Abstract
syklisk AMP (cAMP) hemmer formeringen av en rekke tumorceller. Vi har tidligere rapportert en antiproliferativ effekt av PKA I-selektive cAMP analoger (8-PIP-cAMP og 8-HA-cAMP) på to menneskelige kreftcellelinjer av ulik opprinnelse. 8-Cl-cAMP, en annen cAMP analog med kjente antiproliferative egenskaper, har blitt undersøkt som en potensiell kreft narkotika. Her, sammenlignet vi antiproliferative effekten av 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP analoger i tre humane kreftcellelinjer (ARO, NPA og WRO). 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP analoger hadde tilsvarende potente antiproliferative effekter på BRAF-positive ARO og NPA celler, men ikke på BRAF-negative WRO celler, der kun 8-Cl-cAMP konsekvent hemmet cellevekst . Mens behandling med PKA I-selektive cAMP analoger ble assosiert med vekst arrest, 8-Cl-cAMP indusert apoptose. For ytterligere å undersøke virkningene av 8-Cl-leiren og PKA I-selektive cAMP analoger, analyserte vi deres effekt på signalveier involvert i celleproliferasjon og apoptose. Interessant, PKA I-selektive cAMP-analoger, men ikke 8-Cl-cAMP, hemmet ERK-fosforylering, mens 8-Cl-cAMP alene induserte en progressiv fosforylering av p38-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), via aktivering av AMPK etter dets metabolitt 8-Cl-adenosin. Viktigere, kan den pro-apoptotiske virkning av 8-Cl-cAMP i stor grad forhindres ved farmakologisk inhibering av p38 MAPK. Til sammen disse data tyder på at 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP analoger, men av tilsvar antiproliferativ potens, handle gjennom ulike mekanismer. PKA I-selektive cAMP analoger indusere vekst arrest i celler som bærer BRAF onkogen, mens 8-Cl-cAMP indusere apoptose, tilsynelatende gjennom aktivering av p38 MAPK veien
Citation. Lucchi S, Calebiro D, de Filippis T, Grassi ES, Borghi MO, persani L (2011) 8-klor-syklisk AMP og protein kinase A I-Selective syklisk AMP analoger hemme kreft cellevekst gjennom ulike mekanismer. PLoS ONE seks (6): e20785. doi: 10,1371 /journal.pone.0020785
Redaktør: Andrew D. Badley, Mayo Clinic, USA
mottatt: 19 januar 2011; Godkjent: 09.05.2011; Publisert: 10 juni 2011
Copyright: © 2011 Lucchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble delvis støttet av forskningsmidler av Istituto Auxologico Italiano. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Syklisk AMP (cAMP) er en gammel og allestedsnærværende kjemisk budbringer, blir funnet både i prokaryoter og eukaryoter. I virveldyr er det en viktig intracellulær formidler av nevrotransmittere og hormoner og regulerer viktige cellefunksjoner, for eksempel sammentrekning, sekresjon og replikasjon. Mens cAMP har en antiproliferativ virkning på de fleste celletyper, gir det en motsatt, dvs. pro-mitotisk, stimulans for nerveceller og flere celler av endokrine opprinnelse [1], [2]. Ikke overraskende da, gener som koder for viktige elementer av cAMP vei fungere som onkogener eller oncosuppressors, mest utsøkt i endokrine celler [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10]. Videre har en oppregulering av type I isoformer av cAMP-avhengig protein kinase A (PKA) blitt dokumentert i flere maligniteter [11].
Siden cAMP har en antiproliferativ effekt på kreftceller, celle-gjennomtrengelig cAMP analoger har vært vurdert for behandlingen av kreft hos mennesker [11]. 8-Cl-cAMP, best studerte av disse forbindelsene, har antiproliferative egenskaper både
in vitro Hotell og
in vivo
og har blitt evaluert i fase I /II kliniske studier [11], [ ,,,0],12], [13]. Likevel, til tross for de godt dokumenterte effekter av 8-Cl-cAMP, er det ingen felles enighet om virkningsmekanismen. I de banebrytende studier av gruppen av Yoon Cho-Chung ble det i virkeligheten vist seg at 8-Cl-cAMP endrer forholdet mellom PKA regulatoriske (R) underenheter (type I sammenlignet med type II) ved å redusere nivåene av typen IR subenheter [11], [14]. Selv om dette fenomenet ble ansett å være ansvarlig for den antiproliferative virkning av 8-Cl-cAMP, resultatene av nyere studier tyder på at effekten av 8-Cl-cAMP er i stedet mediert av dens metabolitt 8-Cl-adenosin og er uavhengige av PKA aktivering og /eller endringer av forholdet mellom type i og type II R subenheter [15], [16], [17], [18].
