Abstract
Bakgrunn
Identifiseringen av en blodbasert diagnostisk markør er et mål i mange områder av medisin, inkludert tidlig diagnostisering av prostatakreft. Vi beskriver bruk av gjennomsnitt differensial skjerm som en effektiv mekanisme for biomarkører i fullblod RNA. Prosessen med gjennomsnitts reduserer problemet med klinisk heterogenitet samtidig minimere prøvehåndtering.
metodikk /hovedfunnene
RNA ble isolert fra blodet av prostatakreftpasienter og friske kontroller. Prøvene ble slått sammen og underkastet det i gjennomsnitt differensialvisningsprosessen. Transkripter til stede ved forskjellige nivåer mellom pasienter og kontroller ble renset og sekvensert for identifikasjon. Transkripsjonsnivåer i blodet av prostata kreftpasienter og kontroller ble bekreftet ved kvantitativ RT-PCR. Middel ble sammenlignet ved anvendelse av en t-test og en mottaker-driftskurve ble generert. The Ring finger protein 19A (RNF19A) avskrift ble identifisert til å ha høyere nivåer i prostatakreftpasienter sammenlignet med friske menn gjennom gjennomsnitt differensial skjermen prosessen. Kvantitativ RT-PCR-analyse bekreftet et mer enn 2 ganger høyere nivå av RNF19A mRNA-nivåer i blodet hos pasienter med prostatakreft enn i friske kontroller (p = 0,0066). Nøyaktigheten til å skille kreftpasienter fra friske menn bruker RNF19A mRNA nivåer i blodet som bestemmes av arealet under mottaksoperatør kurven var 0,727.
Konklusjon /Betydning
Gjennomsnittet differensial skjermen gir en forenklet tilnærming for omfattende screening av kroppsvæsker, for eksempel blod, for å identifisere biomarkører i pasienter med prostatakreft. Videre dette proof-of-concept studie garanterer videre analyse av RNF19A som en klinisk relevant biomarkør for å oppdage prostatakreft
Citation. Bai VU, Hwang O, Divine GW, Barrack ER, Menon M, Reddy GP- V, et al. (2012) fordelt Differential Uttrykk for oppdagelsen av Biomarkører i blodet hos pasienter med prostatakreft. PLoS ONE 7 (4): e34875. doi: 10,1371 /journal.pone.0034875
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 12 oktober 2011; Godkjent: 10 mars 2012; Publisert: 06.04.2012
Copyright: © 2012 Bai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Vattikuti Urology Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mens metastatisk prostatakreft er fortsatt en uhelbredelig sykdom [1], intervensjon når sykdommen er fortsatt lokalisert, og vanligvis asymptomatisk, er ofte kurativ [2], [3], [4]. Siden tidlig intervensjon er kjent for å redusere dødeligheten hos menn med prostatakreft [5], har tidlig deteksjon løftet om å redusere prostatakreft spesifikk dødelighet, men dens effektivitet har ennå ikke etablert. Prostataspesifikt antigen (PSA) er den eneste biomarkør ofte i bruk til dette formålet, men har begrensninger med ufullkommen spesifisitet og sensitivitet. En vanlig PSA utelukker ikke nærværet av potensielt dødelig prostatakreft [6], mens benign prostatasykdom kan føre til økninger i PSA som kan kreve prostatabiopsi for diagnose. Begrensningene av PSA screening i å redusere prostata-kreft dødelighet ble sett tydelig når to store randomiserte kontrollerte studier publisert motstridende resultater [7], [8]. Selv om tolket i et gunstig lys, resultatene antydet at overlevelsesgevinst fra PSA screening var liten, med 50 menn som ønsker å gjennomgå prostatektomi å redde ett liv [7]. Dette resultatet understreker også problemet med prostatakreft diagnostikk, da mange menn er diagnostisert med en lat prostatakreft som ikke vil påvirke deres dødelighet selv hvis venstre ubehandlet. Men det faktum at prostatakreft er fortsatt den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn [9] er en påminnelse om hvor viktig det er å oppdage potensielt dødelig prostatakreft når det er fortsatt kureres. Dermed identifisering av flere biomarkører for å bedre på resultatene av PSA forblir et viktig mål i prostatakreft tidlig oppdagelse, særlig i deteksjon av aggressiv sykdom.
