Abstract
Bakgrunn
I løpet av androgen ablasjon prostata kreft celler vekst og overlevelse bli uavhengig av normale reguleringsmekanismer. Disse androgen-uavhengig celler erverve bemerkelsesverdig evne til å tilpasse seg den omkringliggende mikromiljøet som faktorer, som nevrotransmittere, påvirke deres overlevelse. Selv om funnene blir tydelig om uttrykket av a
1A-adrenerge reseptorer i prostata kreft epitelceller, har ennå ikke etablert sin eksakte funksjonell rolle i androgen-uavhengig celler. Tidligere arbeid har vist at membranen lipid flåter forbundet med viktige signal proteiner mekle vekst og overlevelse signalveier i prostatakreftceller.
metodikk /hovedfunnene
For å analysere membranen topologien til α
1A-adrenoseptor vi utforsket sin tilstedeværelse ved en biokjemisk tilnærming i renset vaskemiddel resistente membran fraksjoner av androgen-uavhengig prostatakreft cellelinje DU145. Elektronmikroskopi observasjoner viste colocalisation av α
1A-adrenoceptor med caveolin-en, hovedproteinkomponenten av caveolae. I tillegg viste vi at agonist stimulering av α
1A-adrenoceptor indusert motstand mot thapsigargin-indusert apoptose, og at caveolin-1 var nødvendig for denne prosessen. Videre immunohistofluorescence avslørte forholdet mellom høye nivåer av α
1A-adrenoceptor og caveolin-1-ekspresjonen med avansert stadium prostatakreft. Vi viser også ved immunoblotting at TG-indusert apoptose motstand beskrevet i DU145 cellene er mediert av ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK).
Konklusjon /Betydning
I konklusjonen, foreslår vi at α
1A-adrenoseptor stimulering i androgen-uavhengig prostatakreftceller
via
caveolae utgjør en av de mekanismer som bidrar til deres beskyttelse fra TG-indusert apoptose
Citation. Katsogiannou M, Boustany CE , Gackiere F, Delcourt P, Athias A, Mariot P, et al. (2009) Caveolae Bidra til apoptoseresistens indusert av α
1A-adrenoseptor i androgen uavhengig prostata kreft celler. PLoS ONE 4 (9): e7068. doi: 10,1371 /journal.pone.0007068
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 02.06.2009; Godkjent: 25 august 2009; Publisert: 18.09.2009
Copyright: © 2009 Katsogiannou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den franske departementet for forskning og Universitetet i Lille 1, INSERM og Région Nord-Pas-de-Calais samt Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Nord) og Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste kreftformene hos menn og den andre årsaken til kreftdød i industrialiserte land [1]. Forskjellige faktorer som androgener og vekstfaktorer regulerer epitelcelleproliferasjon og apoptose i normal prostata og tidlige stadier av prostatakreft (PCA). Androgen ablasjon er for tiden det ledende terapi som brukes til å blokkere veksten av androgen-avhengige kreftceller. Men PCA cellenes spredning og overlevelse ofte bli uavhengig av regulatoriske mekanismer som fører til en hormon-refraktær sykdom [2] som det er i dag ingen vellykket behandling. Androgen-uavhengig PCA celler har bemerkelsesverdig evne til å tilpasse seg den omkringliggende mikromiljøet som har innflytelse på intracellulære overlevelse veier er fortsatt gjenstand for debatt [3]. Faktisk PCA cellene er i kontakt med ulike faktorer som for eksempel hormoner, vekstfaktorer og neurotransmittere som antas å påvirke fysiologien av disse cellene. Blant annet har interessen blitt vist for endogene katekolaminer noradrenalin og adrenalin. Faktisk subepiteliale stroma av prostata er spesielt rik på autonome nerver og α
1-adrenoseptorer (α
1-AR). Den α
1A-AR undertype, særlig finnes i glatte muskelceller, men dens ekspresjon er også blitt beskrevet i epitelceller [4], [5]. Den α
1A-AR er et medlem av superfamilien av G-protein koblede reseptorer (GPCR) mediere virkningene til de tidligere nevnte katekolaminer i en rekke celler [6].