i en tidligere arbeidet vi fant ut at et par av stedsspesifikk cAMP analoger (8-PIP-cAMP og 8-HA-cAMP), som, når de brukes i kombinasjon, selektivt aktivere PKA jeg hadde en potent antiproliferativ effekt på to BRAF-positive carcinoma cellelinjer (ARO og NPA), men ikke på BRAF-negative WRO celler [19]. I denne studien sammenlignet vi effekten av 8-Cl-cAMP og disse PKA I-selektive cAMP analoger på de samme carcinoma cellelinjer (ARO, NPA og WRO), ved å se på parametere som cellevekst, apoptose og modifikasjoner av nøkkelsignale kaskader som kan være innblandet i sine antiproliferative effekter.
Resultater
effekt av 8-Cl-cAMP eller PKA i-selektive cAMP analoger på celleproliferasjon
Først må vi sammenlignet antiproliferative effekten av 8-Cl-cAMP og PKA i-selektive cAMP analoger. For dette formålet, behandlet vi ARO (tykktarmskreft), NPA (melanom) og WRO (follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma) celler med ulike konsentrasjoner av 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP analoger for ulike tidsperioder (24-96 h) og evaluert celleviabilitet anvendelse av MTT-analysen. Resultatene indikerte at begge behandlingene var tilsvarende potent ved inhibering av veksten av ARO og NPA-celler, mens bare 8-Cl-cAMP hadde en konsistent antiproliferativ effekt på WRO-celler (figur 1). Effekten av begge behandlingene nådde et maksimum etter 72-96 timers inkubering (data ikke vist), og var doseavhengig, med IC50-verdier på 55,3 pM i ARO og 84,8 pM i NPA-celler for de PKA I-selektive cAMP analoger og mellom 2,3 og 13,6 pM for 8-Cl-cAMP i alle tre cellelinjer. I samsvar med den foregående funn at den antiproliferative effekt av 8-Cl-cAMP er PKA-uavhengig og i det minste delvis formidles av dens metabolitt 8-Cl-adenosin [15], [16], [17], [18], effekten av 8-Cl-cAMP ble betydelig inhibert ved behandling med fosfodiesterase inhibitor IBMX, som blokkerer omdannelsen av 8-Cl-cAMP til 8-Cl-adenosin. Tvert imot, har IBMX ikke modifisere den antiproliferative effekten av PKA I-selektive cAMP-analoger (figur S1). Videre gjorde antiproliferative effekten av 8-Cl-cAMP ikke ut til å være mediert av PKC, da behandling med en PKC-hemmer ikke endre responsen på 8-Cl-cAMP (figur S2).
ARO, NPA og WRO celler ble dyrket i 72 timer i nærvær av de angitte konsentrasjoner av en av typene av cAMP analog (er) og cellelevedyktigheten ble bestemt anvendelse av MTT-analysen. PKA jeg, PKA I-selektive analoger brukes ved ekvimolare konsentrasjoner.
Effekt av 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP analoger på cellecyklusprogresjonen og apoptose
Senere , vurderte vi om antiproliferative effekten av 8-Cl-cAMP og pKA i-selektive cAMP analoger ble assosiert med vekst arrest og /eller apoptose. Dette problemet ble løst ved en kombinasjon av tilnærminger.
