Abstract
Bakgrunn
Med opprinnelse fra Primordial kjønnsceller /gonocytes og utvikle via en forløper lesjon kalles Carcinoma
In Situ plakater (CIS), Germ Cell Kreft (GCC) er den vanligste kreftformen hos unge menn, inndelt i seminom (SE) og ikke-seminom (NS). Under fysiologiske bakterie celle formasjon /modning, epigenetiske prosesser vokte homeostase ved å regulere tilgjengeligheten av DNA for å lette transkripsjon. Epigenetisk deregulering gjennom genetiske og miljøparametre (dvs. genvironment) kan forstyrre embryonale bakterie celle utvikling, noe som resulterer i forsinket eller blokkert modning. Dette letter potensielt dannelsen av CIS og progresjon til invasiv GCC. Derfor bestemme epigenetisk og funksjonell genomikk landskapet i GCC cellelinjer kan gi innsikt i patofysiologi og etiologi av GCC og gi veiledning for målrettede funksjonelle eksperimenter.
Resultater
Denne studien tar sikte på å identifisere epigenetisk fotavtrykk i SE og EC cellelinjer i genom-wide-profiler ved å studere samspillet mellom genuttrykk, DNA CpG metylering og histonmodifikasjonene, og deres funksjon i patofysiologien av og årsak til GCC. To godt karakteriserte GCC-avledede cellelinjer ble sammenlignet, en representant for SE (TCAM-2) og den andre for EC (NCCIT). Data ble ervervet ved hjelp av Illumina HumanHT-12-v4 (genekspresjon) og HumanMethylation450 BeadChip (metylering) mikromatriser samt chipsekvensering (aktivering histonmodifikasjonene (H3K4me3, H3K27ac)). Resultatene tyder på kjente bakterie celle markører ikke bare for å bli differensiere mellom SE og NS på uttrykket nivå, men også i epigenetisk landskapet.
Konklusjon
Den generelle likheten mellom TCAM-2 /NCCIT støtte en slettet embryonisk bakterie celle arrestert i begynnelsen av gonadal utvikling som vanlig celle er utstedt selv om det nøyaktige utviklingsstadiet for tumorcellene er avledet kan være annerledes. Faktisk, subtil forskjell i (integrert) epigenetiske og uttrykk profiler indikerer TCAM-2 til å vise en mer bakterie celle-lignende profil, mens NCCIT viser en mer pluripotent fenotype. Resultatene gir innsikt i funksjonell genom i GCC cellelinjer
Citation. Van der Zwan YG, Rijlaarsdam MA, Rossello FJ, Notini AJ, de Boer S, Watkins DN, et al. (2014) Seminoma og embryonal karsinom Footprints identifisert ved analyse av integrerte Genome-Wide epigenetisk og Expression Profiler av Germ Cell Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (6): e98330. doi: 10,1371 /journal.pone.0098330
Redaktør: Amr H. Sawalha, University of Michigan, USA
mottatt: 13 mars 2014; Godkjent: 30 april 2014; Publisert: 02.06.2014
Copyright: © 2014 van der Zwan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Array og chip-sekvensering av data er tilgjengelig på Gene Expression Omnibus under tilgjengelighetsnummeret GSE56454
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av midler fra European Society for Pediatric Endocrinology stipend (YZ). MR er støttet av en Translasjonell Grant, Erasmus MC. SB er støttet av TFO og IPR stipend fra Monash University. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Monash University (SW). MIMR får støtte fra den viktorianske regjeringens Operational Infrastructure Support Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Type II (testiklene) bakterie celle svulster, her referert til som Germ Cell Kreft (GCC), er den vanligste kreftformen hos kaukasiske ungdom og unge voksne, og deres forekomst er fortsatt stigende [1] – [3 ]. GCC stammer fra primordial kjønnsceller eller gonocytes, og er delt inn i nomas (SE) og ikke-seminomas (NS), med carcinoma
