32]. Den NCounter codeset ikke bare inneholder PCA3 og AGR2 men også probesets til andre informative markører. Teoretisk sett kan sonden biblioteket inneholder alle genene (inkludert ESTs) identifiserte via genekspresjonsanalyser som oppregulert i prostatakreftceller.
NCounter testen er ideelt for overvåking av pasienter som er på aktiv overvåking. Dette er menn med diagnosen kreft, men de patologi egenskapene til sine svulst vil foreslå en ikke-dødelig kreft [33], [34]. En innledende urin RNA signatur for hver pasient blir oppnådd ved innmelding. Hver pasient kan da overvåkes periodisk av NCounter test for å fastslå om endringer i RNA signatur tilsvare sykdomsprogresjon målt ved PSA dobling tid, Gleason gradering, DRE, eller bevis for kreftspredning.
Som en screening verktøyet, kan alle mennesker få en signatur i en alder av 40 og følges årlig eller annet hvert år for endringer i denne baseline urin RNA-profil. En multiplex ELISA for å måle prostatakreft utskilte proteiner (f.eks AGR2 og andre) kan til slutt bli utviklet for å utfylle den RNA-test. Således trenger en korrelasjon mellom AGR2 RNA tellinger og AGR2 protein mengder av de samme prøver som skal utføres. Urin supernatant konsentreres ved sentrifugefiltrering for måling av AGR2 protein ved hjelp av den nylig utviklede sandwich-ELISA AGR2 [26]. Dermed alternativt kan alle mennesker bli skjermet av AGR2 ELISA. En AGR2 signal vil da be NCounter testing å score uttrykket av andre kreftmarkører for bekreftelse.
Til slutt, er allsidig den NCounter testen og kan innlemme markører for andre urologiske kreftformer som blære [30] og nyre. Videre er det mulig å inkludere markører for en hvilken som helst sykdom i urinveisorganer for å gjøre det til en flerbruks klinisk test. Innsamling og behandling av urin er enkel å utføre og kostnadene er billig (anslått til $ 100 per test). Enda viktigere, kan den digitale data utgang fra denne testen være lett arkivert og spores, og er lett forståelig for leger og pasienter.
Takk
Vi takker Deanna Gonzalez og Jennilee Kho for pasienten samtykke og urin samling, og Jennifer Note for gjenfinning av patologi informasjon.
