Abstract
microRNAs (mirnas), ca 22-nukleotid ikke-kodende RNA-molekyler, regulere en rekke sentrale fysiologiske eller patologiske prosesser, inkludert embryoutvikling og tumorigenesis. For å oppnå helhetlige uttrykk profiler av mirnas i menneskelige embryo, preget vi miRNA uttrykket i ukene 4-6 av humane embryonale utvikling ved hjelp av miRNA mikromatriser og identifisert 50 menneske-embryo-spesifikke mirnas (HMS-mirnas). Videre valgte vi tre ikke-konserverte eller primat-spesifikke miRNAs, HSA-MIR-638, -720 og -1280, og undersøkt deres uttrykk nivåer i ulike normale og tumorvev. Resultatene viser at ekspresjon av de fleste mirnas er ekstremt lav i løpet av tidlig human embryonal utvikling. I tillegg er uttrykk for noen ikke-konservert eller primat-spesifikke mirnas signifikant forskjellig mellom svulst og de tilsvarende prøvene normale vev, noe som tyder på at mirnas er nært knyttet til patologiske prosesser i ulike svulster. Denne studien presenterer den første omfattende oversikt over miRNA uttrykk under humane embryonale utvikling og tilbyr umiddelbar bevis på forholdet mellom menneske tidlig embryoutvikling og tumorigenesis
Citation. Lin Y, Zeng Y, Zhang F, Xue L, Huang Z, W Li, et al. (2013) Karakterisering av mikroRNA Expression Profiles og Oppdagelsen av Novel microRNAs involvert i kreft i løpet av humane embryonale utvikling. PLoS ONE åtte (8): e69230. doi: 10,1371 /journal.pone.0069230
Redaktør: Wei Yan, University of Nevada School of Medicine, USA
mottatt: 15 mars 2013; Godkjent: 06.06.2013; Publisert: 02.08.2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) Grant 2006AA02A306, Natural Science Foundation of China Grant National 30871245 og 31271511. De finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er ~ 22-nukleotid (nt) ikke- -kodende RNA-molekyler som regulerer genekspresjonen på nivået av budbringer-RNA degradering eller translasjon, utøve viktige funksjoner i uensartede biologiske prosesser som strekker seg fra cellesyklusregulering, differensiering og metabolisme, til normalt vev og embryo utvikling, og til og med tumorgenese [1-4] . Endringer i miRNA uttrykket er involvert i initiering, progresjon, og metastasering av humane tumorer [5]. Gradvis økende bevis tyder på en direkte kobling mellom mirnas og mange sykdommer, spesielt kreft.
Ved hjelp av ulike eksperimentelle metoder, tidligere studier i dyr embryogenese funnet at visse mirnas ble kontinuerlig rapportert, og de fleste spiller avgjørende roller i differensiering eller vedlikehold vev identitet [6-10]. Menneskelig utvikling i de første 8 ukene av embryogenese er potensielt en av de mest spennende områdene i biologisk forskning. Nærmere bestemt, noen viktige vev og organer, inkludert nevrogenesen og utviklingen av leveren, begynte å dannes i løpet av ukene 4-6 (Carnegie stadier 10-17) humant embryogenese [11]. Nylig har vår forskningsgruppe og andre preget transkripsjons profiler av genom-wide mRNA uttrykk i menneskelig embryo bruker microarray [12,13]. Men fortsatt menneskelige miRNA uttrykket i denne perioden ikke klarlagt.
Mange studier har vist at mirnas er innblandet i ulike aspekter av tumordannelse og dyr embryogenese (Anmeldt i 4,5,14-21). I 1892 den franske biologer Lobstein og Recamier spekulert begrepet embryonale opprinnelse av svulster for første gang. I 1970, Dr. Pierce foreslo teorien «kreft, en utviklingsbiologi», og påpekte at tumorigenesis var nært involvert med utviklingsbiologi i stor grad [22-27]. Foreløpig er imidlertid relevant bevis på forholdet mellom begynnelsen av menneskelig embryo utvikling og tumorigenesis er fortsatt begrenset [28-32]. For å fylle denne viktige kunnskapshull, derfor flere studier er nødvendig.