α
1 -Ar-antagonister er allerede brukes for klinisk behandling av benign prostata hyperplasi (BPH) [7], hvor deres terapeutiske fordeler er knyttet til en direkte virkning på α
1-AR er tilstede i prostata glatte muskelceller [8]. Imidlertid har flere studier gitt bevis på ytterligere effekter av α
1-AR antagonister som doxazosin på langsiktig BPH behandling. Disse midler er blitt vist å hemme veksten prostata ved å indusere apoptose i stromale og epiteliale celler og er fremstår som potensielle terapeutiske regimer for forebygging og behandling av androgen-uavhengig PCa [9], [10], [11]. I tillegg tidligere studier fra kolleger på menneskers prostatakreft epitel (hPCE) celler og androgen-avhengige prostatakreft cellelinje LNCaP viste at fenylefrin (PHE), en α
1A-AR-agonist, stimulerer deres spredning [12 ], [1. 3]. Til tross for disse lovende funnene, har ennå ikke etablert den funksjonelle rollen α
1A-AR i androgen-uavhengig PCA celler.
Det har blitt beskrevet som signal og smugling av flere GPCR er regulert av spesialiserte plasmamembrandomener som er kjent som lipid flåter [14]. Dessuten har nylige data på kardiomyocytter vist at α
1-AR, så vel som de som er involvert i dens signaltransduksjonsbane molekyler er akkumulert i caveolae, en underklasse av membranmikroområder [15], [16]. Caveolae er 50-100 nm kolbe-formet plasmamembran invaginations, karakterisert v e på den ene side av høye innhold av kolesterol og glykosfingolipider og på den annen side ved tilstedeværelse av caveolin-1 (CAV-1), den store konstitutive protein på 20-25 kD [17]. Interessant nok har CAV-1 blitt forbundet med mange sykdommer som aterosklerose og Alzheimers sykdom [18], [19]. Når det gjelder dens rolle i kreft, har det blitt fastslått at PCa er forbundet med økt CAV-1-ekspresjon [20]. Faktisk har dette proteinet er identifisert som en markør assosiert med PCa progresjon og hormon-refraktær sykdom, som spiller en avgjørende rolle i den androgen-uavhengighet av PCA-celler [21]. Ved sin tilknytning til spesifikke reseptorer og enzymer på plasmamembranen, kan CAV-1 være en direkte formidler av overlevelse, vekst og metastase signaler i PCA celler [22].
Til dags dato, ikke mye er kjent om mekanismene bak nevrotransmittere engasjement i overlevelse av PCA celler, la stående rolle α
1A-AR i androgen-uavhengig epitelceller og PCa progresjon. I dette henseende, er det fristende å knytte nærvær av α
1A-AR og CAV-1 og til hypoteser om at α
1A-AR kan mediere
via
caveolae dens funksjonelle effekter på veksten eller overlevelse av avansert stadium PCA celler.
Målet med vårt arbeid var derfor å undersøke hvilken rolle den α
1A-AR i androgen-uavhengig PCA celler. Her undersøker vi tilstedeværelsen av α
1A-AR i caveolae av DU145 celler, en androgen-uavhengig PCa cellelinjen stammer fra hjernemetastaser. Vi analyserer konsekvensen av α
1A-AR stimulering av PHE på reseptoren og CAV-1 membranfordeling, så vel som dens effekt på lipidsammensetningen av membranflåte fraksjoner renset fra DU145-celler. Videre beskriver vi effekten av PHE i apoptose motstand av disse cellene ved aktivering av ERK og våre resultater antyder sterkt involvering av caveolae i denne signalveien. Til slutt, etter immunohistofluorescence og RT-PCR, ser vi en positiv korrelasjon av α
1A-AR og CAV-1 uttrykk og avansert stadium PCa. Tilstedeværelsen av α
1A-AR-rik caveolae kan derfor bidra til generalisert apoptoseresistens karakter androgen-uavhengig prostatavevet.
Metoder
Cell kultur
androgen-uavhengige humane prostatacancercellelinje DU145, erholdt fra American Type Culture Collection, ble holdt i kultur i RPMI 1640-medium (Life Technologies, Inc.) supplementert med 10% (v /v) FCS (Seromed, Poly-Labo, Strasbourg , Frankrike), 5 mM L-glutamin og 2 mM kanamycin (Sigma). Celler ble rutinemessig dyrket i 50 ml kolber (Nunc, PolyLabo, Strasbourg, Frankrike) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2-95% luftatmosfære. Disse cellene utgjør en passende modell for hjernemetastatisk kreft celler i hormon-ildfast prostatakreft.