Først vi analysert effekten av 8-Cl-leiren og PKA I-selektive cAMP analoger på cellesyklus og apoptose ved flowcytometri analyse av kjernefysiske DNA-innhold . For dette formålet ble ARO, NPA og WRO celler behandlet med enten type cAMP analog (er) for ulike tidsperioder og analysert etter DNA-farging med propidiumjodid. 8-Cl-cAMP behandling var forbundet med en reduksjon av celler i G0 /G1 og en akkumulering av celler i S-fasen. I tillegg ble det ledsaget av en betydelig økning i andelen av apoptotiske celler, dvs. de med en sub-G0 /G1 DNA-innhold. I motsetning til dette, fikk eksponering for PKA I-selektive cAMP analoger ikke forårsaker en signifikant økning i apoptose. Den eneste merkbare effekten av PKA I-selektive cAMP-analoger var en svak økning i antallet celler i G0 /G1 (statistisk signifikant i ARO-celler) og en tendens i retning av en reduksjon av cellene i S og G2 /M-fasene, både kompatibelt med akkumulering i G0 /G1 (tabell 1).
Deretter analyserte vi frigjøring av histon-bundet DNA-fragmenter inn i cytosol, som en markør for apoptotisk DNA-fragmentering. ARO, NPA og WRO celler ble utsatt for sub-maksimal konsentrasjon av PKA I-selektive cAMP analoger eller 8-Cl-cAMP, og mengden av nukleosomer i cytoplasma ble evaluert ved en spesifikk ELISA. 8-Cl-cAMP behandling forårsaket en signifikant økning i DNA-fragmenteringen i alle tre cellelinjer som var påvisbart start fra 48 timers inkubering. I motsetning til dette ble ingen induksjon av DNA-fragmenteringen som observeres i celler behandlet med PKA I-selektive cAMP-analoger (Fig 2A og data ikke vist)
A.: Virkning på DNA-fragmentering. Celler ble utsatt for 8-Cl-cAMP (100 pM) eller PKA I-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) i 48 h og frigjøring av histon-bundet DNA-fragmenter inn i cytosol ble evaluert av en spesifikk ELISA. Dataene er hentet fra tre uavhengige forsøk. B: effekt på caspase 3/7. Celler ble utsatt for 8-Cl-cAMP (100 pM) eller PKA I-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) i 72 timer og caspase 3/7 aktivitet ble bestemt med en selvlysende analysen. Dataene er hentet fra tre uavhengige forsøk. * P 0,001 vs. kontrollceller. Alle data er uttrykt som variasjon i forhold til kontrollcellekultur uten medikamenter.
Til slutt, som apoptose er forbundet med caspaseaktivering [20], undersøkte vi effekten av begge behandlinger på aktiviteten av caspase 3 /7, som ble målt ved bruk av en selvlysende assay. En betydelig økning i kaspase 3/7 aktivitet ble påvist i ARO, NPA og WRO celler eksponert til 8-Cl-cAMP som starter fra 24 timer av behandlingen, men ikke i de samme celler som ble behandlet med den PKA I-selektive cAMP-analoger (figur 2B ).
til sammen disse dataene antydet at 8-Cl-leiren, men ikke de PKA i-selektive cAMP analoger indusert apoptose i ARO, NPA og WRO celler.
apoptotiske trasé aktiveres ved 8- Cl-cAMP
for å undersøke veien involvert i apoptose indusert av 8-Cl-cAMP, vurderte vi aktiviteten av caspase 8 (ytre vei) og caspase 9 (indre vei) utnytte spesifikke selvlysende analyser. En tidlig og forbigående (10 min-1 h) aktivering av kaspase 8, men ikke fra kaspase 9, ble observert (figur 3), noe som tyder på at 8-Cl-cAMP kan indusere den ytre vei. Men disse to caspases ikke viser noen aktivering ved senere tidspunkter (24-48 h) (data ikke vist).
ARO, NPA og WRO cellene ble utsatt for 8-Cl-cAMP (200 mm) for ulike tidsperioder og aktiviteter av caspase 8 og 9 ble målt utnytte spesifikke selvlysende analyser. Dataene er hentet fra tre til seks uavhengige forsøk. * P 0,05 vs. basal. ** P 0,01 vs. basal. *** P 0,001 vs. basal. Alle data er uttrykt som variasjonen baseline.
Effekt av 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP analoger på de nivåene av PKA subenheter
Siden det har vært rapporterte at 8-Cl-cAMP fører til en nedregulering av RIα og en oppregulering av RIIβ subenheter [14], [21], sammenlignet vi effekten av 8-Cl-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger på ekspresjon av PKA R-subenheter. For dette formålet ble ARO, NPA og WRO celler stimulert med 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP analoger for ulike tidsperioder og nivåene av RIα, RIIα og RIIβ ble evaluert av Western blot analyse utnytte isoform spesifikke antistoffer. Behandling av ARO, NPA og WRO celler med enten 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP analoger ble assosiert med en reduksjon av uttrykket nivåer av RIα subenhet, mens nivåene av de gjenværende subenhetene ble ikke påvirket (figur 4 ).