I denne studien, miRNA uttrykket profil ved humane embryonale utvikling ble identifisert og karakterisert ved hjelp mirnas mikromatriser. Resultatene viser at nesten alle mirnas med kjent funksjon som er høyt uttrykte eller oppviser uttrykk endringer i løpet av humane embryonale utvikling har vært implisert i en rekke ondartede sykdommer. Videre er vev ekspresjons undersøkelser av flere mirnas med ukjent funksjon som er høyt uttrykte eller gjennomgå uttrykk endringer i løpet av human embryoutvikling indikerer at ekspresjon av disse mirnas var signifikant forskjellig mellom kreftprøvene og tilsvarende normale vev, og dermed tyder på at disse mirnas kan også spille viktige roller i tumorigenesis. Disse resultatene gir bevis om det nære forholdet mellom menneske embryogenese og kreftutvikling, og videre avsløre at mirnas knyttet til embryoutvikling med ukjente funksjoner kan være involvert i utvikling og progresjon av kreft.
Materialer og Metoder
embryo samling og cellelinjen
humant embryo samlingen ble utført som tidligere beskrevet [13]. Passende skriftlig samtykke er innhentet fra pasienter og godkjenning fått fra medisinsk etikk komité Zhongnan Hospital ved Wuhan University ved å følge nasjonale retningslinjer.
Microarray og bioinformatikk Analyser
microRNAs microarray-analysen ble utført ved hjelp av en tjenesteleverandør (LC Sciences). Analysen startet med 2 til 5 ug total RNA prøve, som var størrelse fraksjonert ved hjelp av en YM-100 Microcon sentrifugale filter (Millipore). De isolerte små RNA ( 300 nt) var 3′-forlenget med en poly (A) halen ved bruk av poly (A) polymerase. En oligonukleotid-tag ble ligert til poly (A) hale for senere fluorescerende fargestoff flekker; to forskjellige koder ble brukt for de to RNA prøver i dual-sample eksperimenter. Hybridisering ble utført over natten på en
μ
Paraflo ™ microfluidic chip ved hjelp av en mikropumpe (Ataktiske Technologies) [33,34]. På mikrofluid chip, hvert deteksjons sonde besto av et kjemisk modifisert nukleotid-kodende segment komplementær til target mikroRNA (fra miRBase, https://www.mirbase.org/) eller annet RNA (kontroll eller kunde definert sekvenser) samt en spacer segment av polyetylenglykol for å forlenge det kodende segmentet bort fra substratet. Deteksjons prober ble samlet inn
in situ
syntese ved hjelp av PGR (foto-reagens) kjemi. Hybridiserings smeltetemperaturer ble balansert ved kjemiske modifikasjoner av deteksjonsprober. Hybridisering anvendt 100 ul 6xSSPE buffer (0,90 M NaCl, 60 mM Na
2HPO
4, 6 mM EDTA, pH 6,8) inneholdende 25% formamid ved 34 ° C. Etter hybridisering brukes deteksjon fluorescens merking med merkelapp-spesifikk Cy3 og Cy5 fargestoffer. Hybridisering bilder ble samlet inn ved hjelp av en laserskanner (GenePix 4000B, Molecular Device) og digitalisert ved hjelp av Array-Pro bildeanalyse programvare (Media Cybernetics). Data ble analysert ved først å trekke bakgrunnen og normalisere signalene ved hjelp av en LOWESS filter (lokalt vektet regresjon) [35]. For to-farge eksperimenter, forholdet mellom de to sett av detekterte signaler (log
2 transformert, balansert) og p-verdiene for de t-tester ble beregnet; differensielt detekterte signaler var de med p-verdier mindre enn 0,01. Den normaliserte signal intensitet fra 8 prøver (uke 4 av humane embryonale utvikling: ZN18, ZN46 /47, ZN75, Uke 5: ZN38, ZN43, ZN63-1, uke 6: ZN61, ZN70) ble brukt clustering analyse ved hjelp av en en- enveis variansanalyse (ANOVA) av en tjenesteleverandør (LC Sciences). Normaliserte data for alle matriser er blitt deponert i Gene Expression Omnibus (GEO) ved Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI), tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE46795 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo /query/acc.cgi?acc=GSE46795).
