Abstract
Androgen reseptoren er en primær transkripsjonsfaktor som er involvert i spredning av prostata kreft celler. Dermed hormonbehandling bruker antiandrogener, for eksempel bikalutamid, er en første-linje behandling for sykdommen. Selv om hormonbehandling i utgangspunktet reduserer tumorbyrde, mange pasienter til slutt tilbakefall, utvikle svulster med ervervet endokrine motstand. Klarlegging av de molekylære mekanismene bak endokrine motstand er derfor et grunnleggende problem for forståelse og utvikling av alternative behandlingsformer for avansert prostatakreft. I denne studien, utførte vi kort hårnål RNA (shRNA) -mediert funksjonell screening for å identifisere gener som er involvert i bikalutamid-mediert effekter på LNCaP prostata kreft celler. Blant slike kandidatgener valgt ved screening ved anvendelse vulkan plottet analyse ble ribosomalt protein L31 (RPL31) funnet å være avgjørende for celleproliferasjon og celle-syklusprogresjon i bikalutamid-resistente LnCap (BicR) celler, basert på små interfererende RNA (siRNA) – mediert knockdown eksperimenter. Av notatet,
RPL31
mRNA mer rikelig uttrykt i BicR celler enn i foreldre LNCaP celler, og kliniske data fra ONCOMINE og Kreft Genome Altas viste at RPL31 er overuttrykt i prostata karsinom sammenlignet med benign prostata vev. Forbløffende nok protein nivåer av tumor suppressor p53 og sine mål, p21 og MDM2, ble økt i LNCaP og BicR celler behandlet med
RPL31
siRNA. Vi observerte redusert degradering av p53 protein etter
RPL31
knockdown. Videre undertrykkelse av vekst og cellesyklus på
RPL31
knockdown ble delvis gjenopprettes med
p53
siRNA behandling. Disse resultater antyder at RPL31 er involvert i bikalutamid-resistente vekst av prostata kreftceller. Den shRNA-mediert funksjonell skjermen i denne studien gir ny innsikt i de molekylære mekanismer og terapeutiske mål av avansert prostatakreft
Citation. Maruyama Y, Miyazaki T, Ikeda K, Okumura T, Sato W, Horie-Inoue K, et al. (2014) Kort hårnål RNA Bibliotek-baserte funksjonelle Screening Identifiserte Ribosomalt Protein L31 som modulerer prostatakreft cellevekst via p53 Pathway. PLoS ONE 9 (10): e108743. doi: 10,1371 /journal.pone.0108743
Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan
mottatt: 04.06.2014; Godkjent: 25 august 2014; Publisert: 06.10.2014
Copyright: © 2014 Maruyama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. GEO sjonsnummer for microarray data er GSE60382
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cell Innovation Program, Grants-in-Aid, og støtte prosjektet av Strategic Research Center i private universiteter fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan; med tilskudd fra Japan Society for Promotion of Science, Japan; av Grants-in-Aid fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferdsdirektoratet, Japan; av Advanced Research for Medical Products Mining Program av National Institute of Biomedical Innovation, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostatakreft er den fjerde vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall, og forekomsten av prostatakreft i Japan er økende, med 11.000 dødsfall per år av sykdommen. Mens de fleste tidlig stadium, kan lokalisert sykdom bli vellykket behandlet med strålebehandling og /eller kirurgi, vil så mange som 50% av pasientene som ble behandlet for lokalisert sykdom har lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser [1], [2]. De nåværende første-linje behandling for residiverende eller metastatisk prostatakreft er hormon terapi, inkludert de som er rettet mot androgen reseptor (AR) signalanlegg som bikalutamid og stoffer som gonadotropin-frigjørende hormon agonister som hindrer androgen produksjon i testiklene og binyrene. Selv om hormonterapier innledningsvis å redusere tumorbyrden, mange pasienter blir motstandsdyktige mot disse terapi og utvikle en terminal form av sykdommen, betegnet kastrering resistent prostatakreft (CRPC) [3]. Pasienter med CpRC har en dårlig prognose og står for det meste av dødsfall på grunn av sykdommen.