ARO, NPA og WRO celler ble behandlet med 8-Cl-cAMP (100 mm) eller PKA i-selektive cAMP analoger (100 mikrometer hver) for de angitte tidsperioder. Nivåene av RIα, RIIα og RIIβ ble målt ved Western blot analyse. Vist er representative Western blot (A), så vel som resultatene av densitometrisk analyse av fire uavhengige eksperimenter (B). * P 0,01 vs. basal. ** P 0,001 vs. basal. Disse dataene er uttrykt som variasjon baseline.
Effekt av 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP analoger på ERK 1/2 og Akt
I et forsøk på å bedre å forstå virkningsmekanismen av 8-Cl-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger, vi deretter undersøkt effekten av begge typer behandling på to nøkkelsignalkaskader som er involvert i cellevekst, dvs. det ekstracellulære signalregulerte kinase 1/2 (ERK) mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) reaksjonsveien og den fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt svei.
ERK1 /2 er godt karakterisert MAPK som aktiveres som respons på vekst stimuli og spiller viktige roller i neoplastisk transformasjon [22]. I tillegg har cAMP blitt funnet å hemme ERK 1/2 aktivering i flere av de celletypene hvor den har en antiproliferativ virkning [1], [2]. Dette synes å være tilfelle også i ARO og NPA-celler, der, som vi tidligere har vist, er den antiproliferative effekten av PKA I-selektive cAMP analoger forbundet med en hemning av ERK-fosforylering ved 1/2 Thr202 /Tyr204 [19] . På bakgrunn av dette, vurderte vi effekten av 8-Cl-cAMP-behandling på ERK-fosforylering ved Thr202 /Tyr204 ved Western blot-analyse med en fosfo-spesifikt antistoff. Analyse av ERK-aktivering på tidlige tidspunkter avslørt forbigående økning for begge behandlingene (Figur S3). I strid med hva vi tidligere observert i respons til PKA I-selektive cAMP-analoger, ble kronisk eksponering til 8-Cl-cAMP ikke forbundet med en sen og vedvarende hemning av ERK-fosforylering (figur 5).
ARO , NPA og WRO celler ble behandlet med 8-Cl-cAMP (100 pM) eller PKA i-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) for de angitte tidsperioder. Den nivåer ERK 1/2 fosforylert ved Thr202 /Tyr204 og total ERK ble målt ved Western blot-analyse. Vist er representative Western blot, så vel som den densitometriske analyse av tre til fire uavhengige forsøk. P-ERK /total-ERK prosenter er uttrykt som den relative variasjon versus basalnivåer av hvert enkelt eksperiment. * P 0,05 vs. basal. ** P . 0,01 vs. basal
Et annet protein som har vært implisert i celleformering er en serin /treonin kinase Akt, som aktiveres av PI3K produkter og fosforylering ved Ser473 og Thr308 [23] . Vi vurderte derfor effekten av 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP analoger på Akt fosforylering på Ser473 og Thr308, en indikasjon på sin aktivering. I samsvar med det vi tidligere har rapportert [19], behandling med 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive analoger ikke føre relevante modifikasjoner av Akt fosforylering på tidlige tidspunkter (Figur S3) og for opp til 72 timer (data ikke vist).
Effekt av 8-Cl-cAMP eller PKA i-selektive cAMP analoger på p38 MAPK
8-Cl-cAMP har vist seg å indusere p38 MAPK fosforylering i HL60 og HeLa-celler [24], [25]. Derfor vurderte vi effekten av 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP analoger på p38 MAPK fosforylering. Vi fant at behandling av ARO, Norsk Folkehjelp og WRO celler med 8-Cl-cAMP var assosiert med en progressiv økning i p38 MAPK fosforylering, som begynner på 24 timer inkubasjon (figur 6). Tvert imot, har behandling med PKA I-selektive cAMP analoger ikke endre fosforylering tilstand av p38 MAPK (figur 6), med unntak for mindre og forbigående økninger som ikke nådde statistisk signifikans. Videre behandling med 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive analoger ikke føre til endringer av p38 MAPK fosforylering på tidlige tidspunkter (Figur S3).
