Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er en ledende årsak til kreft dødsfall i Europa og USA. Det er ingen universelt akseptert effektiv ikke-invasiv screening test for CRC. Guaiac basert blod i avføringen (gFOB) testing har i stor grad blitt erstattet av Sanitære Immunokjemisk testing (FIT), men følsomheten er fremdeles dårlig. Opptaket av befolkningen basert FOBT testing i Storbritannia er også lav på rundt 50%. Påvisning av flyktige organiske forbindelser (VOC) underskrift (er) for mange kreft undergrupper får stadig større interesse ved hjelp av en rekke gassfase analytiske instrumenter. Et slikt eksempel er FAIMS (Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometer). FAIMS er i stand til å identifisere inflammatorisk tarmsykdom (IBD) pasienter ved å analysere endringer i VOC mønstre i både urin og avføring. Denne studien utvider dette konseptet for å avgjøre om CRC pasienter kan identifiseres gjennom ikke-invasiv analyse av urin, ved hjelp FAIMS. 133 pasienter ble rekruttert; 83 CRC pasienter og 50 friske kontroller. Urin ble oppsamlet på tidspunktet for CRC diagnose og headspace-analyse foretas ved hjelp av en FAIMS instrument (Owlstone, Lonestar, UK). Data ble behandlet ved hjelp Fisher diskriminant analyse (FDA) etter funksjon ekstraksjon fra rådata. FAIMS analyser viste at VOC profiler av CRC pasienter var tett klynge og kan skilles fra friske kontroller. Sensitivitet og spesifisitet for CRC deteksjon med FAIMS var henholdsvis 88% og 60%. Denne studien tyder på at VOC signaturer som kommer fra urin kan påvises hos pasienter med CRC bruker ion mobilitet spektroskopi teknologi (FAIMS) med potensial som en roman screeningverktøy
Citation. Arasaradnam RP, McFarlane MJ, Ryan-Fisher C , Westenbrink E, Hodges P, Thomas MG, et al. (2014) Deteksjon av tykktarmskreft (CRC) ved urin Volatile Organic Compound Analysis. PLoS ONE ni (9): e108750. doi: 10,1371 /journal.pone.0108750
Redaktør: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 13 juni 2014; Godkjent: 25 august 2014; Publisert: 30.09.2014
Copyright: © 2014 Arasaradnam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er inkludert i papir
Finansiering: Arbeidet ble støttet av Bardhan forskning og utdanning Charity (BRET) veldedighet, Warwickshire Private Hospital veldedighet, Eveson tillit – gitt støtte til materialer.. BRET ble etablert av professor Bardhan men han hadde ingen innspill til finansieringen vedtak av tilskuddet tildelingskomiteen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall i Europa og USA [1], [2]. I dag er det en mangel på effektive, ikke-invasiv screening tester for CRC. Dagens metoder utnytte guaiacum basert blod i avføringen (gFOB) testing, men dette er nå i stor grad blitt erstattet av Sanitære Immunokjemisk Testing (FIT). Mens dette er en forbedring, viser fremdeles FIT forholdsvis lav følsomhet for CRC, 66-88%, avhengig av de avskårne verdiene for hemoglobin (50-200 ng /ml), med en spesifisitet på 87 til 96% [3] – [ ,,,0],5]. Følsomheten for avansert adenom er enda lavere på 27-41%, med en spesifisitet på 91-97% [5]. Opptaket av screening utnytte avføringsprøver er også et problem, med ca 50% av inviterte deltakere ikke akseptere befolkningen basert FOBT screening i vår lokalitet.
Ikke-invasive tester for kreft, ved hjelp av flyktige organiske forbindelser (VOC) og gasser som kommer fra urin, pust, avføring og blod, har fått økende interesse og har vært en voksende forskningsområde de siste årene. Dette arbeidet opprinnelig startet fra bruk av hjørnetenner for å påvise kreft, som viste en markert evne til å diskriminere kreftpasienter fra friske individer [6], [7], [8]. Imidlertid har mer nylig et antall grupper indikert at det er mulig å bruke gassfaseanalyseinstrumenter, spesielt gasskromatografi og massespektrometri (GC MS), selektiv-ion strømnings massespektrometer (SIFT) og den elektroniske nesen (e-nese ), for å detektere lunge, bryst, blære og prostata-kreft [9], [10], [11], [12]. For en detaljert gjennomgang på gassfase biomarkører i gastroenterologi, se Arasaradnam et al [13].
