Abstract
MUC1 tumorassosiert antigen er sterkt uttrykt på en rekke svulster. Den brede distribusjon på primærsvulster og metastaser gjør det til et attraktivt mål for immunterapi. Etter syntese MUC1 spaltes, hvilket gir en stor oppløselig ekstracellulært alfa-underenhet som inneholder tandem gjentar array (TRA) domene spesifikt bundet, gjennom ikke-kovalent interaksjon, til en mindre beta-underenhet som inneholder de transmembrane og cytoplasmatiske domener. Hittil har mangelfulle effekt er rapportert for anti-MUC1 antistoffer rettet mot løselig alfa subenheten. Målrette cellen bundet beta subenhet, kan omgå begrensninger som følger av sirkulerende TRA domener. MUC1 signal peptid (SP) domene binder promiskuøst flere MHC klasse II og klasse I alleler, som ved vaksinasjon, genererte robust T-celle immunitet mot MUC1-positive svulster. Dette er en første demonstrasjon av ikke-MHC forbundet, MUC1 spesifikke, celleoverflater tilstedeværelse for MUC1 SP domene. Polyklonale og monoklonale antistoffer dannet mot MUC1 SP domene spesifikt binder et stort utvalg av MUC1-positive humane faste og hematologiske tumorcellelinjer; MUC1-positive benmargs avledet plasmaceller hentet fra multippelt myelom (MM) -patients, men ikke MUC1 negative svulster celler og normale naive primære blod og epitelceller. Membranal MUC1 SP vises hovedsakelig som en selvstendig enhet, men også samlokalisert med full MUC1 molekylet. MUC1-SP spesifikk binding i BM-avledet plasmaceller kan bistå i valg av pasienter som skal behandles med anti-MUC1 SP terapeutisk vaksine, ImMucin. En terapeutisk potensiale av de anti-MUC1 SP-antistoffer ble foreslått ved deres evne til å støtte av komplement-mediert lysis av MUC1-positive tumorceller, men ikke MUC1 negative tumorceller og normale naive primære epitelceller. Disse funnene tyder på en ny celleoverflate nærvær av MUC1 SP domene, en potensiell terapeutisk nytte for anti-MUC1 SP-antistoffer i MUC1-positive tumorer og et utvalg verktøy for MM pasienter som behandles med anti MUC1 SP vaksine, ImMucin.
Citation: Kovjazin R, Horn G, Smorodinsky NI, Shapira MY, Carmon L (2014) Cell Surface-Associated Anti-MUC1-Avledet Signal Peptide Antistoffer: Konsekvenser for kreftdiagnostikk og behandling. PLoS ONE 9 (1): e85400. doi: 10,1371 /journal.pone.0085400
Redaktør: Stefan Dubel, Technical University of Braunschweig, Tyskland
mottatt: 9. oktober 2013, Godkjent: 05.12.2013; Publisert: 08.01.2014
Copyright: © 2014 Kovjazin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning nr 48447 fra den israelske Chief Scientist av Industridepartementet og handels Arbeiderpartiet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Lior Carmon er grunnlegger og administrerende direktør og Riva Kovjazin, og er seniorforsker av Vaxil biotherapeutics Ltd, et nystartet selskap som utvikler ImMucin, en anti-MUC1 SP terapeutisk vaksine mot MUC1-positive svulster. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De andre forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Innledning
MUC1 er en mucin-like glykoprotein sterkt uttrykt på en rekke epiteliale karsinom, inkludert lunge, bryst, eggstokk, prostata og tykktarm, som vel som på overflaten av hematologiske tumorer slik som multippelt myelom (MM) [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Den brede fordeling av både primær tumor og metastase, inkludert kreft stamceller [7], etablert det som et vidt undersøkt mål for immunterapi [1], [8], [9], [10]. Faktisk ble MUC1 oppført av National Cancer Institute pilotprosjekt som den nest mest lovende mål fra en liste over 75 potensielle tumorassosierte antigener (TAA) [11]
MUC1 eksisterer i en rekke isoformer [12. ], hvor den mest omfattende studerte formen er den polymorfe type i transmembranprotein (MUC1-TM), som består av et ekstracellulært domene inneholdende 20-125 20-aminosyre-lange tandem gjentatte arrays (TRA) etterfulgt av et transmembrandomene og en kort den cytoplasmiske hale [13], [14]. MUC1 er behandlet i den sekretoriske vei, noe som ga et stort ekstracellulært alfa-underenhet inneholdende det TRA domenet, ikke-kovalent bundet til en mindre beta-underenhet som inneholder molekylets transmembrane og cytoplasmatiske domener [15]. Til dags dato, mens de fleste anti-MUC1-antistoffer rettet mot TRA domenet av det ekstracellulære alfa-underenheten [16], [17], [18], har studier vist motstridende resultater med hensyn til immunterapeutisk effekt av slike antistoff-baserte TRA-epitop målretting [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Disse inkonsistente funnene er foreslått å være en konsekvens av den ikke-kovalente binding av TRA domenet til det tumorcelleoverflaten; løselig, sirkulerende formen fungerer som en lokkedue for anti-TRA antistoffer, noe som begrenser deres evne til å nå MUC1-uttrykke kreftceller [23], [25]. Derfor rettet mot MUC1 noncirculating epitoper utelukkende uttrykt på tumorcelleoverflater kunne potensielt omgå disse begrensningene. For dette formål epitoper fra de ekstracellulære og intracellulære segmenter som omgir MUC1 TRA domene, sammen med epitoper innenfor MUC1 største signal peptid (SP) domene, ble identifisert [20], [21], [27], [28].