Cell transfections og generering av CAV-en knock-down DU145 cellelinje
To klar-til- bruke sirnas mot α
1A-AR (siADR1A, Eurogentec) ble transient transfektert (50 nM) med HiPerfect Transfeksjon Reagens (Qiagen) i DU145 cellene. Kontroll siRNA (siCTL) Forsøkene ble utført ved trans siRNA mot Luciferase
siLuciferase (siCTL). 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 «. siADR1A-en (blanding av): 5»-CAGGAAAGAUGCAGAGGA-3 «og 5′-UUCCUCUGCAUCUUUCCU-3». siADR1A-2 (blanding av). 5′-GCGUCUACGUGGUGGCCA-3 «og 5′-UUGGCCACCACGUAGACG-3»
Stabile cellelinjer ble oppnådd ved å transfektere DU145-celler med en vektor som koder for Psuper kort hårnål RNA (shRNA) mot CAV-1 (sekvens: CTGGAATAAGTTCAAATTCTT 2121 3’utr) (DUshcav-1) (eller tom Psuper vektor for kontroll cellelinje, DUshCTL) bruker Nucleofector, som anbefalt av produsenten (Amaxa GmbH, Köln, Tyskland). Vi transfektert 2 x 10
6 trypsin-behandlet DU145-celler med 3 ug av vektoren og deretter brukt de transfekterte cellene for å pode en 24 brønners plate (Nunc) ved meget lav tetthet. Kloner underexpressing CAV-1 ble valgt på grunnlag av deres antibiotiske resistens mot puromycine og validert ved Western Blot.
Antistoffer og reagenser
Primære antistoffer som brukes for immunofluorescens (IF) mikroskopi og immunoblotting (IB ) var: (1:100) kanin anti-α
1A adrenoceptor (Santa Cruz Biotechnology), (1:100) kanin anti-caveolin-1 (Santa Cruz Biotechnology), (01:50) mus anti-caveolin- 1 (BD transduksjon Laboratories), (1:400) mus anti-β-aktin (Sigma), (1:200) anti-calnexin (Chemicon, Millipore, Paris, Frankrike), (1:1000) mus anti-cytokeratin 18 (Chemicon, Millipore, Paris, Frankrike), (1:1000) kanin anti-PARP (Cell Signaling), (1:100) mus anti-Bax (6A7) (Santa Cruz Biotechnology) gjenkjenne en utsatt epitop av Bax i den aktiverte konformasjon, (1:1000) kanin anti-procaspase 3 (UPSTATE), (1:1000) anti-fosfor-P44 /42 MAP kinase og (1:1000) anti-P44 /42 MAP kinase (Cell Signaling). Sekundære antistoffer som brukes for IB var: (1:10000) pepperrot-peroksidase-bundet anti-mus eller anti-kanin (Chemicon). For IF, brukte vi (1:1000) Alexa Fluor® 488-merket og (1:2000) 546-merket sekundære antistoffer (molekylære prober).
Celler ble behandlet med 10 mm L-Phenylephrine hydroklorid (PHE ), 1 uM prazosin (PRA) og 10 uM PD98059 i tre dager (fornyes hver 24 timer) og 10 uM Thapsigargin (TG) i 48 timer i RPMI-medium. Kortsiktige PHE behandlinger ble realisert i en oppløsning som inneholdt (mM): NaCl, 116; KCl, 5,6; CaCl
2, 1,8; MgCl
2, 1,2; NaHCO
3, 5; NaH
2PO
4, 1; HEPES, 20; pH 7,3. Alle kjemiske produkter ble levert av Sigma unntatt TG (Alomone) og PD98059 (Calbiochem).
Cell syklus analyse
Celler ble dyrket i tre 60 mm-retter per tilstand og narkotika ble brukt som beskrevet over. Etter behandling ble cellene trypsinert, høstet og resuspendert i 0,2 ml sterilt PBS. 1 ml kald 70% etanol ble tilsatt til cellesuspensjoner under virvling. Prøvene ble sentrifugert, vasket i steril PBS og deretter inkubert med ribonuklease (2 ug /ml) i 15 min. Propidiumjodid (25 ug /ml endelig i PBS-Triton X-100 0,1%) ble deretter tilsatt og inkubert i ytterligere 30 min. DNA-innhold ble målt ved å eksitere propidiumjodid ved 488 nm og måling av emisjon ved 520 nm (FL3) ved anvendelse av et strømningscytometer (Beckman Coulter Epics XL4-MCL med Expo32 anskaffelse). Eksperimentene ble gjentatt fire ganger.