I direkte tilknytning til tykktarmskreft (CRC), har nyere arbeid vist at det er mulig å diskriminere kreft fra ikke- kreftpasienter, men kan også bli anvendt for diskriminering av lunge, bryst, prostata og tykktarmskreft fra hverandre ved å analysere pusteprøver [14]. Dette er videre støttet av siste som har også vist at CRC kan skilles fra kontrollene med over 75% nøyaktighet ved hjelp av GC-MS, igjen ansette pusten analyse [15]. VOC som er tilstede i urinen er også blitt vist å skille CRC pasienter fra kontrollgrupper og andre krefttyper (leukemi og lymfom), med GC-MS [16]. Den elektronisk nese (Cyrano 320, Sensigent, USA) har også vist seg å diskriminere mellom CRC og friske kontroller når den VOC profilen i feces ble analysert (85% sensitivitet og spesifisitet 87%). I tillegg til e-nesen var i stand til å diskriminere mellom avanserte adenomer og friske kontroller med 62% sensitivitet og spesifisitet 86% [5]. Disse undersøkelser støtter eksistensen av mulige gassfase biomarkører innen biologisk utgangsmateriale for detektering av CRC og således kan være grunnlaget for en hurtig screening.
VOC kan eksistere i gassfasen, og er tilstede i utåndet luft , svette, urin og avføring [17], [18]. Mekanismen for generering av VOC er gjenstand for dagens forskning, men de er gjennomtrengt på mange fysiologiske og patologiske tilstander – påvirket av dietten og sykdomstilstander. Det antas at dannelsen av VOC i tarmen er et resultat av tykktarmbakterier som gjennomgår fermentering av ikke-stivelsesholdige polysakkarider – fiber forbrukes av verten. Som sådan, de representerer et komplekst samspill mellom colonic celler, menneskelige gut mikroflora og invaderende patogener [19], [20]. Studiet av de resulterende produkter av fermentering som vi har kalt «den fermentome «[17], [18], [21], [22] kan måles i urinen. Den sistnevnte forutsettes mulig på grunn av den endrede tarm permeabilitet som gis i visse tarm sykdommer [23]. Vi tror at VOC representerer en bio-signatur som representerer summen av multifaktorielle påvirkninger (genetikk, miljøfaktorer, inkludert kosthold og sykdomstilstander) som påvirker et individ. Hensikten med denne studien var å teste potensialet i FAIMS -. En roman svært følsom teknologi for å skille mellom CRC og friske kontroller ved hjelp av bare urinprøver
Materialer og metoder
2.1 Fag
Ett hundre og tretti tre personer ble rekruttert prospektivt for denne studien. Åtti-tre av disse pasientene hadde histologisk bekreftet kolorektal kreft og femti var friske individer som hadde en fersk normal koloskopi. Gjennomsnittsalderen av CRC pasientene var 60 år (SD 17 år), 53 (64%) var menn. Demografi av fagene er vist i tabell 1.
2.2 Studiedesign
Dette var en kasus-kontrollstudie hvor pasienter ble rekruttert fra poliklinikker ved Universitetssykehuset Coventry Warwickshire, UK. Urin ble deretter oppsamlet i standard universell STERILIN prøvebeholdere (Newport, UK) og umiddelbart frosset til -80 ° C, for etterfølgende satsanalyse.
2.3 Analyse
Prøvene ble tint ved romtemperatur over natten , porsjonert i hensiktsmessige prøveflasker og analysert ved hjelp av FAIMS eksperimentelle metoder som er beskrevet nedenfor.