SP er korte 13-50 aminosyre-lange lipofile sekvenser vanligvis lokalisert ved aminoenden av proteiner bestemt for sekresjon eller for å kunne integreres i cellemembraner [29]. Når proteintranslasjon er ferdig, er SP-er innlemmet i det endoplasmatiske retikulum (ER) membranen vanligvis fjernet fra det modne protein, men kan fortsatt gå inn i ER lumen og binde MHC-molekyler, enten direkte, på grunn av den unike protease aktiviteten av ER-membran forbundet signalpeptid peptidase (SPP) [29], eller indirekte, som andre degradert sekvenser, via medbringeren forbundet med antigen prosessering (TAP) maskiner [30]. Likevel ER lokalisering og MHC binding ferdighet av SPs [31] baserer seg både på deres hydrofobe natur og bestemt rekkefølge. Nemlig, sammen med vedlikehold av konsensus-motiv nødvendig som et målsøkende signal, forskjellige SP oppvise høy variabilitet og antigenspesifisitet [29], [32], [33]. Følgelig kan SP domener tjene som vaksinekandidater (VK), indusering av antigen-spesifikke immunresponser i en stor del av befolkningen.
21-mer SP domene av MUC1 (MUC1 SP), heri MUC1- SP-L eller VXL100 peptidet eller det formulerte terapeutisk vaksine, ImMucin [28], behandles og presenteres i forbindelse med flere MHC klasse i og II på celleoverflaten av både antigen-presenterende celler og forskjellige MUC1-positive tumorceller, som kan generere robust T-celle-immunitet mot MUC1-positive tumorer [28]. I tillegg kan en MUC1-spesifikk humoral respons bli generert mot MUC1 SP, som manifestert ved signifikant økning av naturlige autoantistoffer i blodet av MM pasientene, men ikke i friske donorer [34]. Siden løselig MUC1 SP ikke ble påvist i pasientserum [34], ble det spekulert i at de naturlig genererte autoantistoffer ble primet av ikke-MHC-begrenset, MUC1-assosiert tumor celle-bundet SP. Den aktuelle studien utforsket denne muligheten ved å generere spesifikke polyklonale og monoklonale antistoffer mot MUC1-SP-L. Celle-overflate nærvær av MUC1 SP ble påvist ved hjelp av de hevede antistoffer, på tumorcellelinjer og primære tumorer, men ikke på naive primære celler. I tillegg til sin direkte anti-tumor terapeutiske potensial, kan disse antistoffene forbedre utvalgskriteriene for MM pasienter som tok sikte på å bli behandlet med den ImMucin anti-MUC1 SP terapeutisk vaksine.