Vi beskriver her nytten av en gjennomsnittlig differensial uttrykk (ADE ) tilnærming for å identifisere biomarkører i blodprøver av menn med prostatakreft. Differensial skjerm metodikk krever ikke forkunnskaper i RNA transkripsjoner. Differensial skjermen gir dermed et «åpent» system der både kjente og ukjente RNA transkripsjoner forbundet med en sykdomstilstand kan identifiseres, noe som skiller den fra mikromatriseteknologi [10], [11]. Differensial skjerm krever små mengder av utgangs-RNA (så lite som 20 ng total RNA), og gir en enestående muligheter for rask identifisering av RNA-transkripter til stede ved forskjellige nivåer i test versus referanseprøver; det er spesielt effektiv på å identifisere lav overflod transkripsjoner [11] som ikke kan oppdages ved hybridisering-baserte mikromatrise screening teknologier. Differensial skjermen gir også en utmerket anledning til å avhøre hele transkriptom. På grunnlag av teoretiske beregninger, er 240 par av vilkårlige og ankerprimere forventes å forsterke ~96% av uttrykte RNA-transkripter [12]. Neste generasjons transkriptomet sekvensering (f.eks RNA-seq) deler noen av disse styrkene (hele transkriptom analyse, forkunnskaper i transkripsjon sekvensen ikke nødvendig, små mengder starter RNA nødvendig), samtidig som den gir evnen til å skille allele og spleisevarianter som er ikke lett evalueres med differensial skjerm [13]. Imidlertid vil RNA-sekvenseringsdata seq forskyve seg mot høye overflod transkripter og den teknologi forblir opp til 100 ganger mer kostbart enn differensial skjerm [13].
ADE beholder fordelene ved den differensial skjermen teknikk mens lette analysen av heterogene prøver. Kontinuitetsheterogene prøver identifiserer effektivt transkripter som er differensielt uttrykt i en høy andel av prøvene som utgjør to grupper [10]. Vi ønsket å ytterligere forbedre ADE metodikk ved å akselerere prostatakreft biomarkører i klinisk relevante prøver. Selv om gullstandarden for prostata kreftdiagnose er en prostata biopsi, er denne prosedyren smertefull, krenkende og under mulige komplikasjoner av blødning og infeksjon. Derfor biomarkører som kan bli identifisert i prøver slik som blod, er ønskelig. Siden ikke alle tumorassosierte biomarkører vil være synlig i blodet, begynner oppdagelsesprosessen i svulstvev vil senere kreve ytterligere forbruk av tid og ressurser til validering i blodprøver. I tillegg vil blodbaserte biomarkører som representerer en rekke svar på svulsten ikke bli identifisert hvis biomarkører startes i tumorprøver. Spesielle blodprøvetaking media tillater effektiv gjenvinning av ikke nedbrutt RNA fra helt blod, selv etter forlenget inkubering ved romtemperatur, noe som gjør dette til et praktisk valg for klinisk anvendelse. Vi besluttet derfor å starte biomarkører prosessen ved hjelp av fullblodprøver.
Selv om ADE har vanligvis blitt brukt til å evaluere transkripsjoner som er forskjellig uttrykt i vev (derav terminologien «gjennomsnitt differensial uttrykk»), vi tilpasset denne teknikk for å identifisere RNA-transkripter som er til stede ved forskjellige nivåer i helblod RNA fra to grupper av pasienter. Disse transkriptene er ikke nødvendigvis er differensielt uttrykt i celler som er tilstede i blodet, eller i tumor sammenlignet med normalt vev, men deres tilstedeværelse i blodet, kan anvendes for å skille mellom disse to gruppene. I denne studien beskriver vi bruk av ADE å identifisere et RNA transkript, RNF19A (Gene ID: 25897), som er til stede på høyere nivåer i blodet av prostatakreftpasienter enn hos friske kontroller. Disse resultatene etablere proof-of-prinsippet som i gjennomsnitt differensial uttrykk (ADE) metodikk kan brukes til oppdagelsen av RNA markører i kroppsvæsker av menn med prostatakreft og støtte studiet av RNF19A som en potensiell prostatakreft biomarkør.