Western Blot
cellekulturmediet ble fjernet og kolbene ble vasket med avkjølt PBS. Cellulære proteiner ble deretter ekstrahert ved bruk av RIPA-buffer [1% (v /v) Triton X-100, 1% (w /v) Na-deoksykolat, 150 mM NaCl og 20 mM natrium- eller kaliumfosfat, pH 7,2] med 5 mM EDTA og anti-proteaser cocktail (P8340; Sigma) i 30 min på is. Etter skraping, ble uoppløselig materiale fjernet ved sentrifugering ved 30000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C, og mengden av protein ble bestemt ved BCA-metoden (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA). Like mengder av proteiner ble underkastet SDS /PAGE (16% geler). Til slutt ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner ved hjelp av en halvtørr elektro blotter (Bio-Rad). Etter en time metning i 5% fettfri melk (eller 5% BSA (bovint serumalbumin) bare for anti-fosfor-P44 /42 MAPK), membraner ble inkubert over natten med fortynnet primære antistoffer (se «Antistoffer og reagenser»). Membranene ble deretter vasket (3 x 10 min) med en TNT-buffer (15 mM Tris /HCl, pH 8, 140 mM NaCl og 0,05% Tween 20) og behandlet med de tilsvarende pepperrotperoksidase bundne sekundære antistoffer (anti-mus eller anti-kanin, Pierce), (1:10000) fortynnet i TNT /melk (eller TNT /BSA) i en time ved romtemperatur. Etter flere gangers vask i TNT buffer ble membranene behandlet for kjemiluminescens deteksjon ved hjelp av Super Signal West Dura kjemiluminescenssubstrat (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner. Membranene ble til slutt utsatt for X-omat AR filmer (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA). Intensiteten av de signaler som ble evaluert ved densitometri og semi-kvantifisert ved hjelp av forholdet for hver prøve mellom intensiteten av proteinet av interesse dividert med aktin eller calnexin intensitet. Hvert eksperiment ble gjentatt minst to ganger.
Isolering av vaskemiddelbestandige membraner (DRM) og dot blot
Celler ble skylt, kuttes opp, sentrifugert og supernatanten ble fjernet. Pelleten ble resuspendert med isolasjon buffer B (i henhold til Axis-Shield S33 søknad Sheet) og homogenisert med en Dounce homogenisator (Kontes) på 15 um klaring støter deretter sentrifugert i 10 minutter ved 1000 x
g
. Supernatanten tilsvarende urene lipid flåten ekstrakt ble isolert og 0,2% Triton X-100 ble tilsatt. En diskontinuerlig 5-trinns Optiprep® (Axis-Shield PoC AS) gradient ble dannet med buffer D (buffer B + 1% Triton X-100) (vekt /volum) for å oppnå 1,66 ml 35%; 2,5 ml 20%; 2,5 ml 15%; 2,5 ml 10%; 0,83 ml av 5%. Rått lipid flåten ekstrakt ble gjort tett med sukrose (230 mg i 0,5 ml lysat) og lagt i grenseflaten mellom graderinger 35% og 20%. Ultrasentrifugering ved 165400 x
g
i 4 timer ved 4 ° C i 50 Ti-rotor (Beckman Coulter) ble etterfulgt av samling fra bunnen og opp til 1,1 ml fraksjoner. 1,1 ml 20% (volum /volum) TCA (trikloreddiksyre) ble tilsatt til hver fraksjon for å felle proteiner. Rørene holdt på is i 20 minutter ble sentrifugert ved 10000 x
g
ved 4 ° C i 10 min. Bunnfallet ble vasket med metanol, sentrifugert og deretter resuspendert i 4% (volum /volum) SDS. Siden prøvene ikke ble sterkt konsentrert i proteiner og påvisning av klassisk western blot var vanskelig å få tak i, prøver ble applisert på nitrocellulosemembran i en 96-brønns Dot-Blot-enhet i henhold til produsentens instruksjoner (Bio-Rad). Kort sagt ble de ti fraksjoner flekket på nitrocellulose-membran i serie. Når de er tørre, ble membranen inkubert i blokkeringsløsning i 1 time (TNT /melk) og deretter hybridisert med de ønskede antistoffene følgende klassiske IB prosedyre som beskrevet ovenfor (se «Western Blot»). Forholdsregler ble derfor tatt i å holde noen viktige faktorer konstant i de behandlede og ikke-behandlede betingelser. Celletetthet anvendt for eksperimentene var konstant og når det er kaldt vaskemiddel ekstraksjon ble utført både av konsentrasjonen av vaskemidlet og forholdet mellom celletallet /vaskemiddelkonsentrasjonen var de samme. Hver brønn ble fylt med 25 ul fra hver fraksjon. Denne standardiserte metode ble gjentatt minst tre ganger og ble brukt til å evaluere endringer i oppdeling av et målmolekyl i DRM, unngå falske estimater da på grunnlag av de relative mengder med hensyn til alle andre molekyler som er tilstede.