ARO, NPA og WRO celler ble behandlet med 8- Cl-cAMP (100 pM) eller PKA i-selektive cAMP-analoger (100 uM hver) for de angitte tidsperioder. Nivået av fosforylert og total p38 MAPK ble målt ved Western blot-analyse. Vist er representative Western blot, så vel som den densitometriske analyse av tre uavhengige eksperimenter. P-p38 /total-p38-forhold er normalisert til basalnivåer. * P 0,05 vs. basal. ** P 0,01 vs. basal. *** P. 0,001 vs. basal
Til slutt, vi vurdert om den pro-apoptotiske effekten av 8-Cl-cAMP var avhengig av p38 MAPK aktivering. For å oppnå dette målet, vi behandlet i 48-72 timer alle tre cellelinjer med 8-Cl-cAMP i nærvær eller fravær av selektive p38 MAPK-inhibitorer (SB 202190 eller SB203580) og analyserte cellesyklusfordelingen ved strømningscytometri, som beskrevet ovenfor. Interessant, inhibering av p38 MAPK i stor grad forhindret den pro-apoptotiske virkning 8-Cl-cAMP (Figur 7).
Celler ble stimulert med 8-Cl-cAMP (100 pM) enten i nærvær eller i fravær av p38 MAPK-inhibitorer (10 uM SB203580 eller SB202190) i 72 timer, og apoptose ble bestemt ved strømningscytometri-analyse etter propidiumjodidfarging. Dataene er hentet fra minst tre uavhengige forsøk. Data er uttrykt som den variasjon i forhold til kontrollcellekultur. * P 0,05 og ** P. 0,001 vs. celler behandlet med 8-Cl-cAMP alene
Samlet utgjør disse dataene sterkt at den pro-apoptotiske effekten av 8-Cl-cAMP på ARO, er Norsk Folkehjelps og WRO celler mediert av p38 MAPK.
Involvering av AMPK i aktivering av p38 MAPK med 8-Cl-cAMP
En fersk studie [25] har rapportert at de antiproliferative virkningene av 8-Cl-cAMP kan bli mediert ved en aktivering av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) etter dens metabolisering til 8-Cl-adenosin. For å bekrefte denne hypotesen vi evaluert effekten av både en aktivator, AICAR, og en hemmer, Compound C, av AMPK. Behandling med AICAR etterlignet effekten av 8-Cl-cAMP på p38 MAPK fosforylering og på caspase 3/7 aktivitet. I tillegg forbindelse C var i stand til i stor grad å hindre både fosforylering av p38 MAPK og aktivering av apoptose indusert av 8-Cl-cAMP (Figur 8).
ARO, NPA og WRO celler ble stimulert med 8- Cl-cAMP (100 pM) eller et AMPK aktivator (AICAR, 1 mM) i 72 timer enten i nærvær eller fravær av forbehandling med en AMPK-inhibitor (forbindelse C, 2,5 uM). A: nivået av fosforylert og total p38 MAPK ble målt ved Western blot-analyse. Vist er resultatene av representative Western blot eksperimenter, så vel som den densitometriske analyse av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er normalisert til kontrollnivåer. B: kaspase 3/7 aktivitet ble bestemt med en selvlysende analysen. Vist er resultatene fra minst tre uavhengige eksperimenter. Dataene er normalisert til å kontrollere cellekultur. Forklaring: A: kontroll, B: 8-Cl-cAMP, C: AICAR, D: Forbindelse C, E: 8-Cl-cAMP + Forbindelse C, F: AICAR + Forbindelse C * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0,001 vs. kontroll. # P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001 vs. 8-Cl-cAMP. § P 0,05, §§ P 0,01, §§§ P. 0,001 vs. AICAR
Diskusjoner
cAMP analoger hemmer spredning av flere kreftceller. Den beste studerte av disse sammensatte er 8-Cl-cAMP, som har vist en antiproliferativ effekt både
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og har blitt evaluert i fase I /II kliniske studier [11 ], [12], [13]. I en fersk undersøkelse, har vi beskrevet den antiproliferative effekt av et par cAMP analoger selektiv for PKA jeg på menneskekreft cellelinjer [19]. Målet med dette arbeidet var å sammenligne effekten av disse cAMP analoger til den av godt studert 8-Cl-cAMP og videre undersøke deres mekanisme (r) av handlingen. Resultatene tyder på at 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger, men av lik styrke, skiller seg i celletype selektivitet og mekanisme (r) av handlingen. De PKA I-selektive cAMP analoger indusere vekstarrest, men ikke apoptose, og, som vi tidligere har vist, deres effekter synes å være formidlet av en PKA-avhengig inhibering av ERK-aktivering. Derimot, er 8-Cl-cAMP effekter mest sannsynlig utøves av metabolitten 8-Cl-adenosin, er uavhengige av PKA aktivering, og er tilsynelatende mediert av AMPK aktivering og påfølgende p38 MAPK-avhengig induksjon av apoptose.