Høy tetthet flere organ tumor og mikromatriser normalt vev (Katalog MC5003), som inneholder 18 krefttyper (20 tilfeller per type) og normale tilsvarende kontroller (5 tilfeller per type), ble kjøpt fra USA Biomaks. Mirna og egge oligonukleotider for
i situ
hybridisering ble kjøpt som digoxigeninmerket låst nukleinsyre (LNA) prober fra Exiqon (Danmark). Sekvensen av de LNA deteksjonsprober var: LNA-638: 5′-DIG-AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCT-3 «; LNA-720: 5»-DIG-TGGAGGCCCCAGCGAGA-3 «; og LNA-1280: 5»-DIG-GGGTGGCAGCGGTGGGA-3 «. LNA-U6: 5»-DIG-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3 «og LNA-krafse: 5′-DIG-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3» ble anvendt som positive og negative kontroll prober, respektivt.
in situ
hybridisering av vev array for mirnas experssion ble utført ved hjelp av en tjenesteleverandør (Shaanxi Chaoying Bioteknologi CO, LTD, Shaanxi Kina), og lysbilder ble lest av to uavhengige forskere. Intensiteten av fargingen ble bedømt som negative (- /0)., Svak (+ /1), moderat (++ /2), eller sterk (+++ /3) som tidligere beskrevet [36,37]
miRNA sanntid polymerase chain reaction (PCR)
miRNA RT-PCR-analyse ble utført ved hjelp av en tjenesteleverandør (LC Sciences). Kort fortalt ble miRNA quantifications undersøkt ved hjelp av TaqMan
® mikroRNA Analyser og TaqMan® Universal PCR Master Mix og analysert av ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. RNU24 ble anvendt som en intern kontroll for å bestemme relativ miRNA uttrykk. Hver prøve ble utført in triplo.
Statistiske analyser
Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble utført ved å bruke de normaliserte data for uke 4-6 for å identifisere mirnas hvis uttrykk endret. Å sammenligne mirnas uttrykk i menneskelige normale og kreft vev, tosidige Student
t
tester ble utført ved hjelp av de ovennevnte score av prøvene.
Diskusjon
Resultater og
Karakterisering av miRNA uttrykksprofil ved humane embryonale utvikling
for å identifisere miRNA uttrykket profiler av menneskelige embryoer, ble miRNA microarrays analyser utført i menneskelig embryo prøver (uker 4, 5 og 6 etter befruktning) ved hjelp μParaflo® teknologi, og mikromatriser rådata ble analysert. Matrisen dekker alle miRNA transkripsjoner tilgjengelige i Sanger miRBase database (slipper 10,1). For detaljer, se de eksperimentelle prosedyrer og Supplemental Data (Tabell S1 tilgjengelig på nettet). Følgelig mirnas oppviser signalstyrke er større enn 32 ble ansett som påvist ekspresjon. Etter normalisering, ble et sterkt signal terskel av miRNA påvisning definert som 500 (figur 1). Vi har betegnet disse 50 mirnas (~ 6%), hvor uttrykket signal var større enn 500 av hvilket som helst trinn i uke 4, 5 eller 6 i løpet av humane embryoutvikling, som menneskelige embryo-spesifikke mirnas (HES-mirnas) (tabell 1 ).
miRNA uttrykk nivåer i løpet av humane embryonale utvikling (uke 4, 5, og 6 etter befruktning) med signalstyrke større 32 ble ansett som oppdaget uttrykk. En sterkt signal terskelen til miRNA påvisning ble definert som 500 etter normalisering. Mirnas med fluorescens signal større enn 500 på ethvert stadium i uke 4, 5 eller 6 ble definert som HMS-mirnas.
MiRNA
Uke 4
Uke 5
Uke 6
hsa-miR-1031020.97589.63775.30hsa-miR-106a3717.471283.56988.08hsa-miR-106b705.36336.58217.08hsa-miR-107837.20446.95520.07hsa-miR-10b1679.971511.97688.29hsa-miR-1224805.009396.8510671.26hsa-miR-1246356.13816.55100.26hsa-miR-125a-5p387.96827.091146.67hsa-miR-125b558.09937.533407.28hsa-miR-126513.43257.52195.18hsa-miR-126867.10212.18725.03hsa-miR-1275238.04928.53413.71hsa-miR-1280189.87292.811238.08hsa-miR-130a522.76130.33161.38hsa-miR-130b827.85593.00936.95hsa-miR-151-5p713.59579.19423.27hsa-miR-15b1041.17788.21368.30hsa-miR-161080.15395.87286.75hsa-miR-174108.911437.681210.55hsa-miR-181a312.21269.73741.07hsa-miR-181b192.98187.58873.77hsa-miR-182341.78579.71453.59hsa-miR-191482.51483.55631.69hsa-miR-199a-3p1284.651201.391165.51hsa-miR-19b758.72559.73223.40hsa-miR-206791.121067.481658.21hsa-miR-20a3614.131105.53804.23hsa-miR-20b1471.15540.45323.50hsa-miR-2142654.733566.049605.29hsa-miR-23b745.25594.28767.96hsa-miR-251871.251553.321021.11hsa-miR-26a4645.233390.432536.21hsa-miR-320a1849.633185.424495.39hsa-miR-320b1358.111904.943209.74hsa-miR-320c1666.092358.804068.96hsa-miR-320d790.281072.821897.73hsa-miR-361-5p751.92719.17643.41hsa-miR-423-5p553.06888.43400.99hsa-miR-432499.71807.49534.52hsa-miR-4511355.12622.2018.66hsa-miR-483-5p480.512580.411537.07hsa-miR-574-5p163.53375.89709.17hsa-miR-6384622.856092.422891.58hsa-miR-663290.15525.9244.41hsa-miR-720101.92181.661255.10hsa-miR-92a11338.0811838.016909.45hsa-miR-92b4171.404315.192556.64hsa-miR-93872.20552.87445.45hsa-miR-936323.52512.7235.61hsa-miR-99b510.57635.731232.78Table 1. Liste over menneske-embryo-spesifikke-miRNAs.
