Abstract
Godkjente legemidler målrette ca 400 forskjellige virkningsmekanismer, hvorav så få som 60 i dag brukes som anti- kreft terapi. Gitt at i gjennomsnitt det tar 10-15 år før en ny kreft terapeutisk for å bli godkjent, og den nylige suksessen til narkotika gjenbruk for agenter som thalidomid, vi hypotese at effektive, trygge kreft behandlinger kan finnes ved å teste godkjente legemidler i ny terapeutisk innstillinger. Her kan vi rapportere
in vivo
testing av et bredt sammensatt samling i kreft xenograft modeller. Ved hjelp av 182 forbindelser som er rettet mot 125 unike mål mekanismer, identifiserte vi 3 medikamenter som vises reproduserbar aktivitet i kombinasjon med kjemoterapeutiske temozolomid. Kandidat narkotika synes effektiv ved doseekvivalenter som overstiger dagens reseptbelagte nivåer, noe som tyder på at ytterligere prekliniske innsats vil være nødvendig før disse stoffene kan testes for effekt i kliniske studier. Totalt foreslår vi narkotika gjenbruk er en relativt ressurskrevende metode som kan identifisere godkjente legemidler med en smal margin av anti-kreft aktivitet
Citation. Roix JJ, Harrison SD, Rainbolt EA, Meshaw KR, McMurry AS, Cheung P, et al. (2014) Systematisk gjenbruk Screening i xenograft modeller, Identifiserer godkjente legemidler med Novel Anti-Cancer aktivitet. PLoS ONE 9 (8): e101708. doi: 10,1371 /journal.pone.0101708
Redaktør: Felipe Prosper, Clinica Universidad de Navarra, Spania
mottatt: 19 november 2013; Godkjent: 10 juni 2014; Publisert: 05.08.2014
Copyright: © 2014 Roix et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Alle studier ble sponset og finansiert av BioMed dalen Funn, Inc. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. JJR, PS og SS er ansatte i BioMed dalen funn, Incorporated, som søker å oppdage og kommersielt utvikle nye behandlingsformer og diagnostikk for sykdommen. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Til tross for enorm forskningsinnsats, en av fire amerikanere vil dø som følge av kreft. Kampen for å identifisere nye behandlinger for kreft har ansporet mange, brede innovasjoner i biomedisinsk forskning, og kreftomsorg er i forkant av molekylær medisin, hvor skreddersydd diagnostikk og legemidler brukes til nettopp målrette genetiske grunnlaget for kreft [1]. Likevel eksisterer uenighet om hvorvidt arbeidet og kostnadene for kreftforskning og omsorg har virkelig resultert i tilstrekkelig samfunns fordeler; det er uklart når og hvordan en seier i krigen mot kreft kan bli erklært [2] – [4].
Det har vært antydet at nye behandlingsformer for mange sykdommer, inkludert kreft kan finnes ved å utnytte medisiner som er allerede godkjent for bruk. [5] Flere presedens for sammensatte «repurposing» eksisterer, og det er ventet at den mangfoldige farmakologi målrettet av godkjente medisiner kan ha ukjente, uventet verktøyet ved sykdommer utover etiketten indikasjoner som disse stoffene er for tiden foreskrevet. Som mange godkjente legemidler har en veletablert historie trygg dosering i brede befolkningsgrupper, roman Reorganisering indikasjoner kan trolig bli raskt testet direkte i mennesker, uten behov for omfattende foreløpige sikkerhetsvurderinger.
Gitt denne potensiell verdi, vi testet en bred samling av godkjente medisiner dosert i kombinasjon med kjemoterapi i mus xenograft kreftmodeller. Mens vår upartisk screening og validering strategi identifisert godkjente legemidler med kombinasjonskjemoterapi potensial, ville ytterligere mekanistiske og regulatoriske studier trolig være nødvendig før disse legemidlene kan bli vurdert i kliniske studier.
