Abstract
Chemoresistance i kreftbehandling er et ugunstig prognostisk faktor i ikke-liten celle lungekreft (NSCLC). Heving av intracellulær kalsiumnivå i multiresistens (MDR) underlinjer fører til sensibilisering av MDR underlinjer til celledød. Vi har vist at et sopp protein fra
Ganoderma Microsporum
, GMI, løfter den intracellulære kalsiumnivå og reduserer veksten av MDR sublinje via autophagy og apoptose, uavhengig av P-glykoprotein (P-gp) overekspresjon, i mus xenograft svulster. I tillegg undersøkte vi rollene til autofagi i døden av MDR A549 lungekreft underlinjer av GMI, thapsigargin (TG) og tunicamycin (TM)
in vitro
. Cytotoksisitet av TG ble inhibert med overuttrykt P-gp. Imidlertid TM-indusert død av MDR underlinjer var uavhengig av P-gp-nivå. Kombinasjoner av TG og TM med enten docetaxel eller vinkristin viste ingen ytterligere cytotoksiske effekter på MDR underlinjer. TG- og TM-mediert apoptose av MDR underlinjer ble demonstrert på Annexin-V-analysen og Western blot og undertrykt av pan-caspase inhibitor (Z-VAD-FMK). Behandling av MDR underlinjer med TG og TM også utvidet autofagi med opphopning av LC3-II proteiner, nedbryting av p62 og dannelse av sure vesikulær organeller (AVOS). Hemming av ATG5 av shRNA lyddemping betydelig redusert autofagi og celledød, men ikke apoptose etter TG eller TM behandling. GMI behandling hemmet fosforylering av Akt /S473 og p70S6K /T389. Interessant, fosforylering av ERK var ikke assosiert med GMI-indusert autophagy. Vi konkluderer med at autofagi spiller en pro-død rolle i ervervet MDR og oppregulering av autofagi av GMI via Akt /mTOR-hemming gir en potensiell strategi for å overvinne MDR i behandlingen av lungekrefttilfellene
Citation. Chiu LY, Hu ME, Yang TY, Hsin IL, Ko JL, Tsai KJ, et al. (2015) Immunmoduler Protein fra
Ganoderma Microsporum
induserer Pro-døden Autophagy gjennom Akt-mTOR-p70S6K Pathway Hemming i multilegemiddelresistente lungekreft celler. PLoS ONE 10 (5): e0125774. doi: 10,1371 /journal.pone.0125774
Academic Redaktør: Vladimir Trajkovic, School of Medicine, University of Beograd, Serbia
mottatt: 18 juni 2014; Godkjent: 26 mars 2015; Publisert: 06.05.2015
Copyright: © 2015 Chiu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Council, Taiwan (NSC-100-2320-B-040-005) og departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (MOST-103-2320-B-040-015). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste kreftformen blant menn og kvinner. Selv om kjemoterapi er den anbefalte behandling for avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), de fleste pasienter utvikler kryssresistens til et mangfold av cellegifter (blandings motstand, MDR) [1]. P-glykoprotein (P-gp), produktet av den menneskelige
MDR-1-genet
, er et medlem av den store ATP-bindende kassett familien av membranproteiner [2]. P-gp, hvis overuttrykt i kreftceller, kan pumpe anticancer legemidler ut av cellene. MDR er et kritisk problem i kjemoterapi. Nye medikamenter og strategier for å overvinne MDR å få bedre prognoser. For å forbedre effektiviteten av kjemoterapi, bruk av kinesisk urtemedisin som MDR-reverserende midler [3], MDR modulatorer av ATP-bindende kassett-tilhengere [4] og nanomedical løsninger for å omgå MDR har vært diskutert grundig [5].