in situ plakater (CIS) av testis som deres felles forløper lesjon [1], også kjent som Intratubular Germ Cell neoplasi Unclassified (IGCNU) [3]. I motsetning til CIS og SE, stamcelle komponenten av NS (dvs. embryonal karsinom, EC) er karakterisert ved pluripotent potensiell [4]. EF kan differensiere til somatiske linjene og ekstra-embryonale vev (teratom vs plommesekken svulsten og choriocarcinom, henholdsvis), herunder bakterie celle avstamning [4]. Ulike kliniske, miljømessige og genetiske risikofaktorer for GCC har blitt identifisert, men den eksakte rollen av disse faktorene er ikke helt klart. Kliniske risikofaktorer utgjør urologiske /andrological /gonadale avvik [5] – [8], mens miljøfaktorer fokusere på hormonforstyrrende og androgen – østrogen balanse [9] – [11]. Genetiske risikofaktorer inkluderer en rekke mottakelighet enkeltnukleotidpolymorfi, sannsynligvis relatert til tidlig gonadal utvikling [12] – [15] og en forening med familiær disposisjon [16]. Somatiske mutasjoner er sjelden funnet i GCC [17]. Det er sterke indikasjoner på at mikro-miljøet i utviklings testis er av vesentlig betydning i patogenesen av GCC. Pasienter med Testicular dysgenesis syndrom (TDS) og spesifikke former for Disorders of Sex Development (DSD) er kjent for å ha en økt risiko for å utvikle GCC på grunn av unormal gonadal utvikling, dvs. hypovirilization [18].
epigenetiske prosesser har en tydelig rolle i både initiering og beskyttelse av pluripotency [19]. Deregulering av disse tett kontrollert fremgangsmåter er kjent for å være involvert i dannelsen og utviklingen av ulike cancertyper [20] – [24], inkludert GCC [25]. Under fysiologiske bakterie-celle-dannelse og modning, epigenetiske prosesser (for eksempel DNA-metylering, histonmodifikasjonene) vakt homeostase ved å regulere tilgjengeligheten av DNA for å lette transkripsjon [25], [26]. Den epigenome er svært dynamisk, og endringer skjer avhengig av celletype og utviklingsstadiet, påvirket av /reflektere (mikro-) miljø. På tross av denne kunnskapen, er lite kjent om rollen histonmodifikasjonene og DNA metylering av genuttrykk i GCC generelt, og mulige likheter og forskjeller mellom SE og EC [25], [27]. Epigenetisk deregulering gjennom genetiske og miljømessige parametere (referert til som genvironment) kan forstyrre fysiologiske embryonale bakterie celle utvikling, noe som resulterer i forsinket eller blokkert modning, og dermed legge til rette for dannelsen av CIS, og potensielt progresjon til en invasiv GCC [25], [28] – [30]. Derfor bestemme epigenetisk og funksjonell genomikk landskapet i GCC cellelinjer kan gi innsikt i patofysiologi og etiologi GCC. Resultatene kan gi veiledning for målrettede funksjonelle eksperimenter.
I denne studien epigenetiske fotavtrykk av SE og EU-cellelinjer ble identifisert ved å studere samspillet mellom genuttrykk, DNA metylering og histonmodifikasjonene. To godt karakteriserte GCC-avledede cellelinjer som ble anvendt, en representant for SE (TCAM-2) [31], [32], og den andre for EC (NCCIT) [33]. To typer epigenetiske modifikasjoner ble undersøkt og relatert til genom bredt uttrykk analyse. CpG DNA metylering status, og berikelse av aktivering histone tegn (H3K4me3, H3K27ac)
Metoder
Cell kultur
TCAM-2 [31], [32], [34] og NCCIT [33] celler dyrket i DMEM medium (# 31966-021, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) inneholder 10% føtalt kalveserum (FCS, GE Healthcare og biovitenskap, HyClone Laboratories, Utah, USA) i T75 cm
2 kolber til 75-90% samløpet. For RNA forberedelse, ble frisk medium tilsatt 24 timer før innhøstingen. Cellene ble vasket en gang med Hanks balanserte saltløsning (HBSS, # 14175-053, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), og lysert med 7 ml iskald RNA-Bee (# Cs-105B, TEL -Test Inc, Friends, Texas, USA). For metylering, genekspresjon (biologiske duplikater) og chip-seq analyser, ble ulike kulturer av celler fra en enkelt kilde brukes (LEPO lab, Avdeling for patologi, Erasmus MC Rotterdam). Biologiske replikater ble startet som selvstendige kulturer på forskjellige dager og behandlet på samme måte.