I CRPC, er reaktivering av AR signaleanerkjent som en grunnleggende hendelse som resulterer i fornyet tumorvekst under forhold med androgen deprivasjon. Nyere studier har avdekket at CRPC er vanligvis forbundet med økt AR signale grunn AR forsterkning, AR mutasjon, transkripsjon kofaktor aktivisering, ligand-uavhengig fosforylering av AR, og andre prosesser [4] -. [7]
Ja , immunhistokjemiske studier viser at overekspresjon av AR-protein er funnet i de fleste tilfeller av CRPC [6] – [8]. Disse funnene tyder på at AR spiller en sentral rolle i utviklingen /vekst av både androgen-avhengige prostatakreft og CRPC [9] – [12]. AR reaktive er klinisk viktig fordi AR seg selv og sin nedstrøms signalveien kan være terapeutiske mål i CRPC. De nøyaktige molekylære mekanismene bak AR reaktive i CRPC, men er uklart, på grunn av samspillet av AR signaltransduksjonsbane med andre signalveier.
I denne studien har vi utført kort hårnål RNA (shRNA) screening å identifisere nye gener moduler responsen på antiandrogen bikalutamid i prostatakreftceller. I en sammenlignende studie av bikalutamid-behandlede og vehikkelbehandlede prostatakreftceller, vulkan plottet analyse [13], [14] ble brukt til å screene gener som er involvert i den bikalutamid respons. En celle levedyktighet analyse ved hjelp av små interfererende RNA (siRNAs) som er spesifikke for de shRNA-målretting kandidat gener avslørte at ribosomalt protein L31 (
RPL31
), histon klynge en H2bd (
HIST1H2BD
), og ADAM metallopeptidase med thrombospondin type 1 motiv 1 (
ADAMTS1
) var involvert i spredning av bikalutamid resistent prostata kreft celler. Spesielt RPL31, et protein som er en del av 60S store ribosomale subenhet [15] – [18], ble vist å modulere ekspresjon av tumor suppressor p53 [19] – [21] og cellesyklusregulator p21 [20] . Denne studien avdekker nye veier moduler den bikalutamid respons og terapeutiske mål i prostatakreft.
Materialer og metoder
Cell kultur og antiandrogens
LNCaP, Vcap, og 22Rv-en prostata kreft celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). LNCaP-celler ble dyrket i RPMI supplert med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. VCap og 22Rv-1-celler ble dyrket i DMEM med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Bikalutamid-resistente prostatakreftceller (BicR) er blitt beskrevet tidligere [22] – [24], og disse cellene ble dyrket i RPMI supplert med 1 uM bikalutamid, 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. For stabil transfeksjon ble LNCaP-celler transfektert med C-terminalt Flag-tagged RPL31 plasmid eller tom vektor (pcDNA3; Invitrogen), og som er valgt i kulturmedium inneholdende 0,1 mg /ml G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). De stabile trans av LNCaP celler uttrykker RPL31-Flag (LNCaP-RPL31 # 39 og # 63) og tom vektor (LNCaP-vec # 19 og # 22) ble klonet. Bicalutamide og docetaxel ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Japan (Tokyo, Japan).
Screening av bikalutamid-respons-relaterte gener ved hjelp av en lentiviral shRNA bibliotek
Thermo Scientific Åpne Biosystems Decode RNAi Viral Screening bibliotek (RHS5339) ble kjøpt fra Thermo Scientific (Huntsville, AL, USA). Den shRNA-skjermen ble utført som beskrevet andre steder [1], [13], [14], [25]. I korthet transductions ble utført i 100 mm plater, slik at hver shRNA var representert med et gjennomsnitt på 100 eksemplarer, slik at multiplisiteten av infeksjon (m.o.i.) er lik 0.3 for median enkeltkopi integrering av hver shRNA. Infeksjon av målceller ved m.o.i. ≤0.3 ble bekreftet ved fluorescens mikroskopi og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 48 timer etter infeksjon. LNCaP-celler ble dyrket i vekstmedium inneholdende 1 pM bicalutamid eller bærer (0,1% etanol) for en måned
Mikromatriser
Genomisk DNA ble isolert fra transduserte celler ved hjelp av DNeasy Purification Kit (QIAGEN.; Tokyo, Japan) ifølge produsentens protokoll. De integrerte shRNAs fremstilt fra LNCaP genomisk DNA ble forsterket ved hjelp av primere (Decode RNAi-GIPZ, kommenterte gener screening bibliotek-negativ seleksjon kit fra Thermo Scientific) spesifikk for strekkoder for biblioteket plasmid DNA [13], [14], [25] . PCR-produktene ble gel-renset ved anvendelse av QIAquick PCR-rensesett (QIAGEN). Renset DNA-fragmenter (1,5 ug) fra LNCaP-celler ble behandlet med bærer eller bikalutamid ble merket med cyanin-3 (Cy3) eller cyanin-5 (Cy5) farvestoff, henholdsvis, ved hjelp av genome DNA Enzymatisk Labeling Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) og renset ved fjerning av ubundne cyaninfargestoffer med en Ultracell YM-30 Microcon sentrifugale filteranordning (Millipore Japan, Tokyo, Japan). Microarray hybridisering ble utført ved hjelp av Oligo cDGH /chip on-chip Hybridisering Kit (Agilent). Agilent Feature Extractor programmet ble brukt til å skanne microarray bilder. GEO sjonsnummer for microarray data er GSE60382. En vulkan tomten ble generert av gruppering basert på sonder. Utarmet (endring 0,5;
P
0,01) signaler i bikalutamid behandlet LNCaP celler sammenlignet med kjøretøy-behandlede celler ble valgt som bikalutamid responsrelaterte gener [23], [25], [26].