Materialer og metoder
Peptide Synthesis
MUC1-SP-L, MUC1-SP-M, MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2, MUC1-SP-S3, MUC1-SP-S4, MUC1-SP-S5 og TB-Rv0476 /4941-SP-L ble syntetisert ved helautomatisk, solid-fase peptidsyntese hjelp fluorenyimetyloksykarbonyl (Fmoc) /tBu-strategi og Rink-amid-polystyren resin (EMC Microcollections, Tyskland og ALMAC Sciences, UK). MUC1-TRA-L og BAGE-SP-L ble syntetisert ved anvendelse av den samme metodikk (GL Biochem, Kina). Peptide renhet og identitet var . 95%, som bestemmes av høy ytelse væskekromatografi og massespektrometri analyser
tumorcellelinjer og Hybridomer
humane B-lymfatisk leukemi linjer Raji og Ramos den humane mM cellelinjer U266 og RPMI8226 og den humane PC-leukemilinje ARH-77 ble dyrket i suspensjon i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM HEPES og 50 ug /ml gentamycin. Den humane ovariekarsinom linje OVARCAR-3 ble dyrket som en adherent monolag i RPMI-1640 medium supplert med 20% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 50 ug /ml gentamycin. Den menneskelige ovarialcancer linjen ES-2, ble melanom linjen SK-mel-28, og brystkreft cellelinjer MCF7, MDA-231 og MDA-453 dyrkes som heft monolag og den menneskelige melanom linjen SK-mel-1 ble dyrket i oppheng i DMEM, supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 50 ug /ml gentamycin. Alle cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA, USA). Alle hybridomer brukt i denne studien ble dyrket i DMEM supplementert med 10% hesteserum, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 50 ug /ml gentamycin. Alle kultur reagenser ble kjøpt fra Biologiske Industries, (Bet-HaEmek, Israel).
Antistoffer
Den anti-MUC1 TRA mAb H23, hevet mot den menneskelige brystkreft cellelinje T47D, [35 ] erkjenner ikke-glykosylert MUC1 epitop APDTRP, servert som en positiv kontroll. Muse-anti-geit eller kanin-anti-muse-IgG-FITC (Jackson Immunoresearch, USA) tjente som en negativ kontroll for FACS-analyser. Normale mus eller kanin IgG antistoffer (Chemicon, Millipore, USA) ble brukt for komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) analyser.
Dyr
Åtte ukers gamle BALB /c mus (Tel Aviv university avl anlegget) og to måneder gamle kaniner (Harlan, Jerusalem, Israel) ble opprettholdt i universitets dyreforsøk studio.
Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer mus og kaniner ble godkjent av Tel Aviv university Animal Care komiteen.
pasient~~POS=TRUNC Bone Marrow (BM) aspirerer og Primær naive friske celler
BM aspirates (2-3 ml) ble hentet fra fire pasienter (alder 50-75) med sakte progresjon, asymptomatisk MM, som hadde blitt vist for påmelding til ImMucin sin fase i /II klinisk studie (protokoll VAXIL-001). Studien ble godkjent av etikkomiteen av Hadassah Universitetssykehus, Jerusalem, Israel den israelske helsedepartementet, og ble registrert på PRS som NCT01232712. Analysen av BM-avledet PC ble utført innenfor rammen av screening prosessen av studien og skriftlig informert samtykke fra MM pasienter ble innhentet for å bruke sin prøve for forskning. Frisk normal menneskelig BM (kat. Nr 1 M-105) og menneskelig NHEC (kat. Nr CC-2251), ble kjøpt fra Lonza BIORESEARCH (Somerset, NJ, USA). Normale menneskelige hvite blodceller ble isolert fra buffy-coat-prøver donert av den israelske nasjonalBlodBanken, fra 3 naive givere.
Produksjon av Anti-MUC1 SP polyklonale antistoffer
Fire kaniner (R22, R23, R32 og R33), ble subkutant immunisert fire ganger med to ukers mellomrom med 500 ug keyhole limpet hemocyanin (KLH) -konjugert MUC1-SP-M, emulgert i fullstendig Freunds adjuvans i den første immunisering, og i ufullstendig Freunds adjuvans i påfølgende vaksinasjoner. KLH-peptid konjugering ble utført ved Adar Biotech (Rehovot, Israel) ved hjelp av glutaraldehyd-drevet tverrbinding. Syv dager etter den endelige immunisering ble kaninsera undersøkt for tilstedeværelse av MUC1-SP-M-spesifikke antistoffer; positive sera (titer 1:12,800) ble samlet og slått sammen. IgG-fraksjoner av kanin R23, betegnet R23IgG, anvendes for alle immunologiske analyser, gjennomgikk ammoniumsulfat (40%) utfelling før bruk, slik som tidligere beskrevet [36].