Metylering profilering
DNA ble isolert ved hjelp av DNeasy kit i henhold til produsentens instruksjoner (# 69504, QIAGEN, Hilden, Tyskland). Bisulfite konvertering (EZ DNA Metylering Gold Kit, Zymo Research, Irvine, CA, USA) og metylering påvisning ble utført ved ServiceXS (ServiceXS B.V., Leiden, Nederland). Illumina er HumanMethylation450 BeadChip ble brukt (Illumina, Inc., San Diego, CA, U.S.A., foredling og hybridisering i henhold til produsentens instruksjoner). Bildebehandling fant sted på iscan systemet og dataene ble hentet ved hjelp GenomeStudio, ved hjelp av standard analyseinnstillinger (inkludert bakgrunnskorreksjon og normalisering basert på interne kontroller) og v 1.2 av merknaden manifest (https://support.illumina.com/downloads /humanmethylation450_15017482_v12.ilmn). Videre behandling ble utført i R bruker (https://www.bioconductor.org/) pakke LUMI [35] etter optimalisert «Lumi: QN + BMIQ» rørledning [36] Dette innebærer utelukkelse av dårlige resultater prober (p 0,01), fargejustering, quantile normalisering og korrigering for sonde typen skjevhet (infinium i vs II) ved hjelp av BMIQ algoritme [37]. Alle rå og bearbeidede datafiler sendes som en geo SuperSeries og tilgjengelig via GSE56454 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Ulikt denaturert regionene ble identifisert ved hjelp av DMRforPairs algoritmen med standardinnstillingene [38]. DMRforPairs er tilgjengelig via Bioconductor: (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DMRforPairs.html). Kort, definerer DMRforPairs genomiske regioner med lokale sonde tetthet og eventuelt funksjonell homogenitet (f.eks alle sonder i en region bør gen forbundet). Det kvantifiserer, tester og visualiserer (differensial) metylering mønstre mellom uavhengige utvalg. Forskjeller ble beregnet som NCCIT versus TCAM-2.
genuttrykk profilering
Om lag 20 mikrogram av RNA ble behandlet med RNase-fritt DNaseI (# 2238, Ambion, Ambion Inc., Austin, TX , USA) i 30 minutter ved 37 ° C og deretter renset ved anvendelse av RNeasy mini kit (# 74104, Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Pure RNA ble eluert i 50 ul vann, og kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop (Thermo Scientific). Kvalitetskontroll, RNA merking, hybridisering og datauttrekk ble utført ved ServiceXS B.V. (Leiden, Nederland) i henhold til deres in-house-protokollen. Biotinylated cRNA ble utarbeidet etter den Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (# AMIL1791, Ambion Inc., Austin, TX, USA) i henhold til produsentens spesifikasjoner med en inngang på 200 ng total RNA. Per prøve, ble 750 ng av det biotinylerte cRNA hybridisert på Illumina HumanHT-12 v4 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) i henhold til den Illumina Manual «Guide direkte Hybridization Assay». Bildebehandling fant sted på iscan systemet og dataene ble hentet ved hjelp GenomeStudio (standardinnstillinger). Videre behandling ble utført i R ved hjelp av LUMI pakken (https://www.bioconductor.org/) [35]. Etter retningslinjene i [39], ble robust spline normalisering brukt til log2 forvandlet intensitetsverdier. Prober med p
deteksjon 0,05 i 50% av prøvene ble ekskludert fra analysen (n = 27 964 av 47 323). Gjennomsnittlig log2 intensiteter av biologiske replikater og pr-genet ble brukt for å vurdere uttrykk nivåer (GEO sjonsnummer GSE56454). Log2-forhold (R) av den gjennomsnittlige intensitet i de to cellelinjer (NCCIT /TCAM-2) ble anvendt for å identifisere vesentlig differensielt uttrykte gener. Gener med uttrykket nivåer utenfor 99% konfidensintervall (KI) i denne loggen forholdet ble identifisert som uttrykt forskjellig mellom NCCIT og TCAM-2.