Kvantifisering av fosfatidylcholin (PC) og sphingomyelin (SM)
Lipidene ble ekstrahert i henhold til metoden til Folch et al. [23]. Dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC Sigma), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS Avanti Polar Lipids), lauroylsphingomyelin (LSM Avanti Polar Lipids) ble benyttet som interne standarder. Fosfolipid-analyse ble utført på en Hypersil Si 2 x 200 mm kolonne (Agilent Technologies, Massy, Frankrike) ved å følge protokollen [24]. Positive ESI-MS ble utført på en MSD 1100 Mass Spectrometer (Agilent Technologies). Åpningen spenning ble satt til 120 V, kapillær spenning på 3,5 kV, tørkegassen (nitrogen) strømmer på 8 l /min og skanning spenner fra m /z 400 til 950. Integrert topp var som fra ekstraherte ionekromatogrammer (EIC) for m /z = 700 til 950 ved retensjonstiden (RT) av PC, ble PS, SM dividert med EIC for m /z = 679 ved RT i DMPC, m /z = 681 ved RT i DMPS eller m /z = 647 ved RT i LSM. -Nivåer ble bestemt ved å sammenligne dette forholdet med en standardkurve av kjente mengder av fosfatidylcholin, og sphingomyelin.
Kvantifisering av kolesterol
Utvinning og forsåpningen ble utført i henhold til den tidligere beskrevne fremgangsmåten [25] med noen modifikasjoner. Kvantifisering av kolesterol ble utført ved hjelp av en HP6890 gasskromatograf utstyrt med en HP7683 Injector og en HP5973 Mass Selective Detector (Agilent Technologies). Kromatografi ble utført ved anvendelse av en HP-5MS av smeltet silisiumdioksyd kapillærkolonne (30 m x 0,25 mm indre diameter, 0,25 mikrometer filmtykkelse, Agilent Technologies). En utvalgt ion-overvåkings program ble anvendt for massespektrometri. Ionene som brukes til analyse (m /z) var som følger: epicoprostanol, 370; kolesterol, 368. Kalibreringskurver ble oppnådd ved å analysere standarder fremstilt fra autentiske standarder (Steraloids) og ekstrahert med metoden som brukes for prøver.
Ovennevnte kvantifisering protokoller for lipider og kolesterol ble gjentatt tre ganger for tre individuelle eksperimenter ikke-behandlede (kontroll) og behandlet DU145 celler med PHE i 10 min. Ettersom mengdene av lipider og kolesterol kvantifisert i hver fraksjon (ng /ml eller pg /ml) varierte noe mellom forsøkene ble resultatene normalisert ved å bestemme gjennomsnittsverdier for de tre forsøkene som er representert ved prosentandelen av lipid og kolesterol i hver fraksjon i kontrollforhold sammenlignet med PHE-behandlet forhold.