Både docetaxel (DOC) [6] og vinkristin (VCR) [7] er tubulin bindemidler (TBA) som er brukt klinisk til ulike kreftkjemoterapiregimer. Men de er i stand til å indusere MDR. Vi brukte DOC og videospiller som utvalgs midler til behandling av A549 NSCLC celler. Under kontinuerlig eksponering, ble flere DOC og videospiller resistente underlinjer oppnås for videre undersøkelser. I en tidligere studie rapporterte vi at når det kombineres med DOC eller videospiller, tre L-type kalsiumkanalblokkere, verapamil (VER), nifedipin og diltiazem, omvendt MDR med ulike efficacies i do- og VCR-resistente underlinjer uavhengig av uttrykket nivåer av efflux transportører [8]. Derfor er det logisk å anta at kalsiumkanalblokker aktivitet er forbundet med reversering av MDR evne. Akkumulerte data har indikert at TBA behandling fører til en forstyrrelse av kalsium homeostase [9]. Således kan lavt nivå intracellulært kalsium basseng tillate MDR-positive celler for å opprettholde fri-radikal-indusert skade i forbindelse med andre uidentifiserte faktorer. Tatt sammen, endring av intracellulær kalsiumnivå ([Ca
2 +]
cyt) i TBA-resistent lungekreft underlinjer kan modulere chemoresistance og ([Ca
2 +]
cyt) medierte trasé er potensielle mål for å overvinne MDR.
endoplasmatiske retikulum (eR) er en intracellulær kalsium lagring partisjon som spiller en rolle i bevaring av mobilnettet kalsiumhomøostase [10]. Forstyrrelser i ER homeostase påvirke proteinfolding for å danne brette protein respons (UPR), også kalt ER stress [11]. ER stress kan sikres ved farmakologiske midler inkludert thapsigargin (TG) [12] og tunicamycin (TM) [13]. Når celler blir behandlet med TG, [Ca
2 +]
cyt økninger [14] for å generere autofagi [15] og apoptose [16]. Behandling med TM fører til induksjon av ER stress med øket [Ca
2 +]
cyt og er også assosiert med apoptose [17] og autofagi [15,16]. Tre ER stressfaktorer, TM, ditiotreitol (DTT) og proteasominhibitor MG132, har blitt testet i mus embryo fibroblaster (MEFs) og funnet å indusere autofagi av negativt regulere Akt /mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway [18]. Imidlertid er klare bevis for en mekanisme som autofagi regulerer celledød i MDR kreft fortsatt mangler.
Programmert celledød er klassifisert som apoptose, nekrose eller autofagi [19,20]. Apoptotiske veier inkluderer de som er extrinsic og de som er iboende. Hver vei konvergerer på aspartat-spesifikk cysteinproteaser er kjent som kaspaser (initierende 8, 9, 10 og skarp 3, 6, 7) [20]. Disse caspases holde seg og aktivere nedstrøms apoptotiske proteiner, og dermed regulerer celledød. Apoptose er en stor effekt av anti-cancer behandling. Autofagi har også blitt grundig studert i kreftbehandling. Autophagy styres av en gruppe av evolusjonsmessig konservert Autophagy gen-relaterte proteiner (ATG-proteiner) i en prosess som omfatter: (i) induksjon eller initiering som korrelerer med dannelsen av phagophore; (Ii) kjernedannelse; (Iii) forlengelse, Atg12-Atg5 og LC3 /Atg8 kontrollert avgjørende skritt i å danne autophagosomes; og (iv) modning og nedbrytning, hvor autophagosomes smelter sammen med endosomer-lysosomer for å danne autolysosomes med nedbrytning av lumenal innholdet [21]. Riktig nivå av autofagi som oppfordrer svulst celle overlevelse har vært diskutert som en del av pro-overlevelse rolle autofagi i etablerte svulster [22,23]. Autophagy har vært foreslått som et mål for induksjon av kreftcelledød [24,25] og inhibering av autophagy har blitt funnet å forbedre resultatene i kreftterapi [26]. Imidlertid kan vedvarende stresset fremme omfattende autofagi, som fører til celledød. Derfor er både autophagic hemming [27] og induksjon er blitt betraktet i terapeutiske strategier [24] og har blitt anvendt for anti-kreft-behandling. Enten autofagi spiller en pro-død eller pro-overlevelse rolle etter kjemoterapi-indusert motstand er fortsatt uklart. Videre undersøkelser er nødvendig for å løse dette problemet, og for å bedre håndtere kjøpt chemoresistance.