Histone modifikasjon profilering (H3K27ac, H3K4me3)
ChIP analysen ble utført i overensstemmelse med det lave celletall ChIP protokoll fra Diagenode (Liege, Belgia), med mindre modifikasjoner. I korte trekk, 1 x 10
6-celler ble kryssbundet i åtte minutter ved tilsetning av formaldehyd til en sluttkonsentrasjon på 1%, etterfulgt av nøytralisering med 1,25 M glycin. Cellene ble deretter lysert, og kromatin ble skåret til ca. 500 bp fragmenter ved hjelp av Covaris ultralyd under følgende betingelser; driftssyklus 20%, peak hendelsen makt 200 watt, sykluser /briste 200, tids 5 min, temperatur 4 ° C. Protein A-belagt Dynabeads (# 10002D, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ble inkubert med 7 mikrogram av disse antistoffene: H3K4me3 (Diagenode pAb-003-050) eller H3K27ac (Ab4729, Abcam, Cambridge, UK). Kulene ble kombinert med kromatin fra 1 × 10
6 celler overnatter på et roterende hjul. De immunokuler ble vasket, og DNA ble renset ved hjelp av iPure DNA rensing kit (AL-100-0100, Diagenode, Liège, Belgia) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA-fragmenter ble skåret en gang ved hjelp av en Covaris ultralyd (driftssyklus 10%, peak forekomst makt 175 watt, sykluser /briste 200, tids 5 minutter, temperatur 4 ° C). Massivt parallell sekvense chip DNA (ChIP-Seq) ble utført ved hjelp av 5500xl Solid ™ sekvense plattform (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ved Monash Helse Oversettelse Precinct Medical Genomics Facility. De sekvense forsøkene var single-end med 50 nt lese lengde (300 nt gjennomsnittlig fragmentstørrelse). Sekvense leser ble justert til hele hg19 menneskelige genom (UCSC versjon, februar 2009) hjelp LifeScope ™ Genomisk Analysis Software v2.5 (https://www.lifetechnologies.com/lifescope). Chip-Seq eksperimentelle prøver ble normalisert til totalt 10
7 entydig kartlagt sekvense koder. Data ble behandlet i HOMER ([40], https://homer.salk.edu/homer/chipseq/) for å oppdage topper og motiv enrichments bruker standardinnstillingene (unntatt «fold berikelse enn input», brukte 2; terskel for p -verdi 0,01) (GEO tiltredelse antall GSE56454). Topphøyder fra HOMER ble korrigert for bakgrunns (laveste topphøyde påvises). Heights ble deretter summert per genet (ogOp) som kommentert av Homer og gener uten påviselig topp ble satt til 0. Forskjellen i summeres topphøyder (ΔΣP = ogOp
TCAM-to-ogOp
NCCIT) ble brukt til å kvantifisere forskjeller mellom cellelinjer. Gener med betydelig forskjells histone modifisering mønstre ble identifisert for begge merkene separat (utenfor 99% CI av ΔΣP). Foreningen av en topp med TSS ble brukt som kommentert av HOMER (1 kb oppstrøms av TSS – 100 bp nedstrøms)
MLPA-DNaseI analyse
MLPA prober ble utformet følgende tidligere beskrevet kriterier [. ,,,0],41]. Basert på differensialmodifikasjons mønstre i NCCIT og TCAM-2 prober ble utformet for følgende loci: NCCIT: chr3: 181425532-181425720, chr5: 146699813-146699953, chr3: 181577755-181577830, chr6: 15240050-15240160, chr15: 93191596-93191696 , chr3: 178908801-178908966, chr5: 101550991-101551125, TCAM-2: chr11: 10613134-10613220, chr1: 201278163-201278251, chr12: 3091402-3091483, chr19: 13985162-13985322, chr2: 38323813-38323931, chr9: 843018 -843110, chr5: 140762378-140762475. MLPA-DNaseI ble utført som tidligere beskrevet [42], med mindre modifikasjoner. I korte trekk, kjerner fra 1 x 10
6-celler ble isolert og behandlet med en rekke DNaseI konsentrasjoner (0, 2 og 5 enheter). Fordøyd genomisk DNA ble renset, og 50-100 ng ble anvendt i en MLPA reaksjon. Etter PCR-amplifisering av avsnørede prober, ble produktene separert på en ABI3700 DNA sequencer. Data ble analysert som beskrevet tidligere, med en reduksjon til 75% av topphøyde i ufordøyd DNA brukes som en terskel for å definere DNaseI-overfølsomhet [43].