plasmamembran «Rip Off»
Denne metoden var basert på en protokoll som er publisert [26]. Celler ble dyrket på dekkglass. Formvar® belagt kobber rutenett (i henhold til [27]) ble belagt med polylysin. Dekk ble plassert celle side ned på nett og et lett trykk ble utøvet ved hjelp av en gummipropp da dekk ble snudd og gitrene ble nøye enebolig deretter fast i 8% (v /v) PFA (paraformaldehyde). Etter vasking i PBS og metning i PBS /2,5 mM, ble glycin /esel serum immunomerking utføres i henhold til standardteknikker, ved hjelp av primære antistoffer, etterfulgt av artsspesifikke anti-IgG-gullkonjugater til 6 nm, 12 nm og 18 nm. Endelig nett ble kontrastert og forberedt for observasjon på en Hitachi H-600 transmisjonselektronmikroskop (forstørrelse × 20 000) på 75 kV.
ultrastructural Mikros
For transmisjonselektronmikroskopi, Celler ble løst i 2,5% glutaraldehyd fremstilt i 0,1 M kakodylatbuffer og post-fiksert i 1% osmiumtetroksyd i den samme buffer. Etter dehydrering acetonitril, ble pelleten innebygd i Epon. Serie tynne snitt (90 nm) ble kuttet ved hjelp av en Reichert ULTRACUT E ultramicrotome og samlet på 150 mesh sekskantede sperret kobbernett. Etter farging med 2% uranylacetat forberedt i 50% etanol og inkubasjon med en ledelse citrate løsning, ble seksjonene observert på en Hitachi H-600 transmisjonselektronmikroskop.
Indirekte immunfluorescens
Reseksjon BPH eksemplarer fra human prostata frosset i flytende nitrogen kjølte isopentan og holdt i «Tissue-Tek®» ved -80 ° C før 10 um snitt ble fremstilt ved -20 ° C med en kryostat, montert på objektglass, og fortsatte å IF studien. Normal og kreft prostata vev ble levert av vev-array-lysbilder (SuperBioChips Laboratories), deparaffinized henhold til produsentens angivelser (Cliniscience) før forberedelsene til IF i henhold til [28]. Kort sagt ble alle lysbilder blokkert i løpet av 30 minutter med PBS /1,2% (v /v) gelatin og deretter inkubert med ønskede primære antistoffer i 1 time ved 37 ° C og deretter sekundære antistoffer (1H, 37 ° C). Imaging ble utført ved anvendelse av Zeiss LSM 510 konfokalt hode (Carl Zeiss) som er forbundet til et Zeiss Axiovert 200 M mikroskop med en 40 x olje-neddykking objektivlinse (numerisk apertur 1,45). Lysbilder ble skannet med en argon ion laser og en helium /neon ion laser. Alle skanne parametre ble holdt konstant gjennom de forskjellige forsøk. AIM 3.2 konfokal mikroskop programvare (Carl Zeiss) ble brukt for datainnsamling og analyse.
RT-PCR
Revers transkripsjon-PCR ble utført som beskrevet tidligere [29]. Den 178 pb α
1A-AR isoform en fragment ble forsterket med 5′-AGACCAATCCTCCTGTACCAC-3 «(fremover) og 5′-CTCTGCATCTTTCATGTCCTAG-3′ (bakover). Den 220 pb CAV-1 fragment ble forsterket med 5»-AGTGCTCCTGTTCTCCCTTC-3 «(fremover) og 5′-CTTGTCGATGGCTTCCTTCAC-3′ (bakover) (Eurogentec). Den 236 pb GAPDH amplicon internkontroll ble forsterket med 5»-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 «(fremover) og 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′ (bakover). Den 241 pb cytokeratin 18 amplicon ble forsterket med 5»-TGAGTCAGAGCTGGCACAGA-3 «(fremover) og 5′-TGGTGTCATTGGTCTCAGACA-3′ (bakover). Til slutt ble 210 pb cytokeratin 14 amplicon forsterket med 5»-TGCGAGATGGAGCAGCAGAA-3 «(fremover) og 5′-TGCCATCGTGCACATCCATGA-3» (bakover). a
1A-AR, CAV-1, cytokeratin 14 og 18 mRNA uttrykk ble validert ved analyse gel tetthet ved hjelp GAPDH mRNA som intern kontroll.
Menneske vevsprøver
Menneskelig BPH biopsier ble innhentet fra samtykkende pasienter etter de lokale etiske hensyn. Alle forsøk med pasient vev ble utført under godkjenningsnummer «CP 01/33 «, utstedt av den» Comité Consultatif beskyttelsen des Personnes dans la Recherche Biomédicale de Lille «.