Etter normalisering, ble et sterkt signal terskel av miRNA påvisning definert som 500 (figur 1), og 50 mirnas (~ 6%, 50/835), hvor uttrykket signal var større enn 500 av hvilket som helst trinn i uke 4 , 5, eller 6 i løpet av humane embryoutvikling, ble betegnet som menneske-embryo-spesifikke mirnas (HES-mirnas). CSV Last ned CSV
Uttrykket profiler viser at uttrykket av de fleste miRNAs er lavt under tidlig menneskelig embryoutvikling, der ca 80% av miRNAs (666 av 835 miRNAs) stiller signalstyrke ble ansett som uoppdaget uttrykk (figur 1 og tabell S1). Disse dataene er lik funn at de fleste mirnas ikke ble oppdaget under tidlig sebrafisk utvikling [10]. Hierarkiske klase analyser av HMS-miRNA uttrykket (figur 2A) og 169 mirnas stiller signalstyrke over 32 (figur S1) i løpet av humane embryonale utvikling vises. I figur 2A, ble følgende tre klynger av HMS-mirnas uttrykk identifisert: Cluster en, oppregulert i uke 6; Cluster b, nedregulert i uke 6; og Cluster c, oppregulert i uke 4. I figur S1 ble fire klynger av 169 mirnas identifisert: klynger 1, 2, 3 og 4. Cluster en mirnas i figur 2A økt de tre menneskelige embryonale stadier (uke 6 uke 5 uke 4), og inkludert noen miRNA arter rapportert å bli beriket i ulike utviklings og sykdomsprosesser (f.eks HSA-MIR-122, -206, -214, -181 familie, og -125 familie) [38]. Cluster c mirnas at redusert i løpet av de tre menneskelige embryonale stadier (uke 4 uke 5 uke 6) inkludert noen mirnas som ble også beriket i ulike utviklings og sykdomsprosesser (f.eks HSA-MIR-451, -106, -16 og -17) (figur 2A) [38]. Men uttrykket av mange cluster b medlemmer som økte fra uke 4 til uke 5, men gikk ned fra uke 5 til uke 6, har ukjente funksjoner i utviklings- og sykdomsprosesser.
(A) Femti HMS-mirnas var delt inn i 3 grupper: klynger a, b, og c. Pilen viser mirnas som ble valgt for ytterligere å validere microarray data ved hjelp av mikroRNA QRT-PCR (figur 3). Stjernen viser ikke-konservert eller primat-spesifikke HMS-mirnas (figur S4). Den hule trekant indikerer mirnas harborring samme frø region sekvens blant klynge c. (B) Figur 2B viser modne sekvens av seks mirnas (MIR-17, -106a, -106b, ^ 20, -20b, -93) med identisk frø regionen merket med lys rød skygge. (C) Pie Figuren viser funksjonelt mønster analyse (Gene ontologi) av de konserverte mål (1245 transkripsjoner), spådd av TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_60/), av de seks miRNAs.