Materialer og metoder
Animal xenograft studier
9 uker gammel kvinnelig atymiske nakne mus (CRL: NU (NCR), –
Foxn1nu
, Charles River) opprettholdes på standard lys syklus og matet
ad libitum
vann og NIH 31 diett ble brukt til studier. Tumorxenotransplantater ble initiert ved implantering av 1 mm
3 tumorfragmenter fra kilde xenograft vev vedlikeholdes av serie transplantasjon. Tumorveksten ble overvåket som den gjennomsnittlige størrelse nærmet målområdet fra 80 til 120 mm
3, og dyrene ble deretter senere randomisert til behandling kullene. Svulster ble målt i to dimensjoner ved hjelp calipers, og volumet ble beregnet ved hjelp av standard formler.
Temozolomide ble gitt oralt, én gang daglig de første fem dagene av studien. Kombinasjonsbehandlinger ble administrert en gang daglig ved bruk av den angitte ruten og formulering; . Eksperimentelle narkotika ble dosert både under og etter temozolomid administrasjonen å identifisere allergiske reaksjoner fra både samtidige og oppfølgings eksponering
Alt husdyrhold, behandlinger og veterinær omsorg ble utført av utdannet personale i AAALAC-akkrediterte fasiliteter; protokoller og studere oppførsel var underlagt IACUC gjennomgang og godkjenning ved Charles River.
statistiske metoder, Screening Strøm Estimater
For å fange tidskursdata for xenograft studier, vi ansatt log-rank Mantel -Cox overlevelsesanalyse, hvor overlevelse cutoff ble definert av fremveksten av en bestemt tumorbyrde på studien. Etter analyser av pilotstudier, fant vi ut at en 500 mm
3 tumorvolumet cutoff tilstrekkelig fanget den terapeutiske effekten av økt temozolomid dose. Log-rank chi-kvadrat ble brukt til å beregne og rapportere betydning testing; effektstørrelser er angitt som Mantel-Haenzel fare forhold, hvor en beskyttende andelen gjenspeiler evnen til den eksperimentelle behandling for å forsinke eller forhindre tumorprogresjon over 500 mm
3. Som omtalt i resultatene, velger cut-offs større enn denne terskelen ikke markert påvirke resultatene. 1000 mm
3 var noe mer variabel, med systema påvirker effekter på statistisk presisjon innenfor og på tvers grupper; Veksten på 500 mm
3 først på mer homogen.
For screening, typisk 10 dyr ble tildelt for å motta 5 mg /kg temozolomid monoterapi, mens de hyppigst 5 dyr ble plassert i kombinasjonsbehandling. Strøm beregninger indikerte dette studiedesign var tilstrekkelig til å skjelne en 2,6 ganger reduksjon i overlevelsen fare-rate med 80% effekt på et signifikansnivå på 0,05 (avledet ved hjelp av formler som finnes i: https://www.cct.cuhk.edu. hk /stat /overlevelse /Rubinstein1981.htm). Som omtalt nedenfor, den praktiske virkningen av å avdekke effektstørrelser av denne størrelsesorden ga observasjoner hvor den eksperimentelle kombinasjonen tilgjengelig tilsatt effekt tilsvarende en 2-ganger økning i dosen av temozolomid. I et annet lys, ville vår slått tilnærming gir vanligvis følgende: mens alle 10 dyr behandlet med temozolomid monoterapi nådd tumorbelastninger utover 500 mm
3 innen 15 dager, betydelige skjerm treff kunne identifiseres når det ikke mer enn 1 av 5 dyr kombinasjonen kohorten hadde en svulst byrde mer enn 500 mm
3 etter 30 dager med behandling og oppfølging.
gjenbruk Bibliotek
en kandidat liste over godkjente legemidler ble samlet fra DrugBank [ ,,,0],6], rettet mot de Therapeutic Database [7], og Merck Manual of diagnose og terapi. Etter vurdering av kostnader og tilgjengelighet, ble gram skala sammensatte aksjer klargjort fra flere leverandører. Dose formuleringer og ruter som passer for kronisk dosering ble identifisert ved litteratursøk. Narkotika mål og mekanismer ble spørres mot den nyeste utgaven av den terapeutiske mål Database. To-date, kategoriserer TTD 364 mål som «vellykket», etter å ha blitt angrepet av godkjente legemidler. Vår eksperimentelle settet ble kartlagt til 124 vellykkede mål, eller ca 35% dekning. Vår dekning anslaget er konservativt, som vi ignorerte en-til-mange-relasjoner for legemidler som er tilordnet flere mål; flere mål av noe narkotika var ikke dobbel-telles dersom minst én av en stoffets flere mål ble redundant målrettet av et annet legemiddel.