Våre data indikerer at 8-Cl-cAMP og PKA i-selektive cAMP-analoger har en tilsvarende potent antiproliferativ effekt, noe som tyder på at de begge kan beholde et potensial for kreftterapi. De PKA I-selektive cAMP-analoger synes å kreve tilstedeværelse av konstitutive ERK-aktivering, som foreslått av deres være svært aktiv bare i BRAF
V600E-mutert ARO og NPA-celler, hvor de hemme ERK-fosforylering. I motsetning hemmer 8-Cl-cAMP sterkt cellevekst også i BRAF-negative WRO celler, noe som tyder på at det kan være effektivt i et bredere spekter av kreftceller.
Flere funn tyder på at 8-Cl-cAMP og PKA i-selektive cAMP analoger virker via forskjellige mekanismer. Først vises effekten av 8-Cl-cAMP skal medieres hoved, etter avtale med tidligere observasjoner [15], [16], [17], [18], ved dets metabolitt 8-Cl-adenosin, som handler via AMPK, og ikke ved stimulering av PKA, som foreslått av effekten av IBMX og selektiv AMPK aktivering /inhibering; tvert imot, ikke IBMX ikke endrer den antiproliferative reaksjon på de PKA I-selektive cAMP-analoger. Sekund, 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP analoger produsere ulike modifikasjoner av cellesyklus. Spesielt 8-Cl-cAMP, men ikke de PKA I-selektive cAMP-analoger, indusere apoptose. Tredje, PKA I-selektive cAMP analoger, men ikke 8-Cl-cAMP, redusere ERK-fosforylering i ARO og NPA celler. Fjerde, 8cl-cAMP, men ikke de PKA I-selektive cAMP analoger, øke p38 MAPK fosforylering.
Virkningsmekanismen av 8-Cl-cAMP er sterkt omdiskutert. Cho-Chung og kolleger har gjort et betydelig arbeid på dette emnet, og resultatene av disse viser at 8-Cl-cAMP induserer veksthemming ved å øke RI til RII ratio [14], [21]. På den annen side, nyere studier tyder på at denne regulering er ikke den viktigste årsaken til den observerte vekstinhibering [17]. I denne rapporten ser vi at 8-Cl-cAMP reduserer uttrykk for RIα i ARO, NPA og WRO celler. Imidlertid finner vi at IBMX, som blokkerer konvertering av 8-Cl-cAMP til 8-Cl-adenosin, en metabolitt i stand til å aktivere PKA, reduserer antiproliferative effekten av 8-Cl-cAMP betydelig.
En fersk studie [25] har vist at 8-Cl-adenosin er i stand til å stimulere AMPK, så vi undersøkte involvering av denne veien i 8-Cl-cAMP-indusert apoptose. Våre data viser at induksjon av apoptose av 8-Cl-cAMP er ledsaget av aktiveringen av caspase 3/7, og lignende resultater ble oppnådd ved AICAR, en aktivator av AMPK. Videre, forbindelse C, et AMPK-hemmer, forhindrer caspase 3/7 induksjon av både AICAR og 8-Cl-cAMP respektivt. Til slutt foreslår at den pro-apoptotiske virkning av 8-Cl-cAMP medieres av AMPK.