Blant HMS-mirnas (tabell 1 og figur 2A), noen har testet og bekreftet å spille sentrale roller i differensiering og sykdom. For eksempel, pattedyrleverspesifikke miRNA, MIR-122, som hadde det høyeste ekspresjonsnivået i uke 6 av humane embryonale utvikling, er ofte undertrykkes i primær levercellekarsinom [39,40], og er også viktig for hepatitt C-virus-RNA opphopning i dyrkede leverceller [10,41-47]. Hsa-MIR-214 er relatert til muskelutvikling og beindannelse, og er involvert i mage og eggstokkreft [48-53]. Hsa-MIR-92a /b, som medlemmer av MIR-17 ~ 92 familie, er involvert i mange solide svulster og leukemi [54-57]. Hsa-MIR-106a er involvert i reguleringen av indusert pluripotent stamcelle generasjon, posttranskripsjonelt regulering av interleukin-10 uttrykk, magekreft, og astrocytom [58-61]. Derfor våre resultater støtter sterkt ideen om at det er slående likheten mellom tidlig embryoutvikling og tumorigenesis [22].
Videre disse høyt uttrykte mirnas, samt de som har lavt uttrykk, kan spille ulike regulerings roller i forskjellige stadier av humane embryonale utvikling. Alternativt disse mirnas med høy uttrykk nivåer har sterk vev spesifisitet, slik som HSA-MIR-122.
Blant klynge c, er det utrolig at vi la merke til 6 mirnas (HSA-MIR-17, -106a, -106b , ^ 20, -20b og -93), som inneholder samme frø region sequcence AAAGUG (figur 2B), ble nedregulert i uke 6 av humane embryonale utvikling, og kan spille tilsvarende biologiske funksjoner i menneskets embryogenese. De Hannon og Hammond laboratorier er gitt direkte eksperimentelle resultatene at disse microRNAs, kodet av Mir-17-92 klyngen og dens paraloger (MIR-106a-363 klynge og MIR-106b-25 klynger), har onkogen aktivitet i solid tumor [62 ]. Ventura og kolleger dokumentert sterke bevis på at sletting av Mir-17-92 klynge resulterte i alvorlig hypoplastisk lungene og reduksjon i pre-B-celler tall i mus, endelig fører til mindre embryoer selv umiddelbare postnatal død [63]. Tatt i betraktning den viktige rollen av disse miRNAs i utvikling og tumorigenesis, spådde vi alle mål av disse 6 mirnas av TargetScan, og deretter de konserverte mål (1245 transkripsjoner) ble videre analysert. I løpet av tidlig stadium av humane embryonale utvikling, en viktig hendelse i forbindelse med den utviklingsmessige overgangen fra den tidlige celleproliferasjon fase til organogenese og histogenesis er at antall stamceller eller udifferensierte celler er redusert fordi flere cellene begynner å differensiere til annet organ /vevs- spesifikke celletyper. I løpet av tidlig stadium av humane embryonale utvikling, en viktig hendelse i forbindelse med den utviklingsmessige overgangen fra den tidlige celleproliferasjon fase til organogenese og histogenesis er presentert. Funksjonell mønsteranalyse (Gene ontologi) fra den konserverte mål (1245 transkripsjoner) av 6 mirnas viser at de aller fleste av disse genene i Gå kategorier knyttet til biologisk regulering, regulering av biologisk prosess, metabilic prosess, cellulære prosessen, flercellet organisme prosess og utviklingsprosess (figur 2C). Nylig rapporterte noen mål av MIR-17 ~ 92 familie, for eksempel CDKN1A (p21) [64], BIM [65], RUNX1 [66], begge inngår i disse gå kategorier, som tyder på at disse genene er uerstattelig posisjon i kontroll av cellesyklus, celle apopotosis, og differensiering av hematopoietiske stamceller. Og disse resultatene kan hjelpe oss å bedre forstå den rollen som HMS-miRNAs i menneskets embryogenese og tumorigenesis.
I tillegg til å validere kvaliteten på miRNA microarray data, fire mirnas (HSA-MIR-125b, -720 , -1280, og -20b, Figur 3 og Figur S2) som uttrykk nivåer endret seg vesentlig i utviklingen ble validert ved hjelp TaqMan® real-time RT-PCR miRNA analyser. Trendene av miRNA uttrykket var i samsvar med det som ble observert i miRNA microarray data (figur 3B, C, D og E).
Fire mirnas [HSA-MIR-125b (B), HSA-MIR-720 (C), hSA-MIR-1280 (D), og hSA-MIR-20b (E)], som ble uttrykt forskjellig (p 0,05, figur 3A) og (p 0,10, figur S2) i uke 4, 5 og 6 av humane embryonale utvikling, ble valgt. QRT-PCR ble utført og U6 snRNA ble brukt som en intern kontroll for å bestemme den relative miRNA uttrykket.