Temozolomide /Candesartan PK interaksjonsstudie
Radio-isotop-merket temozolomid ( 4-methyl-
14C-5-okso-2,3,4,6,8-pentazabicyclo [4.3.0] nona-2,7,9a-triene- 9-karboksamid) ble syntetisert (Moravek) slik at scintillasjonstelling kunne vurdere følgende: intakt forbindelse; aktive metabolitter; samt kovalente broer er kjent for å være dannet etter reaktive metabolismen av temozolomid i målvev [8]
Doseinteraksjonseksperimenter ble utført på hunn nakne mus som bærer U87MG tumor xenografter fragment, som beskrevet ovenfor.; Dyrene hadde svulst byrden av ~400 mm
3 på tidspunktet for dosering. Mus ble administrert enten bærer eller candesartan i.p. for en dag før kombinasjon dosering med C14-temozolomid. På den neste dag, ble en /kg dose av C14-temozolomid 5 mg administrert oralt, enten alene eller umiddelbart etter en dose på 10 mg /kg ved i.p. candesartan administrasjon.
På tidspunktene angitt, vev ble samlet inn og vurdert for radioaktive isotopen distribusjon av standard scintillography metoder.
Kombinasjons Toleranse Study
8-10 uker gamle, friske mannlige C57BL /6J mus ble administrert enten temozolomid alene ved 25 mg /kg, eller sammen med kombinasjonsmidler ved de angitte ruter og doseringsnivåer. Etter seks dager med kombinasjon dosering ble temozolomid behandling skal avsluttes, mens kombinasjonen agenter ble administrert for en annen 4 dager. Dyrene ble avlivet på angitte tidspunkter, og blodprøver ble analysert for fullstendig blodtelling parametere ved hjelp av standard hematologiske metoder.
Dose Range Response Study Bakgrunnsinformasjon
preparatomtalen etiketter ble brukt til å lede dose utvalg for doseområdet responsstudier
for risedronate (merkenavn: Actonel [9])., ikke-kliniske 80-ukers carcionogenicity utført studier hos mus ved 32 mg /kg /dag. Ved hjelp av kroppsoverflate normalisering, anslår etiketten dette er dosen tilsvarer 6,5 ganger maksimal anbefalt daglig dose hos mennesker (30 mg /dag), som er indisert for bruk i Paget sykdom. Derfor screening og topp doseavstandsmåling nivå i våre muse eksperimenter av 7,5 mg /kg /dag er bare litt over maksimal anbefalt human daglig dose (MHRD), basert på kroppsoverflate normalisering. Den laveste mus dose testet, 1,5 mg /kg /dag, er i stor grad tilsvarer den nedre human daglig dose (5 mg /dag) som er anbefalt i osteoporose terapi
For kandesartan (merkenavn:. Atacand [10 ]), kliniske 104 karsinogenitetsstudier i mus ble utført ved 100 mg /kg /dag. Den Atacand etiketten anslår at denne dosen fremkalte systemisk eksponering hos mus (på en AUC-basis) som var omtrent 7 ganger de oppnådd hos mennesker etter administrasjon av MHRD, 32 mg /dag. Derfor er sikt- og toppdoseavstandsmåling nivå i våre eksperimenter mus av 10 mg /kg /dag var sannsynligvis over MHRD, på en AUC-normalisert eksponering basis, spesielt gitt vår initialt ved i.p., i stedet for p.o. rute. Muse eksperimenter på 2,5 mg /kg /dag p.o. bør være i stor grad gjenspeiler den lave inngangs dose indisert for bruk hos hypertensive voksne (8 mg /dag)
For terbinafin. (merkenavn: Lamisil [11]), 28 måneders rotte karsinogenitetsstudier ble utført ved 69 mg /kg /dag; denne dosen er oppgitt å være 2 ganger MHRD, basert på AUC-eksponering sammenligninger. Våre screening og dose-serie studier på mus brukes i.p. administrering, noe som tyder på 50 mg /kg /dag dose på denne måte er sannsynligvis godt over MHRD tilsvarende, gitt at stoffet viser beskjedne biotilgjengelighet på tvers av arter [12], [13]. Til støtte for dette, ble 50 mg /kg orale doser på mus tidligere vist å lokke fram peak systemiske konsentrasjoner i størrelsesorden 1 ug /ml [14], noe som tilsvarer Cmax observert hos mennesker etter en dose på 250 mg. Vi gjorde ikke forfølge en oral dose-avstandsmåling studie i våre musemodeller, gitt de fattige responser observert følgende dosetitrering ved i.p. ruten.