Fremstilling av Anti-MUC1 SP mAb
Fire BALB /c-mus ble subkutant immunisert som beskrevet ovenfor. To uker etter den siste immunisering ble musesera vurdert for tilstedeværelse av MUC1-SP-M-spesifikke antistoffer. Miltceller fra det høyeste positive sera bærende mus ble høstet og smeltet sammen med det murine NSO myelom partner cellelinje, under anvendelse av polyetylenglykol (molekylvekt 1500) (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). Hybridomer ble selektert på 2 uker i hybridcellevekstmedium supplert med 2% hypoksantin-aminopterin-tymidin og ble ytterligere dyrket i vekst hybridom-medium supplert med 2% hypoxantin-tymidin. ELISA ble utført for å skjerm kultursupernatanter for tilstedeværelse av anti-MUC1-SP-M-IgG Abs. Positive prøver ble screenet på nytt ved hjelp av ELISA og ble videre subklonet og utvidet. Storskala Ab produksjon av utvalgte kloner ble oppnådd ved rensing av mAbs hjelp av en anti-mus IgG-agarose-kolonne (Sigma, Israel. Katt nr A6531). Isotyping av mAbs ble utført ved hjelp av en IsoStrip kit (Roche,.. Katt ingen 1.493.027).
ELISA-basert screening av Mouse hyperimmune Sera og Anti-MUC1-SP-M IgG-produserende hybrid
ELISA-plater (F96 Maxisorp, Nunc, Danmark) ble aktivert i 1 time med 0,1% glutaraldehyd (Sigma, Israel) i karbonat-buffer, pH = 9. Deretter ble platene belagt med 50 ul peptid (5 ug /ml) i karbonatbuffer (over natten, 4 ° C), etterfulgt av blokkering (2 timer, romtemperatur) med PBS supplert med 5% FBS og 0,04% Tween 20 (ICN Biomedical Inc, USA). Seraprøver fra MUC1-SP-M-immuniserte mus ble deretter fortynnet i blokkeringsbuffer, mens prøver fra hybridomkulturene ble ikke fortynnet. Alle prøvene ble inkubert (2 timer, romtemperatur), før utstrakt vasking og behandling (1 time, romtemperatur) med HRP-konjugert anti-mus-IgG (Jackson Immunoresearch, USA; 50 ul /brønn), etter en fortynning 1:10,000 i blokkering buffer. Etter omfattende vasking ble platene utviklet med TMB /E-løsning (Chemicon, Millipore, USA), ifølge produsentens instruksjoner.
For peptid-antistoffkonkurranseanalyser, hyperimmune sera og hybridom-vekstmedium ble inkubert med 1 ug /vel peptider i 96-brønners ELISA-plater (F96 Maxisorp, Nunc, Danmark) aktivert med glutaraldehyd. Resten av analysen ble utført som beskrevet ovenfor. En reduksjon på minst 50% i OD ble betraktet som en positiv resultat.
flowcytometrisystemer og Imagestream
For å bekrefte overflate farging av MUC1 på tumorcellelinjer og co-uttrykk for MM markører og MUC1 på BM aspirater, ble cellene vasket og inkubert i 30 minutter i buffer flekker, bestående av PBS supplert med 3% FBS, 10% humant AB-serum og 0,1% natriumazid. BM «store celler» ble opprinnelig inngjerdet ved side vs. fremover scatter. Deretter ble cellene farget med en eller flere av de følgende: anti-human CD138-APC kommersielt konjugerte Ab’er (IQ Products, Nederland), anti-humant kappa-lettkjede-eFluor 450 og anti-human lambda lettkjede-PE (eBioscience, USA) og /eller in-house forberedt FITC- eller PE-konjugert anti-human MUC1 (anti-MUC1-TRA H23), anti-MUC1 SP R23IgG, SPmAb-6 og SPmAb-2.1 antistoffer. FITC og PE konjugering ble utført i henhold til produsentens protokoll (Lighting lenke R-Phycoerythrin Bøyning Kit, Innova biovitenskap, USA). Merkede celler ble vasket to ganger, fiksert i BD CellFIX (Becton Dickenson, USA), i henhold til produsentens protokoll og lagret ved 4 ° C inntil analyse. Minst 1 × 10
6, og 3 × 10
4 hendelsene ble kjøpt for flowcytometri og bildestrømmen, henholdsvis. For imagestream analyse, ble cellekjerner farget med Hoechst fargeløsning (3030145), i henhold til produsentens protokoll (MP Biomedicals, CA, USA). Flowcytometri analyse ble utført med LSR II (Becton Dickenson Immunocytometry Systems, USA) og data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (TreeStar, USA). Colocalization analyse ble utført med Imagestream system (ImageStreamX flowcytometer; Amnis Corp) og analysert ved hjelp av IDEER likheten Bright Detalj funksjonen (IDEAL 6,0; Amnis Corp). Likheten score er et mål på i hvilken grad to bildene er lineært korrelert.