Human-Mouse Komparative analyser av miRNA uttrykk under embryonal utvikling
Å sammenligne miRNA uttrykk profiler mellom menneske og mus embryonale utvikling, gjennomførte vi en komparativ analyse i forhold til tidligere publiserte mikroRNA uttrykk profiler i museembryoer dekker prenatal utvikling (E9.5, E10.5 og E11.5) [8], som korresponderer med uker 4, 5 og 6 av humane embryonale utvikling [67,68]. Gitt de samme mirnas i mennesker og mus, bygget vi et kryss analyse mellom 835 mennesker mirnas i denne studien og 390 mus mirnas, og identifisert 195 homologe mirnas (Tabell S2). De hierarkiske clustering analyser av human-mus homologienheter mirnas er vist i figur S3A og B. Venn-diagrammer (Tall S3C og s3D) viste at 38 eller 32 human-mus homologienheter mirnas ble oppregulert eller nedregulert, henholdsvis i løpet av mennesker og mus embryonale utvikling. Blant disse mirnas, la-syv familiemedlemmer, MIR-34a, MIR-221/222, MIR-145, har MIR-125b, MIR-15a, og MIR-223 har vist seg å spille mangfoldige roller under utvikling og patogenesen i ulike pattedyr organer [38]. Disse resultatene videre foreslå at noen homologe human-mus mirnas er viktig for utvikling og patogenesen, mens de som ikke er homologe sannsynligvis involvert i ulike utviklingsprosesser som gjenspeiler utviklings divergens mellom menneske og mus.
Konservative egenskaper HMS-mirnas
en tidligere studie viste at mange kjente miRNA gener har en typisk bevaring mønster, vedvarende gjennom klynger, noe som tyder på evolusjonære og funksjonelle implikasjoner [69]. Imidlertid er en vesentlig del av microRNAs bekreftet som ikke-konserverte eller primat-spesifikke mirnas fordi mange nye mennesker mirnas har vært kontinuerlig identifisert [70]. For å definere bevaring av HMS-miRNAs, brukte vi miRviewer [71], som viser bevaring av miRNA gener gruppert etter navn. Som vist i fig S4, er de fleste HMS-mirnas svært konservert, og deres funksjoner er velkjente. Bemerkelsesverdig, blant HMS-mirnas, åtte mirnas, HSA-MIR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, og -1280, er ekstremt ikke-konservert, selv om de fleste er primate- spesifikke (figur S4) [70,72]. Merkbart, peak uttrykket verdiene av fem av disse miRNAs, MIR-638, -663, -936, -1246, og -1275, er på 5 uker av humane embryonale utvikling. Med andre ord, kan disse mirnas fungere bare ved en bestemt humane embryonale utviklingsstadiet. Videre vet vi svært lite om de biologiske funksjonene til disse mirnas i pattedyr organogeneseperioden og patogenesen. Men fordi uttrykket av disse ikke-konserverte eller primat-spesifikke miRNAs er høy under humane embryonale utvikling, disse mirnas sannsynlig spille sentrale roller i pattedyr organogeneseperioden og /eller patogenesen. Faktisk er noen studier indikerer at disse ikke-konservert eller primat-spesifikk HES-mirnas kan være forbundet med en rekke sykdoms [73-82]. Funksjonen til disse ikke-konservert eller primat-spesifikke HMS-mirnas gjenstår å fastslå.
Komparative analyser av uttrykket av HSA-MIR-638, -720 og -1280 i normale og maligne vev
Mange studier har indikert at mirnas er involvert i ulike aspekter av dyre utviklingsprosesser og sykdom [4,16-21,38,83-89]. For ytterligere å validere forholdet mellom HMS-mirnas og ulike solide maligne svulster, fokuserer vi på tre ikke-konservert eller primat-spesifikke HMS-mirnas, HSA-MIR-638, -720 og -1280 (tabell 1), av svært uttrykt eller stille uttrykk endringer i uke 4-6 av humane embryonale utvikling for ytterligere funksjonell undersøkelse. Vi undersøkte hvorvidt ekspresjon av tre HES-mirnas varierer sterkt mellom forskjellige humane tumorer og tilsvarende normale vev.