Resultater
Vi har konstruert en iscenesatt eksperimentell testing strategi for å skjerme, bekrefte og validere godkjente legemidler som kan ha potensial aktivitet som kombinasjonen kjemoterapi (figur 1A). Først forsøkte vi en forholdsvis hurtig primære effekt skjermen ved hjelp av lav dyrenummer (typisk 10 kontroll og 5 forsøksdyr pr kombinasjon), testing av hver forbindelse ved en enkeltdosenivå. Lovende treff fra den primære skjermen ble gjen testet i samme modell for å vurdere reproduserbarhet. Reproduserbare treff ble neste testet i to ekstra xenograft modeller for å teste om funnene var generaliseres. Flere forbindelser ble testet i doseresponsstudier, samt ytterligere pilotstudier som tar sikte på å karakterisere mulig mekanistiske aktivitet bak hvert treff. Til syvende og sist ble vår testskjemaet (figur 1A) er utformet for å identifisere forbindelser som viste reproduserbar, robust farmakologi verdig rask oversettelse til kliniske settinger.
A. Eksperimentell testing trakt. Godkjente legemidler ble identifisert og re-bekreftet i en screening modell. Hits ble testet videre komplementære modeller, og karakterisert i pilot farmakologiske studier. B. U87-MG Screening Model Design og karakterisering. I doseområdet undersøkelsesforsøk, et dosenivå på 5 mg /kg av temozolomid ble valgt som den delvis effektive dose som ble anvendt i etterfølgende kombinasjonsstudier. C. Primær bildeoversikten. Fare prosenter av godkjente legemidler i overlevelsesanalyse (500 mm
3 tumorbyrde cutoff) er plottet av rang. Tosidige tillit estimatene er vist, med betydelige treff (N = 12, tabell 1) markert med rødt. D. hit rate analyse. Eksperimentelt observerte overlevelsesanalyse effektstørrelser (q) er plottet mot khikvadratfordeling; den Kolmogorov-Smirnov statistikken bekrefter null, at hver stamme fra samme underliggende fordelingen.
Vi har etablert et modellsystem og sammensatte samling for å kartlegge et bredt spekter av farmakologi i en klinisk relevant setting. Vi fokuserte på glioblastom som en sykdom innstilling med høy udekket klinisk behov. Vår primære skjerm ble utført på U87-MG glioblastom-avledede humane kreftcellelinje; xenografter av denne linjen ble utviklet ved hjelp av svulst fragmentserie passasje metoder. Vi bekreftet denne modellen var lydhør overfor en standard-of-care kjemoterapeutiske for glioblastom; det alkylerende stoff temozolomid fremkalte komptumorrespons i et flertall dyr ved en dose på 100 mg /kg. Basert på tidligere farmakologiske studier ser vi at U87-MG-modellen synes relativt behandlings ildfast: eksponeringer oppnådd nær komplett respons dose (AUC
0-inf ~125 ug * t /ml, data ikke vist) sannsynligvis overskredet de som oppnås hos mennesker når du følger vanlige doseringsveiledning (AUC
0-inf ~ 20 ug * time /ml).