Rekombinant soppimmunmodulerende protein, GMI, klonet fra
Ganoderma Microsporum Hotell og renset, har vist seg å utvise en hemmende effekt på EGF-indusert migrering og invasjon [28]. Dette proteinet nedregulerer tumornekrosefaktor alfa-indusert ekspresjon av matriksmetalloproteinase 9 via NF-kappaB veien [29] og induserer autophagy gjennom en kalsium-mediert signalveien i humane lungecancer A549-celler [30]. Oral administrasjon av GMI har vist seg å hemme tumorvekst og indusere autofagi i naken mus med xenopodet svulst i A549 celler [30]. Videre har autophagosome opphopning vist å indusere celledød autophagic via Akt /mTOR banen i en GMI-behandlede lungecancercellemodell [31]. For å teste ytterligere antitumor funksjon av GMI i chemoresistance ble xenopodet dyr svulster i docetaxel-resistente A549 underlinjen behandlet med GMI og analysert. Vi kjennetegnes videre rollene til apoptose og autofagi i MDR ved å sammenligne effekten av to klassiske ER stress induse, TG og TM, med GMI i docetaxel- og vinkristin valgt A549 lungekreftunderlinjer.
I denne studien, vi demonstrert effekten og begrensninger av autofagi på død MDR underlinjer med ER stressfaktorer, TG og TM, samt en roman stressor, GMI, for bedre å forstå rollene til apoptose og autofagi i anti-MDR kreftbehandling. GMI-indusert Akt /mTOR sti hemming i autofagi-assosiert celledød er foreslått som en metode for å omgå MDR.
Materialer og metoder
Narkotika og kjemikalier
DOC ble innhentet fra Aventis Pharmaceuticals Inc. (Bridgewater, NJ). VCR, VER, klorokin og TM ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Z-VAD-FMK ble kjøpt fra Bachem (Torrance, CA). TG ble kjøpt fra Tocris Biovitenskap (Bristol, Storbritannia) og U0126 ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA). GMI, produsert av Mycomagic Bioteknologi Co, Ltd (Taipei, Taiwan), ble generert og bedres fra
Ganoderma Microsporum product: [28].
Flow-3AM analysen
omtrent 2 x 10
4 celler pr brønn ble sådd ut på 24-brønners plater. Etter 24 timers inkubering ble cellene eksponert for VER i friskt medium i 2 timer. Etter dette ble cellene eksponert for DOC, videospiller eller GMI. Ved slutten av eksponeringsperioden, ble cellene trypsinert og inkubert i 30 minutter i Hanks bufret saltløsning (HBSS) med 3 uM Flow-3 AM (Invitrogen). Etter farging ble cellene vasket to ganger med HBSS som er lagt inn i HBSS inneholdende 5% FBS, og analysert ved hjelp av strømningscytometri.
Cellelinjer og cytotoksisitet assay (MTT måle)
Humant adenokarsinomceller A549-celler ble opprettholdes som beskrevet tidligere [8]. DOC og VCR resistente underlinjer ble etablert fra foreldre celler i en trinnvis måte ved eksponering for økende konsentrasjoner av DOC eller videospiller. Kort fortalt, for DOC underlinjen, A549 celler i lav celletetthet ble sådd ut på 10-cm petriskål og behandlet med 0,5 nM DOC til de overlevende cellene vokste til en åpenbar koloni. Den valgte koloni ble amplifisert i nærvær av 0,5 nM DOC inntil konfluens før medikamentdosen ble øket i multipler av to for den neste seleksjonsrunde. DOC motstandsdyktig underlinjen opprettholdes på 16 nM DOC ble betegnet A549 /D16. En tilsvarende betegnelse, A549 /V16, ble gitt til en videospiller stabilt bestandig underlinjen. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av DOC, VCR eller GMI i friskt medium i 48 timer. Narkotika overfølsomhet for DOC, videospiller og GMI ble bestemt på MTT kolo analysen. De detaljerte trinn i MTT-analyse er tidligere blitt beskrevet [8]. Gjennomsnittsverdier ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter.
Western blot analyse
De relevante prosedyrer er beskrevet i en tidligere rapport [8]. Proteiner ble omsatt med en av de følgende: anti-LC3A (# 4599), anti-LC3B (# 3868), anti-PARP (# 5625), anti-GADD153 (# 2895), anti-GRP78 (# 3177), anti -t-Akt (# 9272), anti-p-Akt Ser473 (# 9271), anti-p-ERK (# 4370), anti-p-p70S6K Thr389 (# 9234) kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA), anti-p62 (GTX100685) erholdt fra GeneTex (Irvine, CA), eller monoklonalt anti β-aktin (Sigma, AC-40). Immunhistokjemi (IHC) ble utført med polyklonalt anti P-gp, etterfulgt av anti-geite-IgG (Santa Cruz Biotechnology) konjugert til pepperrot-peroksidase. Hematoxylin ble brukt for kontra.