2.3.1 FAIMS.
For FAIMS analyse, ble en kommersiell instrument benyttet (Lonestar, Owlstone, Storbritannia, syssels et ATLAS prøvetakingssystem og split flyt boks). Dette systemet oppnår separasjon av kjemiske komponenter på basis av forskjeller i det elektriske felt avhengighet av ioniserte kjemiske mobiliteter. FAIMS tillater gassmolekyler til å bli separert og analysert ved atmosfæretrykk og romtemperatur, i motsetning til lignende tradisjonelle analytiske teknikker. Etter at en prøve er ionisert, er det sammensatt av ioner av forskjellige størrelser og typer. Disse er innført mellom to metallplater og et asymmetrisk høy spenningsbølgeformen blir tilført disse platene, underkaste de ioniserte molekyler til høye elektriske felter. Forskjellen i bevegelse av disse molekylene i dette høy elektrisk felt kan måles, noe som resulterer i en separasjon av den komplekse blanding.
En prøve på 5 ml av urin blir alikvotert inn i et 20 mL hetteglass og plassert inne ATLAS sampler. Prøvetakeren varmer opp prøven til (i vårt tilfelle) 40 ± 0,1 ° C, når prøven har nådd riktig temperatur (typisk 10 min), ren syntetisk luft blir ført over prøven og inn i Lonestar FAIMS instrumentet. Strømningshastigheten over prøven er 500 ml /min og økes til 2 l /min ved ytterligere ren luft før den føres inn i instrumentet. Lonestar er konfigurert til å skanne mellom 0 og 90% dispersjon felt (dispersjonen felt representerer størrelsen av det elektriske felt) i 51 trinn og et kompensasjonsspenning på mellom -6 V og 6 V i 512 trinn. Kompensasjonsspenningen brukes til å fjerne virkningen av avdriften som produseres av den høye elektriske felt, og dermed bare molekyler som har en spesifikk mobilitet utgang platene på det tidspunktet. Figur 1 viser en typisk FAIMS «sky» produsert fra en CRC pasientens urinprøve plottet på en log skala.
Intensity er i vilkårlige enheter av ion teller.
2,3.2 GC -MS.
for GC-MS-analyse, separate alikvoter av 5 ml ble tatt fra hver prøve for å kjøre gjennom et Bruker smart SQ GC-MS-instrument. Hver prøve ble omrørt og oppvarmet til 60 ° C i 5 minutter før innholdet i dens topprommet ekstraheres ved hjelp av et kombi PAL Itex automatisert pre-konsentrator system. De flyktige stoffer som inneholdes i Itex ble deretter frigitt ved oppvarming til 250 ° C, og injisert inn i instrumentet ved et delingsforhold på 1:20 med heliumbærergass. Den Restek RXi-624Sil-kolonne (20 m lengde, 0,18 mm ID, 1,0 um df) montert på GC ble holdt ved en konstant 50 ° C i 1 minutt før den ble økt opp til 280 ° C ved en hastighet på 20 ° C /min, å skille ut de konstituerende VOC i form av molekylvekt og polaritet. Etter en innledende deteksjon for å fremstille et kromatogram, blir VOC-molekylene fragmentert av massespektrometer og detekteres for å produsere tilsvarende massespektra. Disse er korrelert med GC kromatogrammet toppene, og sjekket mot en National Institute of Standards and Technology bibliotek (NIST 2013) av kjemiske forbindelser. Dette ble perfrimed for å få ytterligere innsikt i de spesifikke kjemiske grupper som utgjør den flyktige frivolumet av urinprøver i de med CRC.