immunfluorescens Mikros
heftende celler (5 × 104 celler /brønn) ble sådd ut på dekkglass (Marlenfeld GmbH Co), i 24-brønners plater i 18 timer 37 ° C. Dekkglass ble vasket to ganger med kald (4 ° C) PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd (20 minutter, romtemperatur), blokkert og permeabilisert med PBS supplert med 3% BSA og 0,1% triton (1 time, romtemperatur). Deretter ble cellene farget (1 time, romtemperatur) med antistoff fortynnet til 20 ug /ml i fargeløsning (1% BSA, 0,1% Triton i PBS), og deretter med sekundært antistoff, fortynnet 1:200, i fargeløsning supplert med DAPI (30 minutter, romtemperatur). Lysbilder ble montert med Fluorescence Monterings medium (Golden Bridge Life Science, USA). Celler dyrket i suspensjon ble farget med primære og sekundære antistoffer og deretter fiksert og belagt på dekkglass. Celler ble sett på med en Zeiss 100 ×, NA 1.4, Yokogawa CSU-22, eller Zeiss helautomatisk-invertert 200 M mikroskop, med solid state lasere 473, 561 og 660 nm; piezo-kontrollerte Z-trinns alle under kommando av Slidebook ™. Bilder ble kjøpt med en Evolve EMCCD kamera (fotometriske; 100 × linse, 1 × 1 binning, pikselstørrelse: 0,16 mikron).
CDC
Ulike kreft linjer og HMEC (Target celler) ( 1 x 10
6 celler /ml) ble merket med 2 uCi /ml 3 [H] -tymidin (Amersham, UK), i 18 timer ved 37 ° C. Deretter ble cellene vasket tre ganger med PBS og inkubert (2 timer, romtemperatur) med 100, 50 eller 10 ug /ml H23, R23IgG, SPmAb-6 eller SPmAb-2.1-antistoffer. Cellene ble deretter vasket med PBS, og 1 x 10
4-celler ble inkubert (5 h, 37 ° C) i 4 ml rør med 20 pl, 10 pl eller 5 ul humant serum komplement (Sigma, Israel). Cellene ble deretter vasket tre ganger med PBS, resuspendert i 300 ul PBS og podet i 100 pl /brønn triplikater i 96-brønners plater (Griner, De Groot, Tyskland). Cellehøstingen ble utført ved anvendelse UNIFILTER 96-brønners plater (PerkinElmer, USA). Radioaktivitet ble bestemt i en beta-counter (PerkinElmer, IL, USA). For spontan lysering, ble celler inkubert under de samme betingelser, men uten tilsetning av komplement. For total lysis, ble 10% Triton X100 tilsatt til de merkede celler. Andel spesifikk lysis ble beregnet som følger:. (CPM i eksperimentell godt – CPM i spontan prøve) /(CPM i totalutvalget – CPM i spontan prøve) × 100
Statistical Analysis
Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av students t-test. I alle tester ble minimumsnivå av betydning for en 2-tailed test satt til p. 0,01
Resultater
Generering av MUC1 SP-spesifikke antistoffer
For å fremme utforskning av den art, spesifisitet og plassering av antigenet som fører til genereringen av autoantistoffer mot MUC1-SP-L, ble KLH-konjugert 17-mer MUC1-SP-M peptid (tabell 1) som benyttes til å generere polyklonale og mAb’er. MUC1-SP-M ble valgt basert på en in silico prediksjon for høy tetthet MHC klasse II og B-celle epitoper og på den betydelige konsentrasjonen av autoantistoffer mot dette peptidet, som finnes i sera hos pasienter MM [34]. Anti-MUC1-SP-M polyklonale antistoffer (positive sera titer på ≤1:25,000) ble oppnådd i mus (data ikke vist) og i to immunisert kaniner R23 og R32 (positiv på titer ≤1:12,800) (Tabell 1 og Fig . 1A venstre panel). Den anti-MUC1 humoral respons demonstrert begrenset kryssreaktivitet (titre av 1:800 fortynninger) til både eukaryote (BAGE-SP-L, Tabell 1 og figur 1A midtre panelet.) Og prokaryote (TB-Rv0476 /4941-SP- L, Tabell 1 og fig. 1A panel høyre) SPs. De MUC1-SP-M indre epitoper mest anerkjente av R23 var MUC1-SP-S1 og MUC1-SP-S2 (tabell 1, Fig. 1B), som begge ligger på MUC1 SP C-terminalen. Kompetitive analyser evaluere spesifisiteten av de polyklonale antistoffer demonstrert 50% inhibering av både R23- og R32-avledede antistoffer ved MUC1-SP-M og dens indre epitop MUC1-SP-S2 (figur 1C.). Inhibering av 10% ble oppnådd ved andre MUC1 SP epitoper, spesielt MUC1-SP-S4 og MUC1-TRA-L, og ved den BAGE SP domene BAGE-SP-L. Basert på disse resultatene, er det minimal epitop av R23 og R32 ligger innenfor MUC1-SP-S1 og MUC1-SP-S2 sekvenser, dvs. aminosyrer 12-21.