Annexin V-analyse
Cellene ble trypsinert og inkubert i 30 minutter i bindingsbuffer med propidiumjodid (PI) og Annexin V (FITC Annexin V Apoptose Detection Kit 1, BD Biosciences, San Jose, CA), etterfulgt av analyse med flowcytometri.
Måling av mitokondriemembranen potensial ved JC-1-analysen
Vi brukte JC-1 (5 «, 6,6 «tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid) og en mitokondriemembranpotensialet disrupter, CCCP (karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone), for studiet av mitokondriemembranpotensialet (JC-1; Molecular Probes, Eugene, ELLER). Polarisert mitokondrier vises som røde og depolariserte mitokondrier som grønn. Apoptose ble indikert ved en økning i grønn /rød fluorescens intensitet forhold. For hver prøve ble celler (5 x 10
5-celler /ml) ble suspendert i 1 ml PBS-buffer og JC-1 (sluttkonsentrasjon, 2,5 ug /ml) ble tilsatt til prøven, som ble inkubert i 10 min ved 37 ° C. De fargede celler ble deretter sentrifugert ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur og supernatanten ble fjernet forsiktig. Pelleten ble deretter vasket med 1-2 ml PBS. Cellene ble analysert umiddelbart med strømningscytometer (BD FACSCalibur).
Deteksjon og kvantifisering av sure vesikulær organeller (AVOS)
De detaljerte trinn på AVO-analyse har tidligere blitt beskrevet [30]. I korthet, etter behandling, ble cellene vasket med HBSS to ganger, etterfulgt av farging med 1 g /ml akridinorange (Sigma, A 6014) og fortynning i HBSS inneholdende 5% FBS i 15 minutter. Etter farging ble cellene vasket med HBSS og suspendert i HBSS inneholdende 5% FBS. Cellene ble observert under et rødt filter fluorescens mikroskop. For å kvantifisere AVO formasjon, ble acridinoransje fargede celler høstet og vasket to ganger med HBSS, resuspendert i HBSS som inneholder 5% FBS og analysert med flowcytometri og Cellquest programvare.
ATG5 lyddemping av shRNA uttrykker lentivirus
Lentiviral infeksjon av A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer ble gjennomført til stabilt integrere og uttrykke kort hårnål RNA (shRNA) rettet mot ATG5 mRNA sekvenser. Detaljert fremgangsmåte av lentivirus produksjon har tidligere blitt beskrevet [30].
Animal modell av xenografttumorer
For
in vivo
tumorvekst analysen, 4 uker gammel mannlig immunsvikt mus (NOD.CB17-Prkdcscid /IcrCrlBltw) ble kjøpt fra BioLASCO Taiwan Co., Ltd (Taipei, Taiwan). Eksperimentelle prosedyrer og håndtering ble utført i samsvar med internasjonale retningslinjer for laboratoriedyrestudier. Den aktuelle studien ble godkjent av Chung Shan Medical University Animal Care komité (Permit Number: 1238) og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Å etablere A549 tumorxenotransplantater, ble musene injisert subkutant med 5 x 10
6 A549 /D16 celler (100 mikroliter) pluss 100 ul Matrigel (BD Biosciences, 354234). Seks dyr ble deretter tilfeldig delt inn i to grupper på tre dyr hver. Syv dager etter celle implantering ble musene i PBS gruppen som ble behandlet med 100 ul PBS ved tvangsforing en gang daglig, og tjente som kontroller. Den GMI gruppen ble administrert GMI (160 ug per mus fortynnet i 100 ul PBS) ved gavage en gang daglig. Tumorstørrelsene ble målt etter 3 dager fra den 16. dag etter celleinjeksjon og tumorvolum ble beregnet ved følgende formel: 0,5 x større diameter (mm) x liten diameter
2 (mm). På grunn av tumorstørrelse variabilitet og liten størrelse av grupper, ble en ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test anvendt med p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Etter at dyrene var avlivet, ble tumorvektene målt på mikrovekt og tumorlysatene (10-50 ug) ble analysert ved Western blot ved å bruke Tissue Protein Extraction Buffer (FIVEphoton Biochemicals, San Diego, CA) for proteinpreparat.