Software
Analyser ble utført i R 3.0.1 (Windows 7 × 64) og 2.15.2 (Redhat Linux × 64). Nettverk /berikelse analyser ble utført i IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Genomisk stillinger rapportert i dette manuskriptet er basert på GRch37 /hg19 montering.
Resultater
For å undersøke epigenetiske kjennetegn SE og EU og deres forhold til genuttrykk, genome-wide histone modifikasjon og DNA metylering mønstre ble undersøkt i cellelinjene TCAM-2 (SE) og NCCIT (EF), og tilpasset til genekspresjonsprofiler. Forskjellene mellom de to cellelinjene med hensyn til histon modifikasjon og DNA-metylering status ble først undersøkt hver for seg. Deretter ble de resulterende datasett integrert for å identifisere (mål) gener med en sterk sammenheng mellom primet DNA konfigurasjon og høyere uttrykk nivåer.
Histone modifikasjon
Histone modifikasjons mønstre ble vurdert ved hjelp av kromatin immunoprecipitation kombinert med høy gjennomstrømming sekvensering (Chip-seq). Dataanalyse ble utført som beskrevet i materialer og metoder delen. Endringer i H3K4me3 og H3K27ac ble undersøkt, som er markører assosiert med arrangøren aktivering (transkripsjon start hotellet (TSS), H3K4me3 og H3K27ac) og forsterker aktivering (primært H3K27ac) [44], [45]. I tillegg til analyse av (differensial) modifikasjonsmønstre, ble motiv berikelse av de modifiserte regioner undersøkt og sammenlignet mellom cellelinjene.
H3K4me3 og H3K27ac ikke viser differensial berikelse nær transkripsjonsstartsider og deres topphøyder korrelerte innenfor genene.
Avhengig av cellelinjen, 10,2 /11,3% av det H3K27ac anrikede loci ble plassert innen 1 kb av en TSS mot et tilsvarende 14,7 /16,8% av det H3K4me3 loci (TCAM-2 /NCCIT) . Dette er i tråd med observasjoner i andre celletyper viser at, selv om H3K4me3 er direkte relatert til promoter-aktivering, er et stort flertall av de H3K4me3 loci som ligger i avstand fra TSS [46]. H3K27ac har ingen rapportert fortrinnsrett lokalisering TSS [47]. Nivået av summerte topper pr genet (ogOp, se metoder) ble anvendt for å sammenligne histon modifikasjonsmønsteret mellom de to merkene histon. Det var signifikant korrelasjon i begge cellelinjene mellom toppnivåene på gener hvor begge var til stede (ρ
TCAM-2 = 0,62, p
TCAM-2 0,001, n
TCAM-2 = 1837; ρ
NCCIT = 0,37, p
NCCIT 0,001, n
NCCIT = 746; Spearmans ρ). Dette er i tråd med deres overlappende funksjon: åpen kromatin konfigurasjonen er assosiert med begge merkene [19], [22] og tillatt oss å kombinere histon modifikasjons resultater i påfølgende analyse
H3K4me3 og H3K27ac berikelse mønstre i. TCAM-2 og NCCIT er i samsvar med kjente SE /EC markører spesifisitet.
Vi har tidligere vist at aktive kromatin modifikasjons mønstre for
SOX17 Hotell og
SOX2
i cellelinjene TCAM-2 og NCCIT matche forventede mønsteret, basert på gen- og proteinuttrykk og histologisk grunnlov (
SOX17
aktiv i TCAM-2,
SOX2
aktiv i NCCIT) [25]. I tråd med dette,
SOX17 Hotell og
SOX2
ble ulikt beriket både H3K4me3 og H3K27ac i henholdsvis TCAM-2 og NCCIT (figur 1).