Metoder
Etikk erklæringen
All forskning som omfatter mennesker deltakere ble godkjent av Henry Ford Health System (HFHS) Institutional Review Board. Skriftlig informert samtykke ble innhentet for alle deltakerne og alle klinisk undersøkelse ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Pasienter og Blodprøvetaking
prostatakreftpasienter ble identifisert ved Institutt for Urologi ved Henry Ford Health System (HFHS). Friske kontroller ble rekruttert fra den generelle befolkningen og HFHS Indremedisin klinikker. Helt blod (2,5 ml) ble oppsamlet i PAXgene Blood RNA rør (Qiagen, Valencia, CA), slik at for transport ved romtemperatur uten RNA-degradering. Prøvene ble frosset ved -80 ° C inntil ekstraksjon av RNA ble utført.
RNA Isolation
Blod i PAXgene Blood RNA rørene ble sentrifugert. Pelleten ble vasket med RNase-fritt vann og resuspendert i Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA ble ekstrahert i henhold til produsentens protokoller. Det isolerte RNA ble behandlet med RNase-fri DNase (Invitrogen, Carlsbad, CA), og konsentrasjonen av total-RNA ble bestemt ved anvendelse av en qubit fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Gjennomsnittet av differensial Expression (ADE)
Total RNA fra blod av 10 pasienter og 10 friske menn ble slått sammen hver for seg, revers transkribert, og underkastet ADE som beskrevet av Bai et al [10]. Anker og vilkårlige primere som brukes for PCR var H-T11A og H-AP17 (GenHunter Corporation, Nashville, Tennessee). PCR-reaksjonene ble utført i duplikat. PCR-produktene ble elektroforesebehandlet og bånd detektert ved autoradiografi. Band som avvek i intensitet mellom prostata kreftpasienter og friske menn ble kuttet fra gelen, på nytt amplifisert ved å bruke det samme anker og vilkårlige primere H-T11A og H-AP17, og direkte sekvensert.
QRT-PCR
RNA ble revers transkribert ved hjelp av tilfeldige heksamerprimere og Transcriptor revers transkriptase (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens protokoll. Etter revers transkripsjon ble RNA utsatt for qPCR på et Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjelp av sekvensspesifikke primere for RNF19A (analyse Id: Hs00968447_m1) og 18S RNA (analysen Id: Hs03928985_g1 ). Syklusen nummer ved hvilken reaksjonen krysset en terskel fluorescens (C
T) ble bestemt for hver enkelt transkript, og nivået av hver test gen i forhold til 18S RNA (transkript referanse) ble bestemt ved å bruke ligning 2
-ΔC
T hvor A C
T = C
T, test – C
T, ref [14]
statistiske metoder
Midler ble sammenliknet med en t. -test. Likestilling av gruppeforskjeller ble testet, og Satterthwaite p-verdien ble rapportert for distribusjoner med ulike variasjoner. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble brukt til å evaluere lineær korrelasjon. En mottageroperatøren kurve (ROC) ble generert ved å plotte følsomhet mot falske positive (1 – spesifisitet) som diskriminering av testen ble variert. Arealet under kurven (AUC) ble beregnet. Alle statistiske beregninger ble gjort i SAS.
Diskusjon
Blodprøver
Resultater og ble hentet fra friske mannlige kontroller og menn med prostatakreft før endelig behandling. Etter RNA-ekstraksjon, 20 ng total-RNA fra hvert av de 10 prostata kreftpasienter, eller fra hver av de 10 friske menn ble kombinert for å danne to separate bassenger av RNA (prostatakreft vs. sunn) som ble deretter analysert ved hjelp av ADE som beskrevet av Bai et al [10]. PCR-amplifikasjon ved bruk av et anker og vilkårlig primersett ble utført i duplikat, og reaksjonsproduktene ble underkastet gel-elektroforese (fig. 1).
Som vist i fig. 1, ADE analyse identifiserte to RNA transkripsjoner forsterket ved betydelig høyere nivåer i blodprøver fra pasienter med prostatakreft (CA) enn i de fra friske menn (H). Nukleotidsekvensanalyse (fig. S1, supplerende data) viste at disse to transkripter delte en felles sekvens, og at denne sekvensen hadde 100% homologi til nukleotidsekvensen i ringfingeren proteinet 19A (RNF19A) mRNA-transkript. RNF19A, også kalt Dorfin, er en E3 ubiquitin ligase kjent for å bli uttrykt i de patologiske inneslutninger som finnes i Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og Lewy-legeme demens [15]. RNF19A ubiquitinates synphilin-1 og muterte superoksiddismutase 1 (SOD1), som er implisert i patogenesen av disse neurodegenerative forstyrrelser [16], [17]. RNF19A har ikke tidligere vært forbundet med kreft, som understreker nytten av differensial skjermen for å identifisere nye foreninger. Men både RNF19A og dets mål (SOD1 og synphilin-1) har vært implisert i celleoverlevelse og celledød trasé [18], [19], [20]. SOD1 er spesielt forbundet med prostatakreft [21], [22], og kan være involvert i den cellulære respons på DNA-skade gjennom sin rolle i oksidativt stress pathway. Andre E3-ubiquitin ligaser, som RNF6, rapporteres å regulere androgen reseptor aktivitet i prostatakreftceller [23].