I tillegg, viser vi at den pro-apoptotiske virkning av 8-Cl-cAMP er ledsaget av en progressiv økning av p38 MAPK fosforylering. P38 MAPK er en viktig regulator av celleoverlevelse [26], [27], og har vært implisert i den pro-apoptotiske virkning av 8-Cl-cAMP in HL60 og HeLa-celler [24], [25]. For å undersøke om p38 MAPK aktivering er avhengig av AMPK vi ansatt en aktivering /hemming strategi lignende til at en vedtatt for caspase 3/7. Siden AMPK blokade i stor grad forebygges og AMPK aktivering etterlignet effekten av 8-Cl-leir på p38 MAPK, våre data sterkt at 8-Cl-cAMP etter konverteringen i metabolitten 8-Cl-adenosin aktiverer p38 MAPK gjennom stimulering av AMPK.
i et forsøk på å klargjøre banen som fører til caspase 3/7 aktivering, målte vi aktiviteten av oppstrøms kaspasene 8 og 9, som er involvert i den ytre og indre apoptotiske reaksjonsveier, henholdsvis. Mens det ble observert noen aktivering av kaspase 9, ble en tidlig og bare forbigående (5 min-1 h) aktivering av kaspase 8 detektert. Disse dataene kan tyde på en involvering av ytre vei i pro-apoptotiske virkninger av 8-Cl-cAMP. Imidlertid, gitt den observerte lange forsinkelsen mellom aktiveringen av caspase 8 og 3/7, og den forbigående art av kaspase 8 aktivering, er det mulig at andre mekanismer, sannsynligvis uavhengig av oppstrøms caspaser, kan være involvert i aktiveringen av caspase 3 /7. Interessant, selv om de mekanismer som p38 MAPK kan aktivere kaspaser ikke er helt klarlagt, er en mulig direkte aktivering av kaspase 3 av p38 MAPK er også blitt rapportert [28].
Som konklusjon, våre data indikerer at både 8-Cl-cAMP og PKA i-selektive cAMP analoger har en tilsvarende potent antiproliferativ effekt på kreftcellelinjer av ulik opprinnelse. Dermed er de begge beholde et potensial som kreft narkotika. 8-Cl-cAMP synes å være effektiv i et bredere spekter av celletyper og induserer apoptose. På den andre siden, mekanismen (e) av virkningen av 8-Cl-cAMP og PKA I-selektive cAMP-analoger er forskjellige, noe som antyder at de kan ha ulike farmakologiske og toksikologiske profiler, samt unike antitumoregenskaper. Future
in vivo
eksperimenter vil bli pålagt å sammenligne deres effekt og toleranse i prekliniske kreft modeller.
Materiale og metode
Kjemi
Cell kultur reagenser var kjøpt fra Invitrogen (San Giuliano Milanese, Italia). 8-kloradenosin-3 «, 5′-cyklisk monofosfat (8-Cl-cAMP), 8-piperidinoadenosine-3′, 5»-cyklisk monofosfat (8-PIP-cAMP) og 8-hexylaminoadenosine-3 «, 5’cyclic monofosfat (8-HA-cAMP) ble kjøpt fra Biologisk Life Science Institute (Bremen, Tyskland). BCA kit og nitrocellulose membraner ble kjøpt fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL). PKARIα, PKARIIα, PKARIIβ og p-aktin antistoffer ble kjøpt fra BD Biosciences Pharmingen (Milan, Italia). Fosfor-ERK, fosfor-Akt, fosfor-p38 MAPK, ERK, Akt og p38 MAPK antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). HRP konjugert mus og kanin sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Chemicon International (Temecula, CA). ECL-plus kit ble kjøpt fra Amersham Biosciences Europe (Freiburg, Tyskland). Celledød Detection ELISA Plus kit ble kjøpt fra Roche Applied Science (Mannheim, Tyskland). Den CellTiter-Blue celle levedyktighet og caspase-Glo 3/7, 8 eller 9 analysene ble kjøpt fra Promega Corporation (Madison, WI, USA). 4- (4-fluorfenyl) -2- (4-metylsulfinylfenyl) -5- (4-pyridyl) 1H-imidazol (SB203580) ble innkjøpt fra Biosource (Nivelles, Belgia). 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), 4- (4-fluorfenyl) -2- (4-hydroksyfenyl) -5- (4-pyridyl) -1 H-imidazol (SB202190), bisindolyl-maleimid I (GF109203X), AICAR, 6- [4- (2-piperidin-1-yletoksy) fenyl] -3-pyridin-4-ylpyrazolo [1,5-a] pyriimdine (forbindelse C) og alle andre reagenser ble levert fra Sigma-Aldrich (Milan , Italia).