Vi satt sammen en mangfoldig sammensatt samling for å teste flertallet av farmakologiske mekanismer målrettet av tiden godkjente legemidler. De ca 1200 foreskrevne legemidler målrette sannsynlig ikke mer enn 300 unike farmakologiske mekanismer [15], [16] -Vi regner med vår valgte biblioteket av 182 forbindelser rekapitulerer ca 35% prosent av farmakologi målrettet av den menneskelige Pharmacopeia (metoder). På et praktisk grunnlag, vi er avhengige av publisert litteratur for å hjelpe valgte dosenivåer og narkotika formuleringer. Avgjørende, ble doseringen og administrasjonsveier velges for å få legemiddeleksponering nær eller utover det som oppnås ved bruk av doser som er maksimalt tolerert hos mennesker (tabell S1 i File S1). Kort sagt, vi fulgte en «grådig» strategi som først undersøkt supra farmakologiske effekter i screening-modus, etterfulgt av hit validering ved eksponeringer nærmere situasjonen i hverdagen klinisk bruk.
Flere bemerkelsesverdige funn kunne observeres under vårt primære effekten skjermen på 182 forbindelsen satt i U87-MG-modellen (figur 1C, Tabell S1 i File S1). Først ved hjelp av eksperimentelle metoder som var teknisk mulig og rimelig ressurseffektive, kunne vi observere at temozolomid og godkjente legemidler viste kombinasjonen effekt i løpet av relativt høy gjennomstrømming screening. Tolv primære treff ble identifisert som forsinket den tiden som trengs for å oppnå håndgripelig tumorbyrde i behandlede dyr (tabell 1). Disse treff utstilt effekt i kombinasjon med temozolomid bredt sammenlignes med hva som kan oppnås ved å doble den terapeutiske dosen av temozolomid (figur 1C, Methods). Resultatene var reproduserbar: i 10 av 11 eksperimenter, en meget aktiv dose av temozolomid (100 mg /kg) var svært signifikant forskjellig fra den moderat dose (5 mg /kg) som brukes i kombinasjon tester, og viste moderat statistisk diskriminering i den gjenværende studien (data ikke vist). Oppmuntrende, de kjente kjemoterapeutika docetaxel og etoposid viste effekt i kombinasjon med temozolomid (tabell 1). Også, den totale primær hit rate (6,6%) ikke vises for høy, noe som kan tyde på uegnede effekter på grunn av eksperimentell variabilitet. På samme tid, den slaghastighet først tilstrekkelig forskjellig fra null, noe som tyder på vår tilnærming kunne diskriminere treff samtidig ikke være for begrensende. Samlet sett bekrefter vårt primære fornyer skjermen en rimelig forutsigbar forventning: aggregert, ikke godkjente medisiner ikke framprovosere anti-kreft effekt, mens en beskjeden samling av narkotika kan utvise nyttig farmakologi i kombinasjon med standard kjemoterapi (figur 1D)
Vi utførte bekreftelse studier for 33 medikamenter fra den primære skjermen som ikke var kjent kjemoterapeutika (figur S1). Åtte av elleve (73%) kandidater som viste statistisk signifikans i den primære skjermen ble bekreftet i en andre test. Vi har også spurt 22 flere legemidler som ikke viser betydning i utgangspunktet. Som forventet, færre (3 av 22; 14%) av disse agentene viste effekt hos den sekundære skjermen hvis de var negative i den primære skjermen, noe som tyder på en annen grad av validering for vår eksperimentell tilnærming. Som et ytterligere bekreftende trinn dosert vi åtte av de primære treff i fravær av temozolomid (figur S1). Som kan forventes, ingen av disse trygge legemidler viste primære anti-kreft effekt, igjen tyder på at vår skjerm avslørte nye legemidler med potensielle anti-tumor effekt bare i bakgrunnen av standard kjemoterapi.
Vi ytterligere validert 15 bekreftet treff i ytterligere to xenograft modeller: A375 melanom og SF295 glioblastom humane kreft linjer (Supplemental Metoder, figur 2). Seks stoffer viste aktivitet i en av de ortogonale modellene når det doseres i kombinasjon med temozolomid. Oppsummert synes vår screening strategi for å ha oppdaget flere stoffer som utviser
bona fide
aktivitet med alkyleringsmidlet temozolomid tvers av flere krefttyper.