ADE analyse identifisert to RNA-transkripter med nivåer betydelig høyere i fullblod RNA fra prostatakreftpasienter ( Ca) enn hos friske menn (H). Nukleotidsekvens-analyse viste at disse to transkripter delte en felles sekvens. Denne sekvensen hadde 100% homologi til nukleotidsekvensen i den E3-ubiquitin-ligase Ring Finger Protein 19a (RNF19A) transkripsjon og er plassert i den 3 «ikke-translatert region (UTR).
Etter identifisering av den RNF19A transkripsjon som en potensiell biomarkør skille blod av prostatakreftpasienter fra blodet av friske kontroller ble QRT-PCR benyttes for å måle nivået av dette avskrift, i forhold til at av 18S RNA, i fullblod RNA prøver fra den enkelte pasient. Relative RNF19A nivåene ble målt i 33 prostata kreftpasienter og 19 friske mannlige kontroller. Disse kohorter var uavhengig av de pasientgruppene som brukes til ADE oppdagelsesprosessen. De kontrollprøver (median alder 40 år, range 31-50 år) ble tatt fra den generelle befolkningen, og som sådan, ble ikke alder-matchet til prostatakrefttilfeller. Baseline kliniske data for prostatakreft kohorten er vist i tabell 1. Alle prostata kreft tilfeller hadde konvensjonell adenokarsinom på patologisk gjennomgang og ingen ble dokumentert å ha nodal eller fjernt metastatisk sykdom. Relative RNF19A nivåer målt ved QRT-PCR er vist i fig. 2 (for sammenligning av rå C
T data, se utfyllende data, Tabell S1). Det gjennomsnittlige relative nivået på RNF19A var 4,79 ± 0,91 (SE) i prostatakreftpasienter sammenlignet med 1,96 ± 0,39 (SE) hos friske kontroller. Denne forskjell mellom de to gruppene var statistisk signifikant (p = 0,0066). Det ble oppnådd en tilsvarende statistisk signifikant forskjell i RNF19A nivåer mellom prostata kreftpasienter og friske kontroller når nivåer ble vurdert ved hjelp av semi-kvantitativ RT-PCR (fig. S2, tilleggsdata).
Kvantitativ RT-PCR ble utført på fullblod RNA prøver fra pasienter med lokalisert prostatakreft (n = 33), så vel som friske mannlige kontroller (n = 19). Nivåer av RNF19A avskrift ble normalisert til 18S RNA (referanse genet). Normaliserte resultater presenteres i boksplott-format, med bokser som representerer
th 25, 50
th og 75
th persentiler og værhår som representerer 10
th og 90
th persentiler av data. Uteliggere vises også. Forskjellen mellom de midler var statistisk signifikant (p = 0,0066).
En mottaker-driftskurve for RNF19A ble generert som et samlet anslag på sensitivitet og spesifisitet av dette blod biomarkør for å skille prostata krefttilfeller fra kontrollene (fig. 3). AUC for modellen var 0,7273, hvor en AUC på 1 tilsvarer en diagnostisk test med perfekt (100%) spesifisitet og sensitivitet. Som et referansepunkt, har AUC for PSA er anslått til 0,640 til 0,678, mens AUC for en populær nomogram som tar hensyn til andre prostatakreft risikofaktorer i tillegg til PSA-nivå er beregnet til 0,691 [24], [ ,,,0],25], [26].
en mottaker ende kurve (ROC) ble generert som et foreløpig estimat av nøyaktigheten av relative nivåer av RNF19A i å klassifisere pasienter med kreft eller friske kontroller i vår kohort av pasienter. Den sanne positive rate (følsomhet) ble plottet mot falsk positiv rate (1-spesifisitet). Arealet under kurven ble beregnet som 0,7273.