2,4 statistiske metoder
Dataanalyse for FAIMS resultater er utføres ved hjelp av Fisher diskriminant analyse. Dette gjør det mulig for den enkle tolkning av komplekse data for å fastslå om kan påvises forskjeller i grupper. Dataene ble behandlet i Matlab (Mathworks Inc., USA, R2013b). For analysen ble både de positive og negative ion teller matrikser av hver prøve sammensatt til ett enkelt element 52224 vektor (eller 1D array). Disse ble så transformert ved hjelp av en wavelet Daubechies D4 bølge, en teknikk som vanligvis brukes i datakomprimering og har evnen til å separere ut små signaler innenfor et datasett. Datapunkter innenfor 52.224 elementer som er egnet for diskriminering blir så identifisert. Dette oppnås ved å beregne innen klassen scatter (Σσ
i) og mellom klasse scatter [(σ
μ)
2 /(Σσ
i)
2] for hvert punkt innenfor vektoren (således de samme datapunkter (eller variabel) fra alle prøvedatasettene blir undersøkt og det innenfor klassen, så vel som mellom klasse sprednings beregnet på tvers av alle prøvene), for å generere ytterligere to 1D matriser, igjen dannet av 52.224 datapunkter. Ulike terskler blir deretter satt til innen klassen og mellom klasse scatter og variablene som er innenfor disse tersklene blir så brukt for databehandling av fisher diskriminant analyse (FDA, en pre-klassifisert lineær teknikk). For å teste gyldigheten av FDA, ble fem prøver fra hver gruppe (CRC og kontroller) fjernes før FDA ble utført. Deretter, basert på FDA resultatene som er blitt igjen, er en forutsigelse gjort på gruppen av de ukjente prøvene. Denne forutsigelse er basert på en KNN (k-nærmeste nabo) -metoden. Denne prosessen blir gjentatt ti ganger for hvert par terskelverdier inntil optimale terskelverdier, og således sett med variable, blir identifisert. Dette variabelgruppe blir så brukt for resten av analysefremgangsmåten for å beregne sensitivitet og spesifisitet. For ytterligere informasjon om analysene er beskrevet i detalj, se Covington et al [23]
2,5 Etikk
Vitenskapelig og etisk godkjenning er innhentet fra lokale Research Utviklingsavdelingen og Warwickshire etikkomiteen 09 /H1211 /38. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som deltok i studien.
Resultater
De demografiske data av kreft og ikke-kreft gruppe er beskrevet i Tabell 1. Ingen statistisk signifikant forskjell mellom gruppene ble bemerket imidlertid som forventet var det mannlige kjønn overvekt. Detaljer om svulst staging for de 83 CRC-pasienter er vist i tabell 2.
Analysen av FAIMS data for CRC pasienter og kontroller ble gjennomført ved hjelp Fisher diskriminant analyse, som beskrevet ovenfor, og resultatene fra de identifiserte variable er vist i figur 2. Reklassifisering for CRC var riktig i 74% av tilfellene (p 0,001). Sensitiviteten og spesifisiteten for FAIMS analyse for å detektere CRC var henholdsvis 88% og 60%.
CRC pasienters urin ble også analysert ved GC-MS, og resultatene finnes i tabell 3, sammen med en liste over tilsvarende kjemikalier fra National Institute of Standards and Technology (NIST) database. Ingen unike kjemiske ble identifisert i de med CRC sammenlignet med kontroller.
Diskusjoner
Denne studien er den første til vår kunnskap til å rapportere verktøyet FAIMS analyser for CRC deteksjon i urin og støtter tidligere arbeid med andre ved hjelp av elektronisk nese [5] og GCMS [16]. Dette er oppnådd ved å undersøke hvordan gasser og damper (VOC) som kommer fra urinprøver er vesensforskjellig i de med CRC sammenlignet med kontroller. Våre funn støtter også tidligere arbeid der, VOC signatur forskjeller ble bemerket i CRC pasienter innenfor ulike biologiske materialer (avføring, pust og urin) [5], [15], [16]. Vår CRC kohorten hadde en mannlig sex overvekt, som ville være forventet for en befolkning på CRC pasienter, mens vår kontrollgruppen hadde en liten kvinnelig overvekt. Dette kan øke utsiktene til sex skjevhet i årsklasse, men mens mønster av VOC og av foreningen, den fermentome, kan i teorien bli påvirket av kjønn og alder, data fra våre tidligere publiserte studier av IBD, gallesyre malabsorpsjon, bekkenkreft og cøliaki har ikke vist noen tilbøyelighet for alder og kjønn påvirker VOC signaler [23], [24], [25], [26], [27].