Statistisk analyse
resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av uparet
t
tester (for å sammenligne to grupper) eller analyse av varians tester etterfulgt av Dunnett (for multippel kontroll
versus
test sammenligninger). Forskjeller ble betraktet som signifikant når
p
0,05 (*),
p
0,01 (**) og
p
0,001 (***).
Resultater
α
1A-AR er forbundet med CAV-1 på DU145 celleoverflaten
Tidligere studier har beskrevet en direkte interaksjon av α
1A AR med CAV-1 [15]. Videre α
1A-AR signalering er kjent for å lokalisere i caveolae [14], [30]. For å utforske membranen topologien av α
1A-AR, brukte vi «rip-off» teknikken utviklet i heftende celler slik isolasjon og observasjon ved elektronmikroskopi av store områder av plasmamembranen [26]. α
1A-AR immunogold farging (6 nm prikker, svart pilspiss) colocalizes med CAV-1 (18 nm prikker, hvit pilspiss) i plasma membran mikroområder på ca 50-100 nm (figur 1).
plasmamembraner ble «kruse-off» som beskrevet i avsnittet «Metoder» -delen og inkubert med anti-CAV-1 og anti-α
1A-AR-antistoffer. Sekundære antistoffer kombinert med 6 nm og 18 nm gullpartikler ble brukt mot anti-α
1A-AR (svart pilspiss) og henholdsvis anti-CAV-1 (hvit pilspiss). Rister ble deretter behandlet for elektronmikroskopi observasjon. Colocalization av begge proteiner er angitt med sirkler. Bar, 200 nm.
Plasma membran protein omfordeling og lipid komposisjon endringer i DRM fraksjoner indusert av fenylefrin
Analyse av plasmamembranmikroområder, caveolae eller lipid flåte sammensetningen begynner vanligvis med vaskemiddel solubilization av hele celler, etterfulgt av tetthetsgradient-sentrifugering og gjenvinning av DRM fra lette fraksjoner av gradienten. Vi undersøkte foreningen av α
1A-AR med renset DRM fra DU145 hele cellemembranen ekstrakter på en OptiPrep® tettshetsgradient. For karakterisering av DRM-fraksjoner, ble tilstedeværelse av et spesifikt plasmamembranen markør pan cadherin først vurderes som en positiv kontroll (figur 2A, a). Dets tilstedeværelse i alle 10 rensede fraksjoner viser at de isolerte fraksjonene DRM samsvarer med plasmamembranregioner. I tillegg ble det kjerneprotein PCNA (spredning cell nuclear antigen) og mitokondrie protein bax anvendt som negative kontroller som de er kjent for ikke å assosiere med plasmamembranen. Deres fravær i DRM-fraksjoner bekrefter fraværet av forurensning av intracellulære membraner (figur 2A, a).
(A) DRM fraksjoner av økende tetthet (fra fraksjon 1 til 10) erholdt som beskrevet i «Metoder» seksjon og analysert av Dot blot. (A) Pan cadherin ble anvendt som en positiv kontroll som bekrefter at de fraksjoner oppnådd svarer til plasmamembranen. PCNA (spredning cell nuclear antigen) og Bax ble anvendt som negative kontroller, deres fravær bekrefter den ikke-forurensende av DRM fraksjoner av intracellulære proteiner som er kjent for ikke å være forbundet med flåter. (B) Dot blot av DRM-fraksjonsoppsamling i kontroll tilstand (CTL) og 10 min behandling med 10 uM fenylefrin (PHE). Purinergiske reseptor P2Y2 ble anvendt som en negativ kontroll for spesifisiteten av virkningen av fenylefrin på protein omfordeling i fraksjoner. Svart firkant markerer skifte av α
1A-AR, CAV-1 og Gα
S11 protein fraksjoner lettere tetthet. (B) Lipid sammensetningen av de 10 fraksjoner ble kvantifisert som beskrevet i avsnittet «Metoder» -delen i kontroll (sort kolonne) og PHE behandlede celler (grå kolonner) av (a) lysofosfatidylcholin (LPC), (b) fosfatidylcholin (PC), (c) sfingomyelin (SM), (d) kolesterol. Feilfelt representerer SEM beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse brukt
t
test; *,
p
0,05, **,
p
0,01 og ***,