siRNA transfeksjon og western blot analyse
Silencer velge pre-designet sirnas rettet mot kandidatgener ble hentet fra Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) (tabell 1). siRNA rettet mot p53 (sip53: sc-29435) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). En styre siRNA målretting luciferasegenet (siLuc) og en ikke-målsøkende kontroll siRNA (siControl) med ingen homologi med de kjente genet målene i pattedyrceller ble oppnådd fra RNAi (Tokyo, Japan). LnCap og BicR celler ble sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 100.000 celler per brønn og dyrket over natten. -Celler ble transfektert med siRNA ved en sluttkonsentrasjon på 10 nM ved bruk av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Knockdown effektivitet av siRNA ble bestemt ved QRT-PCR ved anvendelse av RNA fremstilt fra cellene 48 timer etter transfeksjon og normalisert med den av siControl. For western blot-analyse, ble bikalutamid (1 uM) eller bærer tilsettes til mediet 12 timer etter transfeksjon. Etter 48 timer ble cellene høstet og lysert i en prøvebuffer ved 100 ° C i 15 min for natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Cellelysater ble løst på en 10% eller 15% SDS-PAGE-gel og så overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore Japan). Membraner ble analysert med en av følgende primære antistoffer: anti-RPL31 (Abcam, Tokyo, Japan), anti-p53 (DO-7; LeicaBiosystems, Newcastle, UK), anti-MDM2 (SMP14, Santa Cruz Biotechnology), anti- p21 (C-19, Santa Cruz Biotechnology), og anti-Flag (M2; Sigma-Aldrich). Membranene ble deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) eller anti-mus IgG, og visualisert ved hjelp av forbedret kjemiluminescens (GE Healthcare). Membraner ble strippet og reprobed med en mus anti-β-actin antistoff. (AC-74, Sigma-Aldrich) som en lasting kontroll [27]
Kvantitativ PCR-analyse
LNCaP og BicR-celler ble transfektert med siRNA (10 nM) i 48 timer. Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved hjelp av Isogen reagens (Nippon Gene, Tokyo, Japan). Første-tråd cDNA ble syntetisert fra 2 ug av total-RNA ved hjelp av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen) med oligo (dT) 20 primer. QRT-PCR ble utført på en StepOnePlus instrument (Life Technologies) ved hjelp av FAST SYBR Grønn Master Mix (Life Technologies) og 150 nM av hvert gen-spesifikke forover og bakover primer (tabell S1). Syklusbetingelsene var 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 2 s og ved 60 ° C i 30 sek. De relative forskjellene i PCR-produktmengder ble bestemt ved den komparative syklusen terskelmetoden, ved hjelp av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) som en intern kontroll [27], [28]. Forsøkene ble utført in triplo. Studentenes
t
-test ble brukt for statistisk analyse, og en sannsynlighetsverdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Celleproliferering analysen
Celleproliferasjon ble målt ved anvendelse av en kit inneholdende WST-8 ((2- (2-metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium, mononatrium salt, Nacalai Tesque,. Kyoto, Japan) BicR, LNCaP, VCap og 22Rv-1-celler ble sådd i 96-brønns plater i tettheter på 2000, 4000, 16000, og 4000 celler per brønn, henholdsvis i kulturmedium, og transfektert med siRNA rettet mot enten et kandidat-gen eller luciferase (siLuc) (10 nM hver) under anvendelse av Lipofectamine RNAiMAX på dag 0. etter 12 timer etter transfeksjon, ble cellene overført til dyrkningsmedium inneholdende 1 pM bikalutamid eller kjøretøy. Ved de angitte tidspunkter etter transfeksjon, 10 ul av en reagensløsning inneholdende WST-8 ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. absorbans-verdiene for hver brønn ble målt ved 450 nm på en Multiskan FC ELISA-leser ( Thermo Scientific; Ulm, Tyskland) [23], [28]. Representative resultater fra 3 uavhengige forsøk er vist som gjennomsnitt ± standardavvik av triplicated brønner. Elevens