de Meij et al viste at e -nose kunne diskriminere CRC fra friske kontroller med 85% sensitivitet og 87% spesifisitet, og kan også skille avanserte adenomer fra friske kontroller med 62% sensitivitet og 86% spesifisitet [5]. Vår studie har vist ved hjelp av urinprøver i stedet for avføring – med FAIMS viser en sensitivitet på 88% og en spesifisitet på 60%. Dette har betydning spesielt i vår lokale befolkningen der opptaket av screening er dårlig på grunn av kravet om å produsere avføringsprøver
Ion mobilitet har en rekke fordeler fremfor både GCMS og e-nese. For eksempel er det å gjennomføre en fysisk måling av molekyler i stedet for en kjemisk interaksjon (som ville en tradisjonell e-nese) og for det andre, er følsomheten mye høyere dvs. deler per milliard i deler per trillion. Dette gjør det en ideell plattform for en fremtidig screening verktøy særlig ettersom følsomheten er høy. Våre funn ekspandere på tidligere undersøkelser som beskriver hvordan både e-nese og FAIMS teknologier kan brukes for å skille effekter av stråling i bekken kreft [25] og inflammatoriske tilstander, f.eks mellom Crohns sykdom og ulcerøs kolitt [26], i tillegg til Gallesyre malabsorpsjon og Cøliaki [23], [27].
Genetiske avførings markører har mottatt interesse som en potensiell ikke-invasiv screening mål for CRC. Lidgard et al [28] utførte en studie av automatiserte krakk DNA-analyse for β-aktin, mutante
Kras
, abnormt metylert
BMP3 Hotell og
NDRG4
, og fekal hemoglobin. Dette viste en sensitivitet på 98% og 90% spesifisitet for CRC og 57-83% sensitivitet for avanserte adenom avhengig av størrelse. Vår studie viser sammenlign følsomhet resultater, men til en mye lavere prosesskostnadene, og med urin i stedet for fekal prøvetaking.
Den unike kjemiske fingeravtrykk eller «bio-odorant fingeravtrykk «produsert av ulike sykdomstilstander, og friske individer viser potensialet i denne teknologien for å screene for, og hjelpe til, i diagnostisering av CRC. Det har også potensiale til å hjelpe til med ytterligere undersøkelser av individer med andre gastrointestinale sykdommer. Gasser og damper er tenkt å bli produsert ved hjelp av fremgangs colonic gjæring som involverer et komplekst samspill mellom colonocyte celler, humane avførings flora, mucosal integritet og invaderende patogener [17], [18]. VOC slippes ut fra kroppsvæsker og dermed har stort potensial som mulige biomarkører for bruk i vurderingen av gastrointestinale sykdommer. Endringer i mønsteret av flyktige organiske forbindelser er tenkt å reflektere endringer i den gastrointestinale miljø. Dette tyder på en mulig rolle for tarmen mikrofloraen dysbiosis i patofysiologien av CRC [29].
Konklusjoner
Denne studien har vist at VOC signaturen til stede i urinen hos pasienter med CRC, kan være skilles fra friske kontroller ved hjelp FAIMS. Sensitiviteten og spesifisiteten av FAIMS er henholdsvis 88% og 60% for CRC. Mens dette er lavere enn gullstandarden for koloskopi det er sammenlignbare med dagens fekal avføring testing inkludert guaiac og immunhistokjemiske metoder. Den britiske opptak for screening er lav; 62%, 57% og 59% opptak i første, andre og tredje runder av det nasjonale screeningprogrammet [30], og rundt 50% for tiden i den lokale befolkningen. En av grunnene for dette er arten av den biologiske prøve som kreves. Tilbyr en alternativ og mindre inngripende alternativ, for eksempel urin snarere enn avføring, vil trolig være langt mer akseptabelt for pasienter, og kan bli innlemmet i screening trasé for fremtiden.
Takk
takker WPH, BRET og Eveson Trust som gitt midler til denne forskningen.