p
. 0,001
for å bestemme hvorvidt tidligere definerte mikroområder som er involvert i α
1A-AR signalveien i DU145-celler, undersøkte vi α
1A-AR stimulering av dens spesifikke agonist fenylefrin (PHE). Dot blot-analyse av DRM-fraksjoner viste fordeling av CAV-1 i gradient lav tetthet (5% -20%) Fraksjonene 1-6 og α
1A-AR i fraksjonene 1 og 3-6 i kontroll (CTL) betingelser. Etter 10 minutters behandling ved 10 uM PHE CAV-1 fordelingen ble observert i lav densitet-gradient (5% -10%) Fraksjonene 1-5 og α
1A-AR ble nå påvist i alle fraksjoner 1-6 (inkludert lav tetthet fraksjon 2) (figur 2A, b, øvre panel CTL, nedre panel PHE). Viktigere, Gα
S11 (en α
1A-AR effektor) innholdet viste et skifte fra fraksjoner 4-5 til fraksjoner 1 til 5 etter PHE behandling og fortsatt til stede i fraksjoner høyere tetthet, noe som tyder på at reseptor aktivering ikke involverer alle Gα
Q11 proteiner tilstede på membranen nivå. Vi vurderte også purinergiske reseptor P2Y2 anvendt som en negativ kontroll for spesifisiteten av modifikasjonen i proteinfordelingen forårsaket av PHE. α
1A-AR og P2Y2 er både GPCR dele lignende signalveier. P2Y2 ligger i de samme fraksjonene om DU145-cellene ble behandlet eller ikke (figur 2A, b, CTL og PHE), og derfor å demonstrere spesifisiteten av den tidligere observerte PHE-indusert modifisert protein fordeling.
I tillegg var vi interessert i lipidsammensetningen av rensede DRM-fraksjoner. Lipider som er kjent for å bli anriket i biologiske lipid flåter, såsom lysofosfatidylcholin (LPC), sfingomyelin (SM), fosfatidylcholin (PC) og kolesterol [31], [32], ble analysert. Nok en gang, undersøkte vi mulige endringer av lipid-sammensetningen av DRM-fraksjoner etter PHE stimulering. Våre observasjoner viser en betydelig økning i mengden av disse lipidene hovedsakelig i gradient lav tetthet (5% -10%) fraksjoner 1-5 som et resultat av stimulering PHE (figur 2B, a, b, c, d). Disse resultatene er i samsvar med godt etablert faktum at det høye fettinnholdet fører flytende av lipid mikroområder i fraksjoner lav tetthet under sentrifugering. Tidligere publiserte data på lipid-modellsystemer viser at størrelsen av lipid flåter er avhengig av lipid-membranen sammensetningen [33], [34]. De observerte endringer i fettsammensetninger som følge av membran omorganisering kan forklare mikroområder lettere tetthet som resulterer i omfordeling av α
1A-AR, CAV-1 og Gαq
11 observert innen DRM fraksjoner.
Protein og lipid reorganisering indusert ved fenylefrin er forbundet med CAV-1-rik membran clustering
det er antatt at ved ekstracellulær stimulus, blir plasmamembranen fremstilt for dannelse av mer stabiliserte domener og molekyl klynger med forbedret størrelse og levetid slik som caveolae [35], [36]. For å forstå involvering av caveolae i α
1A-AR signalering, utforsket vi effekten av PHE stimulering på DU145 celleoverflaten morfologi (figur 3A). Cellene ble behandlet i 10 minutter med 10 uM PHE byr på tallrike overflate invaginations svarende til caveolae (figur 3A, b) sammenlignet med ikke-behandlede celler (figur 3A, a). Caveolae er tydelig som sirkulære profiler med ensartet form og 50-80 nm diameter. I denne representative elektronmikroskop caveolae er til stede som enkeltgroper (figur 3A, b, svart pilspisser) og noen ganger i mer komplekse arrangementer koblet sammen med cytoplasmatiske caveolar profiler (figur 3A, B, hvite pilspisser).
(A) representative elektronmikrograf av DU145-celler i (a) ubehandlet tilstand (b) etter 10 min behandling med 10 uM PHE. Caveolae og caveolin inneholder vesikler med diameter 50-80 nm er tett i elektronene er angitt med svart pilspisser.