Statistisk analyse
Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SD. Data ble sammenlignet mellom grupper ved hjelp av t-test og * p. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Lav intracellulær kalsiumnivå ([Ca
2 +]
cyt) av kjemoresistent A549 celler blir oppregulert ved kombinasjon TBA og verapamil behandling eller GMI
vi har tidligere vist at MDR av A549 /D16 sublinje medieres av ABC-transportører (typisk MDR) og MDR av A549 /V16 sublinje medieres av ikke-ABC transporter-assosiert faktorer (atypisk MDR) [8]. P-gp er oppregulert i A549 /D16 underlinjen og nedregulert i A549 /V16 underlinjen. Begge underlinjer er kryss-resistente mot DOC og videospiller. Vi antok at mekanismen av kalsiumkanalblokkere av L-type i reverserende TBA følsomheten av medikament-resistente celler er assosiert med endring av intracellulært kalsium homeostase. For ytterligere å bestemme intracellulære kalsiumnivå ([Ca
2 +]
cyt) av foreldrenes kreftceller og multiresistente underlinjer, Fluo-3 AM fungert som fluorescerende indikator på intracellulær kalsium på flowcytometri. Videre endring av [Ca
2 +]
cyt følgende kombinert VER og TBA behandling ble bestemt. Resultatene viste at [Ca
2 +]
cyt av multimedikamentresistent, P-gp overekspresjon, A549 /D16 sublinje (Fig 1 A) opprettholdes som vist ved et lavere nivå enn fluorescens paren A549-celler. Interessant, i kjemoresistent og P-gp downregulated A549 /V16 underlinjen lavere [Ca
2 +]
cyt ble også opprettholdt (figur 1B). Dataene viste at [Ca
2 +]
cyt i kjemoresistent underlinjer er lavere enn i foreldre A549 celler. Når A549 /D16 (figur 1C) og A549 /V16 (Fig 1 D) celler ble forbehandlet med VER etterfulgt av TBA, nivået av detekterte fluorescens betydelig økt, noe som tyder på at [Ca
2 +]
cyt av kjemoresistent underlinjer er forhøyet når VER re-sensibiliserende kjemoresistent celler blir utsatt for TBA cytotoksisitet. Oppregulering av [Ca
2 +]
cyt ved kombinerte VER og TBA behandlinger var uavhengig av nivået av P-gp uttrykk. For å teste effekten av GMI på [Ca
2 +]
cyt, begge underlinjer ble behandlet med GMI (1,2 mm) i 24 timer eller 48 timer fulgt av analyse på Fluo-3 AM analysen. Fluorescenssignalet i GMI-behandlede A549 /D16 sublinje øket etter 24 timer (figur 1E) og ytterligere øket etter 48 timer av GMI behandling (Fig 1G) Lignende resultater ble observert i A549 /V16 sublinje behandlet med GMI i 24 timer (fig 1F ) og 48 timer (figur 1 H). Dataene støtter vår hypotese om at forhøyet [Ca
2 +]
cyt spiller en betydelig rolle i kjemoresistent lungekreft celle allergi til døden. Videre er GMI stand til å indusere [Ca
2 +]
cyt heving i MDR underlinjer.
For å undersøke [Ca
2 +]
cyt, den fluorescerende fargestoff Fluo -3AM ble inkubert med (A) foreldre A549 og A549 /D16 celler, (B) foreldre A549 og A549 /V16 celler for 30 min. Tynn linje representerer fluorescens bakgrunnen uten Fluo-3 AM inkubasjon. Tykke linjen representerer fluorescensen målt ved strømningscytometri. For å måle VER modulering av [Ca
2 +]
cyt, (C) A549 /D16 celler og (D) A549 /V16-celler ble forbehandlet med VER (10 uM) i 2 timer fulgt av DOC ( 16 nM) og VHS (16 nM) behandling i 48 timer, henholdsvis. Den [Ca
2 +]
cyt av A549 /D16 celler behandlet med GMI (1,2 pM) i 24 timer (E) eller 48 timer (G) ble oppregulert. Den [Ca
2 +]
cyt av A549 /V16 celler behandlet med GMI (1,2 pM) i 24 timer (F) eller 48 h (H) ble også oppregulert. Etter fluo-3 AM inkubasjon ble cellene visualisert ved hjelp av flow cytometri. Celle nummer count (Count) er angitt med Y-aksen og Fluo-3AM intensitet (FL1-H) er angitt med X-aksen.