Selv om dette funnet er oppmuntrende, bør det bemerkes at bruk av PSA til å skille pasienter med prostatakreft fra kontrollene i våre kohorter kan også ha ført til en forbedret AUC gitt den relativt yngre alder av vår sunne kohort. Med en median alder av 40, vil den forventede Ptil i vår sunne kohort være mindre enn 1,0 ng /ml, vesentlig lavere enn medianen PSA-verdi på 6,4 ng /ml sett i vår prostatakreft kohort. Imidlertid gjorde RNF19A nivåene ikke korrelerer med alder (Pearson koeffisient på 0,09), noe som gjør det lite sannsynlig at våre funn er rett og slett på grunn av en aldersrelatert effekt. Åpenbart trenger ytterligere validering skal utføres i populasjoner som ligne den virkelige verden innstilling av pasienter som blir henvist for prostata biopsi. I tillegg er det fortsatt ikke bestemt om RNF19A eller andre slike biomarkører vil legge til ekstra verdi til klinisk etablerte metoder for å etablere prostatakreft risiko som PSA, alder, rase og slektshistorie. Denne studien ble ikke laget for å ta opp kritiske spørsmål om økt gjenkjenning av potensielt dødelig kreft samtidig unngå overdiagnostikk av lat kreft. Videre satsing på biomarkører for å identifisere disse dødelige subtypene er en viktig mål for fremtiden.
I konklusjonen, beskriver vi her bruken av gjennomsnitt differensial uttrykk for å identifisere RNF19A som et RNA-transkripsjon som er tilstede på betydelig høyere nivåer i blodet av prostata kreftpasienter sammenlignet med friske kontroller. I vår prøve av pasienter, dette transkriptet var i stand til å skille prostata kreftpasienter fra kontrollene med en AUC av mottageren i drift kurve av 0,7273. Resultatene diskuteres her etablere proof-of-prinsippet om at ADE metodikken kan brukes til oppdagelsen av RNA markører i blodet av menn med prostatakreft og garanterer videre analyse av RNF19A som en klinisk relevant biomarkør for prostatakreft tidlig deteksjon.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
kromatogrammer av ADE-identifisert transkripsjoner. Prøver fra friske kontrollpersoner og pasienter med prostatakreft ble utsatt for i gjennomsnitt differensial uttrykk analyse. Transkripsjoner (A og B), til stede på ulike nivåer i friske kontroller i forhold til pasienter med prostatakreft, ble sendt for sekvensering. Kromatogrammene fra sekvenseringsreaksjoner for både transkripsjon A og B er vist, noe som indikerer en identisk felles sekvens. Gitt oppløsning av differensial displayet gel, er forskjellen i lengde mellom de to bånd (A og B) er ikke mer enn noen nukleotider. En annen annealing stedet for enten tilfeldig primer eller polyA primer kan forklare dette resultatet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034875.s001 plakater (PPT)
Figur S2.
RT-PCR analyse av RNF19A i blod fra pasienter med prostatakreft og friske menn. Nivåer av RNF19 ble evaluert ved anvendelse av semi-kvantitativ RT-PCR. RNA ble revers transkribert ved hjelp av tilfeldige heksamer eller oligo (dT) primer og Transcriptor revers transkriptase (Roche Applied Science) i henhold til produsentens protokoll. Amplifisering av cDNA ble utført ved bruk av sekvens-spesifikke primere ifølge RNF19A og GAPDH genene. PCR-produktene ble kjørt på en 2% agarosegel. Kvantifisering av cDNA bånd på gelen ble utført av digital analyse av bandet intensiteten ved hjelp av en Eagle Eye II fortsatt video system med programvaren som leveres av Stratagene (La Jolla, California). RNF19A transkripsjonsnivåer var signifikant høyere hos prostatakreftpasienter sammenlignet med kontroller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034875.s002 plakater (PPT)
Tabell S1.
Raw C
T data presenteres for validerings kohorter av prostatakreftpasienter (PRCA PTS) og friske kontroller. Gjennomsnittlig C
T-verdier var lavere i PRCA pts sammenlignet med kontroller (28.25 vs. 29,50, p = 0,02). Gjennomsnittlig C
T-verdier for 18S referanse genet var ikke signifikant forskjellig mellom pasienter og kontroller (16.62 vs 16,67, p = 0,89). Midler ble sammenliknet med en t-test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034875.s003 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne ønsker å takke pasientene og deres familier som har gjort mulig dette arbeidet.