t
-UNDERSØKELSER ble brukt for statistisk analyse, og
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Cell-syklus analyse
LNCaP og BicR-celler ble transfektert med siRNA (10 nM) i 12 timer. Cellenes mediet ble forandret til medium inneholdende bikalutamid (1 uM) eller bærer, og cellene ble dyrket i ytterligere 36 timer. Cellene ble vasket en gang med PBS og fiksert i 70% etanol. De ble deretter vasket to ganger med PBS og ble behandlet med 0,2 pg /pl RNase A i 30 minutter. Til slutt ble de farget med 5 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich). Prøvene ble kvantifisert ved anvendelse av et FACSCalibur (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA), basert på DNA-innhold, og resultatene ble analysert med Cellquest-programvare (Becton Dickinson) for å bestemme prosentandelen av celler i G0 /G1, S og G2 /M faser [28], [29].
Bioinformatikk
ONCOMINE databasen er en kreft microarray database og online data-mining plattform rettet mot tilrettelegging funn fra genom-wide uttrykk analyser [30]. Den ONCOMINE database (https://www.oncomine.org/resource/login.html) ble søkt etter kandidatgener som er oppregulert i prostatakreft versus normal prostatavevet med minst to ganger (
P
0,5 ganger på en terskel på
P
0,01) sammenlignet med kjøretøy behandling, slik som vist i vulkan plottet analyse (figur 1B og tabell 1). Dette shRNA screening analyse var nyttig å trekke gener som putatively var involvert i bikalutamid motstand.
(A) Skjematisk fremstilling av shRNA screening. LNCaP celler ble infisert med en lentiviral shRNA bibliotek og videre dyrket med eller uten bikalutamid for en måned. Individuelle integrerte shRNA beløp ble kvantifisert ved microarray. (B) Volcano tomt på microarray data, som genereres av gruppering basert på sonder som ble beriket eller utarmet (endring 0,5;
P
0,01) i bikalutamid-behandlede celler i forhold til kjøretøy-behandlede celler .
Validering av kandidatgener
for å evaluere effekten av de enkelte genene valgt av shRNA screening på prostatakreft cellebiologi, knockdown effekt av tilgjengelige siRNAs rettet til 19 av 25 kandidat gener ble undersøkt ved kvantitativ revers transkripsjon (QRT) -PCR. Tretten av de 19 siRNAs redusert ekspresjon av de tilsvarende målgener med 37-94% (Tabell 1). Deretter ble effekten av disse sirnas på celleformering i bikalutamid-resistente LNCaP (BicR) celler bedømt ved bruk av WST-8-celleproliferasjonsanalyse (figur 2). Resultatene indikerte at stanse av
RPL31, HIST1H2BD
, og
ADAMTS1
betydelig undertrykt celleproliferasjon i BicR celler ved . 50% sammenlignet med kontroll siRNA
Vekst hemming av BicR celler ved siRNA målretting
RPL31 plakater (siRPL31),
HIST1H2BD plakater (siHIST1H2BD), og
ADAMTS1 plakater (siADAMTS1) ble vist. -Celler ble transfektert med 10 nM siRNA i kulturmedium. Tolv timer etter transfeksjon, ble cellene deretter ytterligere dyrket i medium inneholdende 1 pM bikalutamid. WST-8 celleproliferasjonsprosesser analysene ble utført ved de angitte tidspunkter etter transfeksjon. Absorbansen av brønnene i platene ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser ved 450 nm. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3; *
P
0,05; **
P
0,01).