OCT3 /4
viste ingen berikelse innenfor den kodende sekvensen, men det var berikelse av begge merkene nær TSS i NCCIT og TCAM-2. Dette er i overensstemmelse med kjent OCT3 /4-mRNA og protein ekspresjon i begge cellelinjer [31], [48]. Nanog var mer beriket for begge merkene i TCAM-2, i tråd med forskjeller i uttrykk nivå (se nedenfor).
Piler indikerer retningen av transkripsjon. Grønne bokser indikerer markører spesifikke for histologisk undertype representert ved den cellelinjen. Svarte bokser = ingen forskjell mellom cellelinjene; røde bokser = ikke en markør for at celletype. Legg merke til de forskjellige områdene på y-aksen for H3K4me3 og H3K27ac.
På et genom-wide skala, ble 29,428 H3K4me3 beriket loci identifisert i TCAM-2 og 19 015 i NCCIT. 25-41% mer beriket loci ble identifisert for H3K27ac enn for H3K4me3 (n
TCAM-2 = 41 569, n
NCCIT = 23763). Gener med signifikante forskjeller i oppsummerte topphøyde per genet (ΔΣP, se Methods) ble valgt ut for videre analyse. For TCAM-2, gener som viser differensial histonmodifikasjonene var høyere i tall for H3K27ac (n
TCAM-2 = 433, N
NCCIT = 28). For NCCIT var det vesentlig flere gener som er valgt for H3K4me3 forhold til H3K27ac (n
TCAM-2 = 215, N
NCCIT = 325). For begge merkene, 86/11 gener overlappet mellom topp differensierende lister i TCAM-2 og NCCIT hhv. Disse inkluderte SE markør
SOX17
i TCAM-2 og EF markør
SOX2
i NCCIT (figur S1, Tabell S1). Funksjonelt, gense lister over begge cellelinjene viste betydelig berikelse for (embryo) stamcelle vedlikehold /pluripotency (tabell S2). Anriking av biologiske funksjoner i TCAM-2 indikert likheten til mer modne kjønnsceller, som manglet i listen over NCCIT (GO kategorier TCAM-2 inkluderte utvikling av normal testikkel morfologi og bakterie celle vedlikehold). Videre to bakterie celle-spesifikke kanoniske trasé IGF1 signale (log
p = 3,42) og bakterie celle-Sertoli celle Junction Signa (log
p = 2,11)) viste berikelse. I TCAM-2, ble to funksjonelle nettverk identifiseres innlemme AR sti og lipid metabolisme (tabell S2).
Kimcelle markører AP-2α og AP-2γ er topp beriket motivene i TCAM-2, mens embryonale stamceller celle spesifikke motiver SOX2 /OCT4 /TCF /Nanog er anriket i begge cellelinjer.
Betydelig beriket motiver ble identifisert for hver cellelinje og histon mark (HOMER verktøyet, se Methods). Det var sterk overlapping mellom de topprangerte beriket motivene i NCCIT og TCAM-2. Dette gjaldt for både aktive markører. For eksempel, for H3K4me3 den øverste anrikede motivet var MAZ for både TCAM-2 og NCCIT, en transkripsjonsfaktor i forbindelse med MYC (binder til to steder i dens promoter) og kjent for å være involvert i transkripsjon initiering samt avslutning [49] ( Figur 2A, B;. Tabell S3)
Alle motivene ble betydelig anriket i målet over bakgrunns sekvenser (p 0,01). Fold berikelse er angitt i forhold til bakgrunnen. (A, B) topp rangering motivene i begge cellelinjene viste sterk overlapping (topp 10). (C, D) Motiver som avvek sterkt mellom cellelinjene med hensyn til deres enrichments ble valgt. Et motiv ble vurdert gunstig hvis rangeringen var høy (≤20) for en cellelinje og lav for den andre cellelinjen (eller var fraværende i den andre listen av anrikede motiver). Score: Forskjellen i rangeringen ble vurdert basert på forskjellen i relativ posisjon i listen (