A. Hit validering i flere modeller. Valgte primære skjerm treff ble testet i kombinasjon med sub-effektive doser av temozolomid i en modell av glioblastom og melanom xenograft modeller. For å vurdere farmakologiske effekter terbinafin ble dosert p.o. i A375-modellen med en dose intervall fem ganger større enn sin screening dose administreres ved i.p. rute. I primærskjerm sammenligninger, risedronate var betydelig ved overlevelsesanalyse ved en cut-off på 1000 mm
3, men ikke 500 mm
3. B. Hypertensjon medikamentkombinasjoner. Legemidler ble dosert i kombinasjon i det U87-MG-modellen, i en dose i primærskjermen, eller som angitt i supplerende materialer. Virkninger på tumorvekst ble evaluert på dag 20 av studien. Betyr pluss SEM vist (N = 10); kandesartan og temozolomid 100 mg /kg signifikant av M-ANOVA på p. 0,05
Leveres med en viss grad av tillit, forsøkte vi å ytterligere karakterisere våre resulterende treff. På grunn av dets objektiv, empiriske natur, bør vår skjerm avsløre anti-kreft-effekter forårsaket av et mangfold av faktorer. Først kombinasjonspreparater kan modulere egenaktivitet av temozolomid, ved å påvirke enten sin primære effekt av DNA alkalation, eller ved å modifisere påfølgende DNA skade responser inkludert cellesyklus og apoptose. Likeledes temozolomid og induserte DNA alkylering kan, i en neomorphic mote, konvertere signale indusert av en kombinasjon narkotika inn i nye cellevekst eller celleoverlevelsessignaler. Videre enhver og alle disse scenariene kan være et resultat av enten cellestyrte eller ikke-cellestyrte prosesser: de to agentene kan i fellesskap målrette en isolert kreftcelle, eller indusere autokrint eller parakrint signale til slutt føre til redusert tumorvekst og overlevelse. Vi utforsket noen mulige mekanismer for effekt for en legemiddelkandidat av interesse, angiotensin-II-reseptorblokker kandesartan.
Først må vi vurdert om samtidig kandesartan dosering bare endret den primære farmakokinetikk temozolomid [17], [18 ]. Vi fant candesartan ikke vesentlig endre biodistribusjon av temozolomid over flere vev, noe som tyder på dette gjenbruk kandidaten ikke formidle dens virkninger bare gjennom stoffet stoffskifte interaksjoner (Tabell S2 i File S1). I tillegg testet vi hvorvidt kandesartan direkte økt cellulær toksisitet av temozolomid i dyrkede U87MG celler. Et fast-ratio (1-til-2.4) Kombinasjonen ble ansatt, som starter på suprapharmacologic konsentrasjoner av 40 uM temozolomid og 16,7 uM kandesartan hhv. Across disse konsentrasjonene, bemerket vi begrenset
in vitro
styrken på kombinasjon kandesartan og temozolomid (figur S2), og derfor har vi vendt tilbake til
in-vivo
modeller for å utforske naturen av denne farmakologiske interaksjon.
Deretter vurderes vi hvordan andre legemidler med lignende farmakologiske mekanismer vil prestere i den primære U87MG screening modell. Interessant, fant vi at flere angiotensin II-reseptor hemmer narkotika ( «-artans») var også effektive i kombinasjon med temozolomid (figur 2b). Videre flere stoffer som renin hemmer aliskerin, samt kalsiumkanalblokkere (amlodipin) og ACE-hemmere (enalapril) dukket også marginalt effektive. Disse funnene tyder på flere interessante konklusjoner: 1.) våre primære skjerm resultater kan bekreftes med legemidler som virker via liknende virkningsmekanismer 2.) en ukjent pharmacophore målrettet av flere angiotensin-II-reseptor hemmer stillasene kan ha anti-kreft farmakologi 3.)
in vivo
skjermer kan avsløre kompleks biologisk aktivitet i veier som kan bli hemmet av ulike rusmidler.