GMI hemmer P-gp overekspresjon tumorvekst i mus xenograft modell
Tidligere har det blitt vist at etter forbehandling med kalsium chelator BAPTA-AM, blir GMI-indusert celledød blokkert. Tilsynelatende, induserer GMI lungekreft celledød gjennom en kalsiumavhengig signalveien [30]. Derfor, testet vi følsomheten av kjemoresistent kreftceller til GMI behandling av MTT-analysen (figur 2A). Resultatene viste at både A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer svare på GMI (0,3 til 1,2 mm) på en doseavhengig måte. GMI sensitiviteter av A549, A549 /D16 og A549 /V16 celler med beregnet IC
50 er oppført i tabell 1. Videre ble mus inokulert subkutant med A549 /D16 underlinjen uttrykker høy P-gp. Tumorbelastning i mus behandlet med PBS eller GMI er vist i figur 2B. Når sammenlignet med gruppen av mus administreres PBS, veksten av tumorer i GMI gruppen var signifikant inhibert. Selv om det beregnede tumorvolum var sammenlignbare med P1 og P3, betydelig nekrose av tumoren P2 resulterte i den minste størrelsen av den innhentede P2 tumor. For å sikre spredning av implanterte kreftceller, testet vi GMI effekt når svulstene nådde et volum på 200 mm
3 på den 40. dagen etter implantasjon (Fig 2C). Anti-tumoreffekten til GMI er ikke begrenset i store tumorer.
(A) Analyse av effektene av GMI (0,3, 0,6, 0,9 og 1,2 uM) på cellelevedyktigheten i A549, A549 /D16 og A549 /V16 celler på MTT analyse. (B) Syv dager etter A549 /D16 celle implantasjon ble mus i PBS-gruppen behandlet med PBS eller GMI ved gavage en gang daglig. Tumor størrelser av PBS-gruppen og GMI gruppe ble målt etter at musene ble avlivet på dag 64. (C) Mus ble injisert subkutant til A549 /D16 celle implantasjon. Når tumorvolumet nådde 200 mm
3 på dag 40, mus i PBS-gruppen ble behandlet med PBS eller GMI ved gavage en gang daglig. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD. en ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test ble anvendt med p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. (E) Innholdet av c-PARP, LC3A og LC3B i seks xenograft tumorer ble bestemt ved Western blotting med statistisk analyse av LC3A-II og LC3B-II-uttrykk. (D) Representative farging resultatene av P-gp i lungesvulster av A549, A549 /D16 behandles med PBS (P1) og A549 /D16 behandles med GMI (G1) ble oppnådd ved IHC.
Apoptose-formidlet kløyving av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP-1) ved Capase-3 produsert et 89 kDa C-terminale fragment (c-PARP, inneholdende det katalytiske domenet) som tjente som molekylær markør på immunoblot. Til belysning av ER stress-regulert autophagy ble mikrotubulus-assosiert protein lettkjede (LC3) protein analysert. LC3 har tre isoformer (LC3A, LC3B, og LC3C) [32] hvor LC3A og LC3B ble undersøkt. De GMI-behandlede tumorer uttrykte høye nivåer av c-PARP, LC3A-II og LC3B-II proteiner, noe som indikerer høyere autophagic og apoptotiske aktiviteter enn i PBS-behandlede kontroll tumorer (figur 2D). For å demonstrere høy P-gp-ekspresjon i de xenograft tumorer, ble IHC av P-gp påført de representative tumorer P1, G1 og paren A549-celler (figur 2E). P1 og G1 tumorer viste sterk P-gp uttrykk i motsetning til de svulster i A549-celler. Dataene fra disse musene xenograft tumor eksperimenter vist at GMI hemmer veksten av P-gp overekspresjon kjemoresistent celler og induserer apoptose og autofagi.