Cell kultur
ARO, NPA og WRO celler ble vennlig levert av I. Bongarzone (Milan, Italia). En fersk DNA profilering analyse har avdekket at ARO celler matche HT-29 tykktarmskreft cellelinje og NPA celler matche M14 /MDA-MB-435s melanoma cellelinje [29]. WRO celler stammer fra en follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma [30]. Alle celler ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% FCS, 1% penicillin og streptomycin 1% ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2.
Selektiv aktivering av PKA I
for å selektivt aktivere PKA jeg, benyttet vi brukte strategi samtidig å benytte to forskjellige cAMP analoger, dvs. 8-piperidinoadenosine-3 «, 5»-syklisk monofosfat (8-PIP-cAMP) og 8-hexylaminoadenosine-3 «, 5’cyclic monofosfat (8-HA-cAMP), hver med høy selektivitet for binding til enten området A (8-PIP-cAMP) eller B (8-HA-cAMP) av type i PKA R-subenheter [19].
proliferasjonsanalyse
Celleproliferasjon ble evaluert anvendelse av 3- (4,5-dimetylthiazole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, som beskrevet tidligere [19 ]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater, og 24 timer etter utplating ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger (8-PIP-cAMP + 8-HA-cAMP). For hemming av PKC, ble celler inkubert i 30 minutter med GF109203x før tilsetningen av 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger. MTT (0,5 mg /ml) ble tilsatt til cellene i tre timer før måling, og formazankrystaller, dannet av mitokondriell reduksjon av MTT, ble solubilisert i DMSO /etanol 01:01. Relative veksten ble beregnet fra absorbans ved 550 nm benytte følgende ligning: Relativ vekst (%) = (OD
550nm av behandlede brønner /OD
550nm av kontrollbrønner) × 100
Detection. av apoptotisk DNA-fragmentering
DNA-fragmentering ble evaluert utnytte celledød Detection ELISA Plus kit. Denne analysen gir en kvantitativ bestemmelse av histon-assosierte DNA-fragmenter (mono- og oligo-nukleosomer) i cytoplasmatic fraksjonen av cellelysatene. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater, og 24 timer senere behandlet med 8-Cl-cAMP eller PKA I-selektive cAMP-analoger i 48 timer. Prøvene ble deretter behandlet og analysert i triplikat, i henhold til produsentens instruksjoner.
Bestemmelse av kaspase-aktivitet
Caspase-aktiviteten ble målt med selvlysende Caspase-Glo 3/7, 8 eller 9 assays etter produsentens anvisninger. Kaspase 3/7 aktivitet ble normalisert for antall celler som inneholdes i hver brønn bestemmes utnytte den fluorometriske CellTiter-Blue celleviabilitet assay. Aktiveringsnivå caspases 8 og 9 er uttrykt i forhold til ikke-behandlede prøver. Lysende og fluoriserende målinger ble utført utnytte Fluoroskan Ascent FL multiplate leser (Thermo Labsystems, Helsinki, Finland).
Analyse av cellesyklus ved flowcytometri
Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket i PBS og deretter fiksert med iskald 70% etanol. Fikserte celler ble vasket med PBS og farget med PBS inneholdende 40 ug /ml propidiumjodid og 100 ug /ml RNase A ved 37 ° C i 30 minutter. Prøvene ble analysert med FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Buccinasco, Italia).
Western blot analyse
For deteksjon av PKA regulatoriske subenheter ble cellene lysert i modifisert RIPA buffer som inneholder proteasehemmere ( 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP40, 1% Na-deoksykolat, 2 mM EDTA, 2 mM Na
2VO
4, 2 mM Na
4P
2o
7, 2 mM NaF). For påvisning av ERK, Akt, og p38 MAPK fosforylering ble cellene lysert med SDS-prøvebuffer (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% glyserol, 50 mM DTT, 0,01% bromfenolblått), straks oppvarmes i fem min ved 95 ° C og ultralydbehandlet.