til slutt, vurderte vi om kombinasjonen av kandesartan /temozolomid forårsaket toksisitet spesielt i kreftvevet, eller mer generelt endret farmakologisk margin på temozolomid. Vi har observert at ved høye doser, redusert kandesartan kombinasjon lymfocytt og røde blodceller; disse er to dosebegrensende bivirkninger som påvirker den godkjente bruken av temozolomid i mennesker (tabell S3 i File S1). I tillegg har vi registrert at høydose kandesartan forverret vekttap og andre nedskrevne konstitusjonelle tegn på helse hos mus ved dosering i kombinasjon (data ikke vist). Disse funnene tyder på to konklusjoner. Først, mens den tilleggseffekt overdratt ved tilsetning av kandesartan kan være ønskelig, kombinasjonen kan også øke bivirkninger, noe som resulterer i en risiko-fordel profilen stort sett uforandret fra temozolomid alene dosering. For det andre, det mekanistiske farmakologi underliggende resultatene er trolig sammensatt: kandesartan kan endre både indre og skilles faktorer som forårsaker redusert levedyktighet i både en celle-autonome, og ikke-celle autonome, mote-dette kan føre til suboptimal kreft målgruppe. Mens utenfor rammen av etterforskningen vi rapporterer her, er det sannsynlig at flere prekliniske studier kan bevise at vår skjerm avslørt nye og attraktive terapeutiske muligheter.
Mens mekanistisk studie av våre screening treff kan være nyttig, det kan også være å foretrekke å validere kandidater direkte gjennom klinisk testing. For å raskt oversette våre funn, forble det nødvendig å demonstrere effekt på legemiddeleksponering nærmere hva som er oppnådd i hverdagen menneskelig bruk. Vi brukte forskrivning etiketter for kandesartan, antifungal terbinafin, og bisfosfonater risedrontate å velge et område med orale doser for å teste U87MG modellen (metoder). I forhold til våre screening innsats på høyeste tolererte doser, effekten av hver av disse stoffene redusert til ubetydelige nivåer som hver ble testet nærmere merke-godkjent doseekvivalenter (figur 3). Grovt, disse resultatene antyder at ekstra sikkerhetsstudier, både alene og muligens i kombinasjon med temozolomid, er nødvendig før disse legemiddelkandidater kan bli testet i humane kreftpasienter.
A. Candesartan doseområde bekreftelse i U87-MG modell. Candesartan ble bekreftet på sitt screening dose og rute; Effekten svekket etter oral administrering nær og under den angitte MTD dose tilsvarende 14,3 mg /kg. B. Risedronate doseområde bekreftelse. Risedronate utstilt beskjedne kombinasjonseffekter når det gis oralt på 7,5 mg /kg, som nær MHRDD dose tilsvarende 5 mg /kg (i forhold til skjermen resultat på 15 mg /kg, i.p.). Eksponeringen trend dose var beskjeden, og dukket opp tilsvarende i doser litt under 5 mg /kg. C. Terbinafin dose rekkevidde bekreftelse. Terbinafin ble testet ved i.p. administrasjon. Effekten avtok etter hvert som legemidlet ble administrert under human dose tilsvarer 4 mg /kg. Gruppe betyr vist; kohort SEM ikke vist for klarhet.
Diskusjoner
Flere viktige konklusjoner er foreslått av vår innsats for å oppdage narkotika repurposing kandidater i kreft. Først, til tross for sin kompleksitet, de
in vivo
studiene vi gjennomførte kan identifisere mange nye legemiddelkandidater ved bred oppdagelse screening over mange titalls, om ikke hundrevis, av forbindelser. Den treff utstillings farmakologi som vises konsekvent og reproduserbar tvers av flere modellsystemer, og kan foreslå struktur-aktivitet og sti forhold som tidligere var ukjent og uventet.
Vårt prinsipp motivasjon i å utføre direkte in-vivo, i motsetning til primær celle kombinasjon screening, var å avdekke narkotikavirksomhet i komplekse, flercellede sammenhenger som er vanskelig å modellere ved hjelp av in-vitro-systemer. Oppmuntrende, ser vi at nylig, har flere grupper i stor grad bekreftet våre funn når det gjelder samspillet mellom angiotensin-hemming og kjemoterapi. Forfatterne foreslår et kompleks modus-of-handling som involverer vaskulogenese i komplekse tumor stroma vev [19]. En pågående klinisk studie (NCT01821729) kan videre bekrefte terapeutiske potensialet av komplekset farmakologi oppdaget i våre skjermer.