oppregulert uttrykk for
RPL31, HIST1H2BD
, og
ADAMTS1
i BicR celler
Neste, vi evaluert uttrykket nivåer av
RPL31, HIST1H2BD
, og
ADAMTS1
mRNA i LNCaP og BicR celler ved QRT-PCR. Disse tre genene ble betydelig overuttrykt i BicR celler sammenlignet med foreldre LNCaP-celler (Figur 3A). For å undersøke om
RPL31, HIST1H2BD
, og
ADAMTS1
uttrykk nivåer ble endret i kliniske prostatakreft prøvene, vurderte vi uttrykket status av disse genene basert på ONCOMINE microarray datasettet [30]. I en sammenligning av prostata carcinoma prøver og normal prostata prøver ved en terskel av minst en to-gangers endring (
P
0,01) (figur 3B),
RPL31
oppregulering ble observert hos studien utført av Tomlins og kolleger [35]. I et RNA-sekvense studie integrert i Kreft Genome Atlas [31], [32],
RPL31
uttrykk ble også forhøyet i prostatakreft sammenlignet med normal prostata vev (Figur 3C). For
HIST1H2BD
, oppregulering ble vist i en datasettet, mens downregulation ble vist i en annen (data ikke vist). I tillegg
ADAMTS1
ekspresjon ble redusert i prostata cancer i enkelte datasett (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at
RPL31
spiller en rolle i prostata kreft progresjon, inkludert bikalutamid motstand. For å undersøke celleveksthemmende virkninger av siRPL31 i forskjellige prostatakreftceller, VCap, 22Rv-1, og LNCaP-celler ble analysert ved hjelp av en WST-8-analyse. siRPL31 trykt spredning av disse cellene (Figur S1).
(A) Expression nivåer av
RPL31
,
HIST1H2BD
, og
ADAMTS1
mRNA evaluert av kvantitativ revers-transkripsjon PCR-analyse (QRT-PCR) med genspesifikke primere. Dataene er normalisert til
GAPDH Hotell og vist som gjennomsnitt ± standardavvik (N = 3; **
P
0,01). (B)
RPL31
mRNA er rikelig uttrykt i kliniske prostata karsinom vev sammenlignet med normal prostata vev (ved 2 ganger)., Som hentes fra datasett av Tomlins
et al
i ONCOMINE database [30]. Normal: normal prostata vev, PCA: prostatakreft, PIN: prostata intraepitelial neoplasi. (C)
RPL31
mRNA uttrykk er forhøyet i kliniske prostatakreft prøvene
versus
normale prøver i en studie av RNA-sekvensering i Kreft Genome analyse [31], [32].
RPL31
regulerer cellesyklusprogresjon
av de sirnas undersøkt, si
RPL31
var den mest effektiv på å undertrykke BicR celleproliferasjon. Derfor har vi undersøkt videre patofysiologisk rolle
RPL31
i prostatakreftceller. Cellesyklus analyse av BicR celler avslørt at
RPL31
knockdown betydelig økt andelen celler i G0 /G1 fase, samtidig redusere andelen i S-fasen, sammenlignet med kontroll siLuc behandling (Figur 4A og 4B).
RPL31
knockdown også indusert lignende cellesyklus profil endringer i LNCaP celler (Figur 4C og 4D). Disse resultatene indikerer at
RPL31
knockdown vesentlig undertrykkes cellecyklusprogresjonen av BicR celler samt LNCaP celler.
(A) knockdown av
RPL31
i BicR celler økte andelen av celler i G0 /G1 og reduserte andelen av de i S-fasen. Celler ble transfektert med siRPL31 eller siLuc i kulturmedium i 48 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS, farget med propidiumjodid, og underkastet FACS-analyse. (B) Prosentandelene av BicR celler i S, ble G0 /G1 og G2 /M-fasen bestemt ved anvendelse av Cellquest-programvare og er vist som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3; *
P
0,05; **
P
0,01). (C) knockdown av
RPL31
redusert spredning av LNCaP celler. Celler ble behandlet på samme måte som beskrevet i (A). (D) Prosentandelene av LNCaP-celler i S, ble G0 /G1 og G2 /M-fasene bestemt ved anvendelse av Cellquest-programvare og er vist som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3; **
P
0,01).