spesifisitet og definert minimal epitop av den genererte anti-MUC1 SP polyklonale antistoffer (A-C) og mAbs SPmAb-2,1 og SPmAb-6 (D-E) ble evaluert mot det immuniserende peptid MUC1-SP-M og den interne epitoper MUC1-SP-S1 til S5 i ELISA-analyser. MUC1 er TRA epitop, MUC1-TRA-L, og den ikke-MUC1 SP domene BAGE-SP-L, ble brukt i disse analysene som negative kontroller.
Etter etableringen av MUC1-SP -M immunogenisitet hos kaniner, valgte vi å generere mAb i mus. Sera samlet opp fra MUC1-SP-M-immuniserte mus No. 1 (M1) sterkt bundet til immuniserende peptid, MUC1-SP-M ( 1:12,800 titer) (figur 1D.), Moderat bundet MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2 og MUC1-SP-S3 ( 1:1800-3600 titers) og svakt bundet MUC1-SP-S4 og MUC1-SP-S5 ( 1:800 titer). Sera unnlot å binde MUC1-TRA-L. Binding eksperimenter med sera fra mus No. 2 demonstrerte de høyeste titrene ( 1:1600) til peptider MUC1-SP-S4 og MUC1-SP-S5 (data ikke vist). Kloning innsats ga to mAbs, ett med en Ig-gamma1 isotype, utpekt SPmAb-2.1, og den andre med en Ig-gamma2a isotype, utpekt SPmAb-6. mAb spesifisitet ble validert ved binding og konkurranseanalyser (fig. 1E) med ulike frie peptider (Tabell 1). MUC1-SP-S2 mest potent hemmet SPmAb-2,1, mens MUC1-SP-S4 mest effektivt hemmet SPmAb-6 binding, både definere minimal epitoper av de respektive antistoffer.
Anti-MUC1 SP Antistoffer Bind til MUC1 -positive tumorceller
flowcytometri analyse viste moderat-høy SPmAb-2.1, SPmAb-6 og R23IgG binding til MUC1-uttrykke solide og hematologiske tumorer (tabell 2). Den anti-MUC1 TRA-mAb H23 [35], som tjente som en positiv kontroll MUC1, viser utvetydig reaktivitet, med bindingsstyrke lik den for de R23IgG antistoffer. I motsetning til dette, MUC1-negative melanomcellelinjer, SK-MEL-28 og SK-MEL-1, og den MUC1-negative ovarie cellelinje, ES-2, konsekvent ikke klarte å reagere (lav geometrisk middelverdi) med alle testede antistoffene (tabell 2), noe som viser antistoffer selektivitet til MUC1 SP. Ytterligere støtte av svulsten celle- og MUC1 SP-spesifisitet av antistoffene, ble gitt av fravær av binding av SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAb’er og R23IgG antistoffer mot humane hvite blodceller, særlig for å CD3
+ T -cellene, CD20
+ B-celler og CD14
+ myeloide celler, samt å naiv normale menneskelige mammary epitelceller (HMEC) (tabell 2).