Til tross for disse fordelene med in-vivo-skjermer, vi også oppmerksom på flere viktige begrensninger. Viktigst er det antatt at repurposing skjermer identifisere stoffer som raskt kan testes for effekt i kliniske studier. To-date, har vår innsats bare ga kandidater som ville kreve omfattende prekliniske og kliniske sikkerhetsstudier før effekten kunne testes hos pasienter. Selv om dette kan synes å være den sannsynlige konsekvensen av våre «grådige» primære skjermer som testet nær maksimal tolerert dose, merker vi en converse risiko: det virker sannsynlig vår primære skjermen hit rate ville ha redusert til triviell eller nær null nivåer, hadde vi vurdert lavere doser i første omgang.
Tatt i sammenheng, foreslår vi at in vivo gjenbruk skjermer i bakgrunnen av kreftbehandling kan være relativt ressurs ineffektiv. Som bakgrunn, denne studien gjenspeiler arbeidet med flere medarbeidere som har bidratt betydelig innsats over ca 18 måneder. Tatt fra et perspektiv av enten engasjerte midler eller kollektiv innsats, prosjekt forbrukes ressurser i stor grad tilsvarende de som kreves for å gå over en enkelt, roman stoffet fra prekliniske og kliniske sikkerhetsstudier i effektstudier hos kreftpasienter. Vi har oppdaget roman farmakologi med potensiell bruk for kreftbehandling, men også erkjenne at å balansere arbeid og verdien av gjenbruk skjermer mot andre forskningsprioriteringer kan vise seg vanskelig på tvers av bredere kreftforskning samfunnet.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Monoterapi effekt av kandidat treff i U87-MG xenografter. Forbindelsene ble administrert i samme dose og rute anvendes under det primære skjermen. Tumormålinger ble vurdert på dag 16. Gruppe midler vises; Feilen er SEM, N = 8-10
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101708.s001 plakater (PPTX)
Figur S2.
Modest kombinasjonseffekter av temozolomid og kandesartan i U87MG celler in vitro. U87MG-celler ble dyrket i standardbetingelser (DMEM med 10% FBS), og eksponert i 72 timer med forbindelser ved forskjellige konsentrasjoner. Den høyeste konsentrasjonen av temozolomid sysselsatt var 300 um, minst en log over gjennomsnittet terapeutiske konsentrasjoner observert under kliniske administrasjon. Candesartan ble testet ved konsentrasjonsområder så høyt som 16,7 um, igjen godt utover terapeutiske legemiddeleksponering. Forbindelsene ble blandet i en fast doseforhold på 2,4 til 1 (eksempel 40 uM temozolomid til 16,7 uM candesartan). Cisplatin ble anvendt som en kontroll cytotoksisk forbindelse, ved konsentrasjoner som starter på 100 uM. Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av kolorimetriske metoder (MTS analyser). Temozolomide viste mindre levedyktighet effekter i U87MG opp til 300 um in-vitro. Tilsetting av kandesartan opp til 16,7 um ikke potent forsterket behandling med opp til 40 um temozolomid, sammenlignet med cisplatin, som indusert fremtredende hemming av cellelevedyktigheten
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101708.s002 product: ( PPTX)
File S1.
Tabeller S1-S3. Tabell S1. Phenix Cancer Library. Gitt som Excel-fil i online supplerende materiale. Tabell S2. Bekreftelse Studier i U87MG xenograft modell. Mus med U87-MG ble dosert med temozolomid i kombinasjon med agenter oppført. Overlevelsesanalyse ble utført som beskrevet; beregninger er gitt for sammenligning. Tabell S3. Hematopoetiske endringer av candesartan i kombinasjon med temozolomid. C57BLJ6 mus ble dosert med temozolomid, med eller uten kandesartan ved doser og ruter angitt. Blodprøver ble tatt for telling av blodceller hematologi analyse. Uendret parametere er ikke vist; cellepopulasjoner som viser signifikante endringer (kursiv) i flerdosegruppene er vist nedenfor. * P 0,05 med ANOVA, Dunnett post-hoc test. Verdier som vises er gruppe mean (SEM), N = 10.
doi: 10,1371 /journal.pone.0101708.s003 plakater (DOCX)
bekreftelser
Forfatterne takke