apoptose og autofagi er forskjellig forsterket av GMI, TG og TM i MDR lungekreft underlinjer
for å finne ut om effekten av GMI, TG og TM på apoptose og autofagi er doseavhengig, behandlet vi MDR underlinjer med ulike konsentrasjoner av GMI, TG og TM etterfulgt av karakterisering av molekylære markører på immunoblotter. En av komponentene i ER stress-mediert apoptose reaksjonsvei er C /EBP homologe protein (CHOP), også kjent som vekst arrest- og DNA-skade-induserbar gen 153 (GADD153). En annen ER stress mediert protein er GRP78, også kjent som Bip [11]. ER stressrelatert GADD153 og grp78 proteiner ble påvist i A549 /D16 (fig 3A) og A549 /V16 (Fig 3B) underlinjer følgende GMI behandling. Den apoptose-mediert protein c-PARP ble oppregulert etter GMI behandling som var autophagic markører LC3A-II og LC3B-II proteiner.
(A) A549 /D16 celler (2 × 10
5 celler) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GMI i 48 timer. Nivåer av GADD153, GRP78, c-PARP, LC3A-I, LC3B-I, LC3A-II, LC3B-II og p62 ble oppdaget av Western blotting. Lignende betingelser ble anvendt på (B) A549 /V16 celler behandlet med GMI. (C) Western blot-analyse av proteinnivåene i A549 /D16 sublinje og (D) A549 /V16 sublinje indusert av TG. (E) A549 /D16-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TM i 48 timer. Lignende betingelser ble anvendt på (F) A549 /V16-celler. (G og H) Begge underlinjer ble behandlet med angitt GMI konsentrasjon med fraværende eller tilstede for klorokin. Ekspresjonen av β-actin tjente som en kontroll lasting.
GADD153 Proteinet ble ikke påvist i A549 /D16 sublinje (figur 3C), men ble indusert ved TG i A549 /V16 sublinje (figur 3D). Proteinene av GRP78 kan være svakt oppdages med lengre eksponeringstid (figur 3C). De ble funnet i betydelig større mengder i A549 /V16 underlinjen (figur 3D) på immunoblot. Det var en doseavhengig induksjon av GADD153 av TM på A549 /D16 (figur 3E) og A549 /V16 (figur 3F) underlinjer. Nivåene av c-PARP proteiner koordinert godt med GADD153 protein nivåer i begge underlinjer (figur 3D, 3E og 3F). Våre data viser også at LC3A-II uttrykkes i A549 /D16 sublinje og øker etter 200 nM TG behandling, mens nivået av LC3B-II øker ikke selv under høy dose (200 nM) TG behandling (figur 3C) og en lengre eksponeringstid på immunoblot. Interessant under TBA utvalg, både A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer viste lave nivåer av LC3B-II uttrykk (fig 3A, 3C, 3E, 3B, 3D og 3F, 0 nm, henholdsvis). TG og TM forbedret akkumulering av LC3-II-proteiner på en doseavhengig måte i A549 /V16 MDR sublinje, men ikke i A549 /D16 sublinje, som uttrykte høye nivået av P-gp følgende TG behandling (figur 3C). Interessant, da p62, den autophagy flux indikator som er nedbrutt i autolysosomes [33], ble overvåket i MDR underlinjer følgende GMI behandling, dets ekspresjon ble ikke redusert når LC3-II øket (figur 3A og 3B). I motsetning til dette protein nivåer av p62 redusert i TG (figur 3D) og TM-behandlede underlinjer (figur 3E og 3F). Dannelsen av LC3-II og betydelig nedbryting av p62 indikere initiering og fullføring av autophagic fluks følgende TG og TM behandling i MDR underlinjer (figur 3D, 3E og 3F). I vår forrige rapport, viste vi at GMI-indusert autophagosome akkumulering resultater i autophagic død i A549 celler [31]. Dette kan forklare den jevne nivået av p62 i GMI-behandlede underlinjer (figur 3A og 3B). Vi testet videre om GMI-indusert autophagic flux kan observeres med en lysosomal hemmer, klorokin som hemmet den endogene LC3-II omsetning [24]. Sammenlignet med GMI behandling, betydelig opphopning av LC3A-II proteiner i underlinjer som samtidig er behandlet med klorokin ble påvist (Fig 3G og 3H). Disse dataene viste at GMI indusert autophagic flux i MDR kreftceller. Fra disse resultatene, fremmer utvidet ER stress uttrykk for autofagi og apoptose regulert proteiner i MDR underlinjer. Dataene indikerte at graden av apoptose og autofagi er avhengig av GMI, TG og TM konsentrasjoner. GMI induserer ER stress, apoptose og autofagi i MDR underlinjer som ligner på TG og TM aktiviteter, men med forskjellig effekt.