RPL31 modulerer uttrykk av p53 og MDM2 samt p53 protein degradering
For å belyse mekanismene bak rollen RPL31 i celle-syklus progresjon av prostata kreft celler, undersøkte vi effekten av
RPL31
knockdown på uttrykk for celle-syklus regulatorer, inkludert p53, MDM2, og p21. Forbløffende nok protein nivåer av tumor suppressor p53 [19], [29], [36] – [40] og dens nedstrøms cellesyklus negativ regulator p21 [20] ble forsterket av
RPL31
knockdown i BicR celler og LNCaP celler (figur 5A). Uttrykket av MDM2 protein, en kjent E3 ubiquitin ligase rettet mot p53 [21], [36], [37], ble også forbedret på
RPL31
knockdown.
(A) knockdown av RPL31 øker p53, MDM2, og p21 protein uttrykk. LnCap og BicR-celler ble transfektert med siRPL31 eller siLuc i 48 timer. Celleekstrakter ble underkastet SDS-PAGE og Western blot-analyse ved bruk av de angitte antistoffer. (B) RPL31 regulert degradering av p53-protein. BicR-celler ble transfektert med siRPL31 eller siLuc i 60 timer og behandlet med 50 pg /ml cykloheksimid (CHX) i den angitte tid. Celleekstrakter ble analysert ved western blotting. (C) p53-proteinnivåer ble kvantifisert ved densitometri og normalisert til nivåer av det tilsvarende β-aktin-protein og er vist som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3; *
P
0,05).
Vi deretter vurdert om
RPL31
stanse påvirket degradering av p53 i prostatakreftceller. Protein nivåer av p53 ble kvantifisert ved western blot-analyse i BicR celler behandlet med
RPL31
siRNA og sykloheksimid, en inhibitor for proteinsyntese (figur 5B). p53-proteinnivåer ble normalisert til nivåer av det tilsvarende β-aktin, ved hjelp av densitometri (figur 5C). p53 ble stabilisert mer i
RPL31
-silenced BicR celler enn i siLuc-behandlede celler.
p53 delvis medierer de cellulære virkningene av RPL31
Vi neste undersøkte effekten av
RPL31
knockdown på
p53 Hotell og
MDM2
mRNA uttrykk nivåer i BicR og foreldre LNCaP celler.
p53
mRNA nivåer ble ikke økt i BicR og LNCaP celler etter
RPL31
knockdown (Figur 6A, Figur S2). Dette funnet tyder på at
RPL31
stanse oppregulert p53 uttrykk på proteinnivå. I motsetning til dette,
MDM2
og
p21
mRNA-nivåene ble øket ved
RPL31
knockdown i BicR og LNCaP-celler (figur 6A, fig S2), i samsvar med oppregulering av disse proteiner i begge cellelinjer (figur 5A).
(A) knockdown effekter av RPL31 og p53 på MDM2 og p21 mRNA. BicR celler ble transfektert med siRPL31, sip53, siRPL31 pluss sip53, eller siLuc. QRT-PCR for RPL31, p53, MDM2, og p21 mRNAwas utført. Forsøk ble utført in triplo; mRNA-ekspresjon er normalisert til GAPDH og vist som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3; **
P
0,01). (B) sip53 delvis avbestilling undertrykkelsen av cellevekst indusert av siRPL31. BicR celler ble transfektert med 10 nM hver siRPL31, sip53, siRPL31 pluss sip53 eller siLuc, og dyrket med mediet som inneholder en mikrometer bikalutamid. WST-8-celle proliferasjonsanalyse ble utført ved de angitte tidspunkter. Absorbansene av brønnene i platene ble målt ved anvendelse av en mikroplateavleser ved 450 nm. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 4; **
P
0,01).
Vi ytterligere bekreftet hvis p53 bidratt vesentlig til veksthemming mediert av
RPL31
stanse . Det er bemerkelsesverdig at RPL31 knockdown-mediert oppregulering av
MDM2 Hotell og
p21
mRNA i BicR celler var signifikant redusert med p53 knockdown i kombinasjon med RPL31 knockdown (Figur 6A). Effektene av disse sirnas på BicR celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av WST-8-analysen (Figur 6B). Resultatene indikerte at
p53 Hotell og
RPL31
knockdown delvis økt celledeling sammenlignet med
RPL31
knockdown alene i nærvær av bikalutamid. I LNCaP celler, kombinasjon av sip53 og siRPL31 også delvis reversert effekten av siRPL31 på
MDM2 Hotell og
p21
mRNA uttrykk nivåer samt cellevekst (figur S2). Vi undersøkte deretter effekten av kombinatorisk bruk av siRPL31 og sip53 på cellesyklusen profilen til BicR celler (figur S3). Dobbel knockdown av
RPL31 Hotell og
p53
økt andelen av celler i S-fasen sammenlignet med
RPL31
knockdown alene.