Anti-MUC1 SP antistoffer Lokaliser til membraner av MUC1-positive tumorceller
lokalisering av antigen gjenkjennes av de ulike MUC1 SP antistoffer ble bestemt via imagestream analyse. MUC1 SP nærvær ble observert ved bruk av PE-konjugert SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAb og APC-konjugert H23 MUC1 TRA mAb, på celleoverflaten av MUC1-positive ovarie cellelinje OVCAR-3, mens ingen ekspresjon ble observert på MUC1 -negativ ovarie cellelinje ES-2 (fig. 2A). Det fusjonerte bilder av 30000 celler indikerer at MUC1 SP og MUC1 TRA lokalisere hovedsakelig alene på membranen av cellene. MUC1 SP ble observert som en selvstendig membranal domene, som demonstrert av en enkelt PE
lyse membranal flekker, i 47% og 56% av de analyserte celler, ved behandling med SPmAb-6 og SPmAb-2.1, henholdsvis. Colocalization av MUC1 SP og MUC1 TRA molekyler, demonstrert av en dobbel PE
lys /APC
lyse membranal flekker, var minimal, og observert hos 18% og 27% av cellene eksponert for SPmAb-6 og SPmAb- henholdsvis 2,1, (data ikke vist). En høy likheten mellom MUC1 SP og MUC1 TRA farging (likhets koeffisienter 1,0) ble observert (data ikke vist), noe som indikerer colocalization av disse molekylene på svært få utvalgte celler. Ytterligere bekreftelse av MUC1-spesifisiteten av disse antistoffene ble oppnådd ved spesifikk binding av anti-MUC1 SP mAb SPmAb-2,1 og den MUC1 TRA mAb H23 til ES-2 MUC1-negative ovarieceller bare ved deres transfeksjon med den MUC1-TM ekspresjon konstruere (figur 2B).
celleoverflaten tilstedeværelse og likheten analyse av MUC1 SP domene og MUC1 TRA ble evaluert på OVACAR-3 MUC1-positive og ES-2 MUC1-negative tumorcellelinjer ved imagestream analyse ved hjelp PE og APC-merket anti-MUC1 SP mAbs SPmAb-2,1, SPmAb-6, og anti-MUC1 TRA H23 mAb (A). Fluorescens mikroskopi analyse ble også utført på ES-2 MUC1-transfektert eggstokkreft celler vs. mors MUC1-negative celler (B). BF står for lyse felt og videregående står for anti-mus IgG antistoffer.
Anti-MUC1 SP Antistoffer Bind MUC1-uttrykke MM plasmaceller i Fresh Bone Marrow aspirerer
Fersk fått bein marg (BM) aspirates av fire MM pasienter ble brukt for å undersøke om R23IgG antistoffer selektivt binde primærtumorceller i en ex-vivo, heterogene omgivelser. Mistenkt plasmaceller (PC) ble gated (fig. 3 kolonne A) og deres fenotype ble verifisert ved farging for kappa lett og lambda-kjeder (data ikke vist). Den gated populasjonen ble deretter analysert for ekspresjon av MUC1 TRA (fig. 3 kolonne C) og MUC1 SP (fig. 3 kolonne E) på CD138-positive celler. Arts-matchet kontrollantistoffer for MUC1 farging ble anvendt for hvert forsøk (fig. 3 kolonnene B og D). Den CD138-positive PC av BM aspirater av MM pasienter # 1, # 2 og # 3 bundet R23IgG (henholdsvis 78,2%, 66,3%, 95,9%,, av den analyserte cellepopulasjon) og H23 (78,3%, 59,2%, 93,2% henholdsvis, av den analyserte cellepopulasjon) (fig. 3 kolonnene C og E). I motsetning til dette, den fjerde aspireres (P # 4) viste lav reaktivitet til både H23 og R23IgG (0,37% og 0,45%, henholdsvis, av de analyserte populasjonen), til tross for moderate CD138 uttrykket (74,9% og 39,9% av cellene, henholdsvis) i denne aspirer. Som en kontroll ble fors vi en lignende strømningscytometri-analyse på en BM aspireres avledet fra et naivt, frisk donor. Celler i denne analysen ble inngjerdet for kappa og lambda uttrykk, som CD138 uttrykk var negativ (Fig. 3 kolonner F). Resultater (Fig. 3 kolonner G og H) bekreftet minimal binding av ~ 1% for både MUC1-TRA og MUC1 SP på begge kappa og lambda kjeder. Oppsummert viser disse funn at R23IgG og H23 spesifikt å gjenkjenne maligne PC, slik at MUC1 SP et antigen egnet for behandling utvalg og overvåkingsformål.