Ved hjelp av vev microarray MC5003 og høyt spesifikke og sensitive LNA-modifisert oligonukleotidprober, ekspresjonsproduktene profiler av 3 mirnas i normale og kreft vev ble oppdaget ved hjelp av
in situ
hybridisering. U6 snoRNA og krafse-Mir prober ble brukt som positive og negative kontroll sonder, henholdsvis. De statistiske resultatene viser at ekspresjon av HSA-MIR-638 signifikant oppregulert i hepatocellulære leverkreft vev (n = 20) i forhold til normale levervev (n = 5) (p = 0,0092), og i cervix uteri squamous cellekreft vev ( n = 18) i forhold til normale livmorhals vev (n = 7) (p = 0,0003). I motsetning til dette, ble ekspresjon av HSA-MIR-638 signifikant nedregulert i magen adenokarsinom vev (n = 19) i forhold til normale mage vev (n = 6) (p = 0,0095) (figur 4A). Disse dataene er enig med resultatene fra Tsukamoto et al. viser nedregulering av denne miRNA i magekreft [90]. HSA-MIR-720 uttrykk er betydelig oppregulert i livmorhals plateepitelkarsinom vev (n = 18) versus normal livmorhals vev (n = 6) (p = 0,0086), i lungene plateepitelkarsinom /adenokarsinom vev (n = 17) versus normalt lungevev (n = 6) (p = 0,0386), i eggstokk cystadenocarcinoma /adenokarsinom vev (n = 18) i forhold til normale eggstokk vev (n = 6) (p = 0,04045), og i urothelial karsinom vev (n = 17 ) i forhold til normale vesica urinaria vev (n = 5) (p = 0,03504) (figur 4B). I tillegg er HSA-MIR-720 signifikant ekspresjon nedregulert i tarmslimhinne ondartet vev (n = 19) i forhold til normal hud vev (n = 9) (p = 0,0017) (figur 4B). Uttrykket av HSA-MIR-1280 er betydelig nedregulert i plateepitelkarsinom vev i hode og nakke hud (n = 20) versus normal hud vev (n = 9) (p 0,0001), i tarmslimhinne ondartet vev (n = 20 ) sammenlignet med normal hud vev (n = 9) (p = 0,0009), og i pankreas adenokarsinom vev (n = 17) i forhold til normale pankreatiske vev (n = 6) (p = 0,0270) (figur 4C). I kontrast er HSA-MIR-1280 uttrykk signifikant oppregulert i livmorhals plateepitelkarsinom vev (n = 17) versus normal livmorhals vev (n = 7) (p = 0,01076) (Figur 4C). Representative eksempler på tre mirnas som ble differensielt uttrykte i tumorvev versus normale vev er vist i figurene 5, S5, S6 og S7. Resultatene tyder på at disse HMS-mirnas er nært knyttet til de patologiske prosessene i de ulike svulstene.
Høy tetthet flere organ svulsten og normal microarray som inneholder 500 tissue-punkter med 18 krefttyper og normale tilhørende kontroll vev . Digoxigeninmerket låst nukleinsyre (LNA) prober (LNA-638, LNA-720, og LNA-1280) ble brukt til å spesifikt påvise miRNA uttrykket i vevet chip. (A) Avvikende uttrykk for HSA-MIR-638 på vev microarray. Betydelig oppregulering av MIR-638 kan observeres i hepatocellulær leverkreft og livmorhalskreft plateepitelkarsinom. MIR-638 nedregulering er funnet i magesekken adenokarsinom sammenlignet med de tilsvarende normale vev (p = 0,0092 p = 0,0003, og p = 0,0095, henholdsvis) (B) Aberrant ekspresjon av HSA-MIR-720 på vev microarray. Hsa-MIR-720 er betydelig oppregulert i livmorhals plateepitelkarsinom, lunge plateepitelkreft adenokarsinom, eggstokk adenokarsinom, og urothelial karsinom kontra tilsvarende normalt vev (p = 0,0086, p = 0,0386, p = 0.0404, og p = 0,035, henholdsvis ). Hsa-MIR-720 er betydelig nedregulert i tarmslimhinne ondartet vev versus normal hud vev (p = 0,0017). (C) Aberrant uttrykk for HSA-MIR-1280 på vev microarray. Hsa-MIR-1280 er nedregulert i plateepitelkarsinom, tarmslimhinnen ondartet vev, og bukspyttkjertelen adenokarsinom kontra tilsvarende normalt vev (p 0,0001, p = 0,0009, og p = 0,0270, henholdsvis). Hsa-MIR-1280 er oppregulert betydelig i livmorhals plateepitelkarsinom vev versus normale livmorhals vev (p = 0,01076). MiRNA uttrykket nivåer (y-akse) med en score = 0, 1, 2 eller 3, indikerer negative, svak, medium eller sterk fargeintensitet, henholdsvis. n angir antall prøvene studert. NT viser normale vevsprøver; CT indikerer carcinoma vevsprøver. To-tailed student
t
tester ble utført for å sammenligne miRNA uttrykket i normale og kreftvevet.