Vi ga LNCaP celler som uttrykker eksogent RPL31 med stabil transfeksjon for å undersøke effekten av RPL31 overekspresjon av p53-protein (figur S4A). Det er rapportert at p53-proteinet er stabilisert med en kjemoterapi medikament docetaxel i LNCaP-celler [41]. Vi undersøkte p53 protein nivåer i denne situasjon, og funnet at p53-proteinnivåer ble redusert i RPL31-overekspresjon LNCaP-celler sammenlignet med den av vektor-uttrykkende celler (figur S4B). Disse gain-of-funksjon eksperimenter indikerte også at RPL31 kan negativt regulere protein uttrykk nivåer av p53. I tillegg undersøkte vi om RPL31 uttrykket er regulert av bikalutamid (figur S5). Spesielt, ble det vist at bikalutamid sterkere indusert RPL31 mRNA-ekspresjon i BicR celler enn i LNCaP-celler siden, ved 24 og 48 timer etter bikalutamid behandling, de RPL31 mRNA-nivåene var signifikant høyere i BicR celler enn LNCaP-celler (
P
. 0,01)
Diskusjoner
i denne studien har vi identifisert gener moduler den bikalutamid respons i prostatakreftceller via funksjonell screening ved hjelp av en lentiviral shRNA bibliotek kombinert med siRNA eksperimenter. Ut av ~10,000 shRNAs som ble omformet til LNCaP celler, valgte vi en liten undergruppe av shRNAs med vesentlig redusert uttrykk i celler etter en måned bikalutamid behandling. Fra de 13 genene målrettet av den valgte shRNAs, fant vi at knockdown av
RPL31, ADAMTS1
, og
HIST1H2BD
betydelig hemmet spredning av BicR prostatakreftceller. Vi fokuserte på karakterisering av ribosomalt protein RPL31 i sykdomsutviklingen, som stanse av
RPL31
vesentlig redusert cellesyklusprogresjon BicR celler. Vi har oppdaget at ekspresjonsnivået av
RPL31
mRNA var signifikant forhøyet i BicR celler sammenlignet med LNCaP-celler, og kliniske studier viser at RPL31 ekspresjon i prostata carcinoma er høyere enn det som i godartet prostata vev. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at RPL31 positivt bidrar til utvikling og fenotype av prostatakreft.
Vi har søkt å fastslå den mekanismen som
RPL31
knockdown sterkt vekst arrestert BicR prostata kreft celler. RPL31 er en komponent av den store subenhet av ribosomet i eukaryoter [15], [17], [18], [42]. Fordi bikalutamid behandling i prostatakreftceller svekker ribosomalt RNA-syntese [43],
RPL31
knockdown kan ytterligere forverre feilregulering av ribosomale funksjon i nærvær av bikalutamid. I tillegg
RPL31
knockdown kunne mekle extraribosomal funksjoner og modulere sti av tumor suppressor p53. Extraribosomal funksjoner er cellulære handling annet enn proteinsyntese, inkludert DNA-replikasjon, transkripsjon, reparasjon, RNA-spleising, cellevekst, apoptose, differensiering og cellulær transformasjon [33], [34], [42], [44] – [49] . Spesielt å relevansen av extraribosomal funksjoner cellevekst og celledeling ble bekreftet ved observasjonen at svekkelse av disse prosessene oppregulerer p53 og forårsaker cellesyklus-stans [36], [37]. I denne studien,
RPL31
knockdown vesentlig økt proteinnivå p53, p21, og MDM2. Det er også bemerkelsesverdig at RPL31 knockdown fuktet degradering av p53-protein med cykloheksimid behandling. RPL31 knockdown-mediert oppregulering av
MDM2 Hotell og
p21
mRNA blir hovedsakelig regulert av p53, som det ble betydelig redusert ved p53 siRNA.