TM og TG indusere død MDR lungekreft underlinjer, men TG effekten er begrenset av P-gp overekspresjon
Vi undersøkes ytterligere regulering av vekst av både MDR underlinjer av TG og TM på MTT analyse. For paren A549-celler, var ca 32% celle overlevelse etter behandling med 200 nM TG. Cytotoksisiteten ble forbedret når A549 cellene ble cotreated med TG og DOC (16 nM), som resulterer i 19% celleoverlevelse ved 200 nM TG. Levedyktighet av A549 /D16 underlinjen ble ikke påvirket av TG eller TG cotreatment med DOC (fig 4A). I motsetning til dette, når A549 /V16-celler ble behandlet med TG (200 nM), 41% av cellene overlevde (figur 4B). Kombinasjonen av videospilleren (16 nM) og TG hadde ingen ytterligere cytotoksisk effekt på A549 /V16 sublinje. Det har blitt rapportert at TG er et substrat for P-gp [29]. Derfor søkte vi P-gp-hemmer, VER, for å avgjøre om cytotoksisitet av TG kan gjenvinnes i A549 /D16 underlinjen. Resultatene viste at når 4 uM VER ble tilsatt, ble levedyktighet av A549 /D16 sublinje redusert til 42% ved 200 nM TG (figur 4E).
(A) foreldre A549 og A549 /D16 celler (2- x 10
4 celler /brønn) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TG med DOC (16 nM) eller uten DOC i 48 timer for medikamentsensitivitet målinger. Lignende forhold ble brukt til (B) A549 og A549 /V16 celler med VCR (16 nM). (C) sperre A549 og A549 /D16-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TM med DOC eller uten DOC i 48 timer for medikamentsensitivitet målinger. Lignende betingelser ble anvendt på (D) A549 og A549 /V16-celler. (E) A549 /D16-celler ble forbehandlet med VER (0, 0,5, 1, 2 og 4 uM) i 2 timer fulgt av forskjellige konsentrasjoner av TG i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble analysert på MTT-analyse.
paren A549-celler ble også følsomme for TM cytotoksisitet i en doseavhengig måte. Når A549-celler ble behandlet med TM (2,5 uM), ca 33% overlevde. Når DOC ble kombinert med TM, forble 18% av de paren A549 celler. Den A549 /D16 underlinjen også reagert på TM cytotoksisitet, men med lavere følsomhet enn foreldre celler. DOC cotreatment med TM viste ingen ytterligere cytotoksisitet i A549 /D16 celler (figur 4C). Den A549 /V16 sublinje var mindre følsom for TM enn A549 /D16 sublinje med 70% overlevende celler ved 2,5 uM TM. Cotreatment med VCR hadde ingen stor effekt på levedyktigheten til A549 /V16 celler (figur 4D). Disse dataene viste at foreldre A549 celler blir sensibilisert for TG /TM med ekstra Cytotoksisiteten når DOC eller videospiller er kombinert med TG eller TM. Men A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer er mindre følsomme for TM enn foreldre celler. Stoffet følsomheter for A549, A549 /D16 og A549 /V16 celler til TG og TM med beregnede IC
50 er oppført i tabell 1. Fra analyse av dataene, er det bare A549 /V16-celler var mer følsomme for TG enn foreldre A549 celler (figur 4b). MDR underlinjer var ufølsom for TG (Fig 4A) og mindre følsom for TM sammenlignet med foreldre A549 celler (fig 4C og 4D).
Kvantifisering av TG- og TM-indusert apoptose og autofagi
i tillegg til å undersøke proteinmarkører apoptose, brukte vi JC-1 og Annexin-V-analyse for å kvantifisere apoptose i TG og TM-behandlet underlinjer.