Paneler en gjennom t-show mage adenokarsinom prøver og paneler u gjennom z-show normal mage vev . Den blå flekker signal indikerer uttrykk for HSA-MIR-638. Den røde flekker viser cellekjernen (skala 200 um som figur 5a). j2 viser høyere forstørrelse (5x) av det angitte området i figur 5j, og z2 viser høyere forstørrelse (5x) av det angitte området i figur 5Z.
I sammendraget, våre studier her avsløre at uttrykket nivåer av de fleste mirnas løpet av human embryogenese er svært lave. Vi har betegnet 50 (~ 6%) av de 835 mirnas reguleres i uke 4 til og med 6 av humane embryonale utvikling som HES-mirnas, og viste at noen ikke-konservert eller primat-spesifikk HES-mirnas er involvert i tumorgenese, dermed støtter hypotesen at tidlig embryoutvikling har mange likheter med kreftutvikling i biologisk atferd samt molekylært [22]. Men funksjonene i ikke-konservert eller primat-spesifikke HMS-mirnas gjenstår å bli eksperimentelt etablert, noe som vil hjelpe oss videre forstå kompliserte molekylære module nettverk som oppstår under humane embryonale utvikling.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
hierarkisk clustering analyser av uttrykket av 169 mirnas stille signalstyrker større enn 32 mirnas (n = 169) ble delt inn i 4 grupper: klynger 1, 2, 3, og 4. Pilen viser mirnas som ble valgt valideres av mikroRNA QRT-PCR (figur 3). Stjernen viser ikke-konservert eller primat-spesifikke HMS-mirnas (figur S4)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Clustering analyser av miRNA uttrykket (
p
0,10) under humane embryonale utvikling Rød og grønn indikerer høye og lave nivåer, henholdsvis
doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s002 product: (TIF)
Figur S3.
konserverte miRNA uttrykk mønstre og biologiske egenskaper menneske-mus homologer under embryonal utvikling. Unsupervised hierarkisk clustering analyser av miRNA uttrykket pro fi ler hos mennesker (uke 4, 5 og 6, figur S3A) og mus embryo prøver (E9.5, E10.5 og E11.5, figur S3b). Museembryo microarray data ble publisert i 2006 av Mineno og kolleger. Fargen i hvert gitter gjenspeiler uttrykket nivået av miRNA i tilsvarende prøven. Den økende intensitet av rødt indikerer at en spesi fi kk miRNA har høyere uttrykk i den gitte prøven. Den økende intensitet av grønt indikerer at dette miRNA har lavere uttrykk. Venn-diagrammer viser skjærings mirnas mellom mennesker (uke 4, 5 og 6) og mus embryo prøver (E9.5, E10.5 og E11.5) og viser at 38 og 32 menneske-mus homologienheter mirnas ble oppregulert (C .) og nedregulert (D), henholdsvis i løpet av mennesker og mus embryonale utvikling
doi: 10,1371 /journal.pone.0069230.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Conservation analyser av HMS-miRNAs. Den miRviewer viser bevaring av HMS-miRNA gener, gruppert etter navn. De mirnas som bare kan oppdages i menneskelige eller andre primater, deriblant MIR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, og -1280, ble skilt under. Den økende intensitet av grønt indikerer at en spesi fi kk miRNA (eller miRNA familie) har høyere bevaring i de gitte arter. Tall i parentes angir tallene på mirnas i en gitt miRNA familie. Mest dele lignende bevarings resultater
doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
HSA-Mir-638 uttrykk i livmorhals adenokarsinom og tilsvarende normale vev. Paneler en gjennom t viser livmorhals adenokarsinom prøver og paneler u gjennom z viser normale livmorhals vev. Den blå flekker signal indikerer uttrykk for HSA-MIR-638. Den røde flekker viser cellekjernen (skala 200 um som figur S5a)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s005 plakater (TIF)
Figur S6.
HSA-Mir-720 uttrykk i livmorhals adenokarsinom og tilsvarende normale vev.