celleoverflate nærvær av MUC1 SP-domenet ble bedømt ved FACS-analyse på gated PC-celler i friske BM aspirater oppnådd fra MM pasienter (A-E) og normalt naive prøven (F-H). Polyklonalt anti-SP MUC1 (R23IgG) ble anvendt for å bestemme MUC1 SP uttrykk; MUC1 TRA domene ble bestemt med H23 mAb. For hvert forsøk ble arts matchet kontrollantistoffer for MUC1 farging brukt: enten normal muse-IgG-FITC (B), eller normalt kanin-IgG-FITC (D). Anti-MUC1 SP mAb (SPmAb-2.1) ble brukt til å fast MUC1 SP uttrykk; MUC1 TRA domene ble bestemt med H23 mAb.
mer avhengig cytotoksisitet formidlet av Anti-MUC1 SP Antistoffer
translatability av antigen og tumor særegen av anti-MUC1 SP antistoffer mot funksjonelt immunterapeutisk potensiale ble vist ved effektiv lysering av MUC1-uttrykkende celler ved R23IgG (fig. 4A), SPmAb-2,1 og SPmAb-6 (fig. 4B), som indikerer deres potensial som anti-tumor effektorer. R23IgG antistoffer mediert 60-100% lyse av solide OVACAR-3 eggstokkreft celler, og av hematologisk, U266, RPMI 8226, MM, ARH-77 og Ramos Leukemi tumorceller. På lignende måte, SPmAb-2,1 og SPmAb-6 utløst meget spesifikk lysis av 90% og 60-80%, henholdsvis, av de samme cellelinjer. Til sammenligning H23 indusert lyse av 80-90% av de testede celle-populasjoner (fig. 4B). Lysis indusert av alle anti-MUC1-antistoffer var svært signifikant (p 0,001 i t-test) i MUC1-uttrykkende tumorcellelinjer, sammenlignet med den ovarie cellelinje ES-2, melanoma cellelinje SK-Mel-1 og NHEC, tre MUC1-negative cellelinjer. Vanligvis CDC lyse effekt sterkt korrelert med MUC1 celleoverflate-ekspresjon nivåer, evaluert ved flow cytometri-analyse (tabell 2), med unntak av SPmAb-6-mAb, som viste høy celleoverflate nærvær men moderat CDC.
cytotoksiske egenskapene til anti-MUC1 SP polyklonale R23IgG (A) og monoklonalt SPmAb-2,1, SPmAb-6-mAb (B) ble evaluert ved CDC-analyse under anvendelse av forskjellige faste, ikke-faststoff, MUC1-positive og -negative tumorer og HMEC. Den MUC1 TRA domenespesifikke mAb H23, NMS og NRS og ingen (W /O) antistoffer ble evaluert som kontroller.
Diskusjoner
Til tross for omfattende forskning om immunterapeutisk potensialet i MUC1 det er fortsatt ingen lisensiert produkt mot dette målet. Unnlatelse av å isolere cellebundne, uløselige MUC1 epitoper har hindret utvikling av en effektiv MUC1 relaterte Immun agent. Betydelig fremskritt ble gjort av Rubinstein og kolleger [37] og mer nylig, etter Pichinuk og kolleger [24], som produserte antistoffer mot alfa /beta krysset av cellulære MUC1s. Disse antistoffene viste svært selektiv MUC1 bindende og indusert cytotoksisitet av MUC1-positive svulster, når koblet til en gift [24]. Basert på våre tidligere observasjoner av naturlig genererte anti-MUC1 SP autoantistoffer i MM pasienter, men ikke hos naive friske donorer, [34] denne studien valgt en annen strategi for å målrette den uløselige MUC1 SP domene. De R23IgG, SPmAb-2.1 og SPmAb-6 antistoffer vi hevet, spesielt bundet MUC1 SP, uten binding urelaterte SPS (Fig. 1A) og MUC1-TRA epitoper (Fig. 1B-E). De minimale epitoper gjenkjent av disse antistoffene ble lokalisert i den karboksyterminale av MUC1 SP (fig. 1C og 1E).
Tidligere observasjoner tyder på at SP-domener kan potensielt direkte proteiner til enten cellemembranen, eller det ekstracellulære rommet [33]. Uspaltede SP domener, som i tilfelle av proteaseinhibitorer, slik som plasminogen aktivator inhibitor-2 [38], eller dets chick homolog, ovalbumin [39], lede proteinet til ER og unnlater å støtte membranen dokking, hvilket ga utskillelse av intakt protein. I tilfellet med den lymfatisk choriomeningittvirus (LCMV) forløper glykoprotein C, blir innsettingen av proteinet inn i ER-membranen mediert av en uvanlig 58 aminosyre-lange SP bærer en utvidet N-terminale område.
